利用脂解酵素進行三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成

利用脂解酵素進行三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成 时间就是金钱,效率就是生命, 利用脂解酵素進行三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成 The synthesis of aromatic fatty acid triglyceride prodrug via lipase 張春生 南台科技大學 生物科技研究所 (NSC 92-2214-E218-002) 摘要 芳香族脂肪酸之苯基丁酯能夠促進好幾種不同之腫瘤型式之細胞停滯及分化，此種藥物療效取決於在體內是否能長期維持在藥物之最低有效濃度，但此類藥物代謝很快，導致無法在血液中達到適當濃度。因此以三酸甘油酯方式進行投藥，經體內吸收後，再利用體內酵素切斷酯鍵將藥物釋放出來，除可延長體內藥物之半生期，且提高體內有效藥物濃度，並減少投藥劑量，增加患者之接受度。 經酵素篩選，利用Candida antarctica 之固定化脂解酵素催化可合成三苯基丁酸甘油酯(glyceryl triphenylbutyrate)前驅藥。比較有機溶劑與無溶劑系統，在無溶劑系統下可得到較高的轉化率，並有利於後段產物分離純化。在開放環境下有利酯化反應之副產物水分移除，且最適反應溫度為65 ?。當甘油與苯基丁酸之莫耳比為1 / 3時，其酯化程度最佳，甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之轉化率可達88 %。若在反應過程中進行抽真空，可更有利水分迅速移除，真空度壓力愈小，所得的三苯基丁酸甘油酯轉化率則愈高，當將真空度降至1 torr時，三苯基丁酸甘油酯轉化率可高達93 %。 關鍵字:脂解酵素、酯化、芳香族脂肪酸、三酸甘油酯、前驅藥 Keywords:lipase、esterification、aromatic fatty acid、triglyceride、prodrug 能之成熟細胞或者觸發不正常細胞之凋亡[2]。值得注1. 前言 芳香族脂肪酸之苯基乙酯(phenylacetate)與苯基意的是苯基丁酯在一些體內評估效果比苯基乙酯好2丁酯(phenylbutyrate)可治療以下幾種疾病: 至10倍[3]。 (一) 尿素循環失調: (三)老化: 健康者能夠將身體代謝蛋白質所產生含氮有毒 組蛋白去乙醯酵素(Histone deacetylase, HDAC) 的物質快速轉換成尿素並排出體外，但對腎臟功能及核小體(nucleosomes)中組蛋白(histone)的乙醯化天生在尿素合成有問題者，將會因含氮有毒代謝物無(acetylation) 及去乙醯化(deacetylation)，在調節基因法代謝而造成疾病產生甚至死亡。苯基乙酯為美國食表現扮演重要角色。組蛋白胺基末端因被乙醯化或去品藥物管理局(FDA)所新核准治療此疾病之有效藥乙醯化，所產生之結構修釋能夠調節轉錄因子及RNA劑，可以與氮形成phenylacetylglutamine然後經由身聚合酶鍵結至DNA進行轉錄之能力。 體排出[1]。但由於苯基乙酯味道刺鼻造成患者使 利用HDACs抑制劑研究改變組蛋白乙醯化程度用意願不高，因此以苯基丁酯作為苯基乙酯之 所導致動物生理學上的改變。最近證實屬於HDAC前驅藥，利用體內代謝之β-oxidation pathway一次移抑制劑的苯基丁酯，不僅能延長果蠅之平均及最長壽除兩個碳而產生苯基乙酯，且因苯基丁酯分子量較命，同時也能保持生理上之活力[4]。 高，所以沒有苯基乙酯的刺鼻味。 (四)血紅素病: (二)腫瘤及癌症: 鐮刀型貧血症(sickel cell anemia)及地中海貧血 芳香族脂肪酸之苯基乙酯與苯基丁酯其療效在症(β-thalassemias)皆屬於血紅素病，初步臨床試驗顯於可以誘導細胞終止分化或引導分化成為具正常功 示可以使病患相對提高紅血球生成素水準，因此在臨唯有惜时才能成功,唯有努力方可成就, 时间就是金钱,效率就是生命, 床研究上，苯基丁酯鈉搭配 –OH可使某些患者提高甘油酯(glyceryl triphenylbutyrate)，及水分。 血紅素之水準[5]。 此種藥物療效取決於在體內是否能長期維持在2.3 HPLC條件 藥物之最低有效濃度，但此類藥物代謝很快。以三酸HPLC分析管柱使用RP-8 column,UV波長為甘油酯方式進行投藥可延長體內藥物之半生期，能提216 nm,內標物為2-Nitrotoluene,流動相A為高體內有效藥物濃度，可減少投藥劑量，且甘油本身acetonitrile:HO ( 0.01% trifluoroacetic acid ) , 65:2 即為生物體代謝之正常產物。文獻中指出三酸甘油酯35 ( v/v ),流動相B為acetonitrile,各分析物之滯留若用化學法合成產率偏低且純化較複雜，而以脂解酵時間如表一所示。 素催化進行合成則可克服化學法的問題[6]，此外酵素 在無溶劑系統下進行催化，不僅可以避免溶劑的毒性3. 結果與討論 問題，且可減少純化的步驟[7]。另外文獻中也指出13.1 酵素篩選 莫耳酸酯化會產生1莫耳的水，為了有利反應進行避選用八種不同菌種來源之酵素，其中Novo 435 免水解產生，可以藉由開放系統或抽真空的方式將水lipase與lipase QLG屬固定化酵素，另外自製lipase 分移除[8]。芳香族脂肪酸如苯基乙酸、苯基丁酸之三CC、MY冷凍乾燥之固定化酵素，在無溶劑反應系統酸甘油酯，由Brusilow於2000年獲得以三芳香族脂中，催化甘油與苯基丁酸進行酯化反應，篩選出最有肪酸甘油酯前驅藥用於治療上述提過疾病之美國專利合成三苯基丁酸甘油酯之脂解酵素。結果如圖一所利[9]，經進一步文獻及專利資料庫調查發現並無相關示，在相同條件下只有Novo 435 lipase可合成出最高此類前驅藥物之製程研究，因此本計畫將利用酵素催含量之三苯基丁酸甘油酯，其餘的脂解酵素都僅能合化酯化反應開發三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成成出單苯基丁酸甘油酯與雙苯基丁酸甘油酯，及極少製程。 量之三苯基丁酸甘油酯，因此在日後酵素的選擇上， 將選用Novo 435 lipase來當做酯化反應之催化劑。 2. 研究方法 2.1 藥品 3.2 反應系統之篩選 Novo 435 lipase (from Candida antarctita)購自丹 探討反應系統對酯化反應平衡之影響，包括不同麥Novozymes，Lipase CC (Type VII ; from Candida 有機溶劑系統篩選及無溶劑系統篩選，對苯基丁酸甘 油酯轉化率之影響，並考慮後段產物分離之可行性。rugosa)購自美國Sigma,Lipase A (from Aspergillus niger)、AK (from Pseudomonas fluorescent )、PS (from 在此選擇三種不同的有機溶劑作為反應之介質，並與Pseudomonas cepacia)皆購自日本Amano 無溶劑狀態下做一比較，結果如表二所示。在有機溶Pharmaceutical，Lipase MY (from Candida rugosa)、劑系統下，經168小時反應時間，苯丁酸有60 ,以OF (from Candida rugosa)、QLG皆購自日本名糖產業上會轉化成單苯基丁酸甘油酯，只有少量轉化成雙苯株式會社。甘油(glycerol)購自美國POCH，苯基丁酸基丁酸甘油酯，其中僅有二氯甲烷(dichloromethane)(4-phenylbutyric acid)購自瑞士Fluka。 能合成出三苯基丁酸甘油酯，但轉化率只有1.91 ,，若在無溶劑系統下，三苯基丁酸甘油酯轉化率可 達4.19 ,。因此將選擇無溶劑系統作為本實驗之適 當反應系統，除可解決極性甘油在非極性溶劑溶解度2.2 反應系統 基質甘油(glycerol)與苯基丁酸(4-phenylbutyric 偏低的限制，且能有利於後段產物分離純化，且無毒acid)先加熱至60 ?使其溶解，之後加入Novo 435性溶劑使用之問題。 之固定化脂解酵素進行酯化反應之催化，產物包含單 苯基丁酸甘油酯(glyceryl monophenylbutyrate)、雙苯3.3 最適反應溫度 基丁酸甘油酯(glyceryl diphenylbutyrate)、三苯基丁酸 反應溫度會關係到酵素活性及穩定性表現，也可唯有惜时才能成功,唯有努力方可成就, 时间就是金钱,效率就是生命, 能與水移除有關聯。在此選擇五種不同的反應溫度，升。若將真空度降至1 torr時，三苯基丁酸甘油酯轉 分別為60 ?、65 ?、70 ?、75 ?與80 ?，在開化率可高達93 %。 放系統下進行酯化反應，結果如圖二所示。當溫度從 60 ?升到65 ?時，三苯基丁酸甘油酯轉化率會隨溫4. 結論 度而提升，但當溫度到達70 ?以上，三苯基丁酸甘 利用脂解酵素催化酯化反應開發三芳香族脂肪 油酯轉化率則快速下降。可能是70 ?的反應溫度會酸甘油酯前驅藥合成，將得到以下幾點結論: 造成酵素失活，其可能原因有一、酯化反應之副產物1. 酵素篩選:選用Novo 435 lipase (from Candida 水在70 ?下使酵素失活,其二則是在較高溫度下，antarctita)來當做酯化反應之催化劑。 由於無溶劑之甘油系統黏度較高，無法使水分快速移2. 反應系統:選擇無溶劑系統作為本實驗之適當反應 除，造成局部水分太高導致逆反應之水解發生，才會系統，且能有利於後段產物分離純化。 造成轉化率無法提升。因此開放系統下反應溫度為65 3. 反應溫度:65 ?時最有利酯化反應的進行。 ?時最有利酯化反應的進行，此時三苯基丁酸甘油酯4. 基質間比例:甘油與苯基丁酸之莫耳比為1 / 3時， 轉化率可達68 ,。 其酯化程度最佳，甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之 轉化率可達88 %。 5. 真空度:真空度壓力愈小，所得的三苯基丁酸甘油3.4 基質間比例 探討甘油與芳香族脂肪酸之莫耳數比對酯化程酯轉化率愈高，當將真空度降至1 torr時，三苯基 度之影響。一個甘油利用酯鍵至少可攜帶三個脂肪丁酸甘油酯轉化率可高達93 %。 酸，若將脂肪酸比例增加，是否可提高三苯基丁酸甘 油酯轉化率。在此將苯基丁酸莫耳數固定，調整甘油5. 參考文獻 莫耳數，甘油與苯基丁酸之間莫耳比分別為1 / 3、1 / [1]Brusilow, S. W., Maestri, N. E., 1996. Urea cycle 4、1 / 5與1 / 6，結果如圖三所示。當甘油與苯基丁disorders: diagnosis, pathophysiology, and therapy. 酸之莫耳比為1 / 3時，其酯化程度最佳，甘油被酯化Adv. Pediatr. 43, 127-170. 成苯基丁酸甘油酯之轉化率可達88 %。若將苯基丁[2]Johnstone, R. W., 2002. Histone-deacetylase 酸的量增加到1 / 4、 1 / 5、1 / 6時，理論上甘油酯inhibitors: novel drug for the treatment of cancer. 化率應會升高，但實際結果甘油酯化率反而下降，其Nature Reviews Drug Discovery. 1, 287-299. 可能原因來自不同醇酸比例改變了溶液之親疏水[3]Pineau, T., Hudgins, W. R., Liu, L., Chen, L. –C., 性，而造成平衡位臵改變，實際原因需進一步探討，Sher, T., Gonzalez, F. J., Samid, D., 1996. 因此在開放系統下，保持甘油與苯基丁酸的莫耳比為Activation of a human peroxisome 1 / 3可得最佳甘油酯化率。 proliferatior-activated receptor by the antitumor agent phenylacetate and its analogs. Biochem. Pharmacol. 52, 659-667. 3.5 真空度 由於酯化反應會伴隨水分生成，將造成水解逆反[4]Kang, H., Benzer, S., Min, K. –T., 2002. Life 應發生而降低酯化的程度，此關係甘油是否可以完全extension in Drosophila by feeding a drug. Proc. 醯化，因此藉由抽真空的方式，看能否將水副產物移Natl. Acad. Sci. 99, 838-843. 除，以提高三苯基丁酸甘油酯轉化率。在此選擇五種[5]Pace, B. S., White G. L., Dover, G. J., Boosalis, M. S., 不同的真空度壓力，分別為常壓狀態760 torr及抽真Faller, D. V., Perrine, S. P., 2002. Short-chain fatty 空壓力為380 torr、150 torr、50 torr、1 torr，結果如acid derivatives induce fetal globin expression and 圖四所示。當真空度壓力愈小，所得的三苯基丁酸甘erythropoiesis in vivo. Blood. 100, 4640-4648. 油酯轉化率則愈高，顯示真空度之提高，可有效移除[6]Anna, M. F., Patrick, A., Bo, M., 1996. Glyceride 多餘的副產物水分，使得三苯基丁酸甘油酯轉化率提synthesis in a solvent-free system. Jaocs. 73, 唯有惜时才能成功,唯有努力方可成就, 时间就是金钱,效率就是生命, 1489-1495. [7]Kim, S. M., Rhee J. S., 1991. Production of compounds RT(min) medium-chain glycerides by immobilized lipase in a 2-Nitrotoluene 9.31 solvent-free system. Jaocs. 68, 499-503. 4-Phenylbutyric acid 6.72 [8]Selmi, B., Ergan, F., Barbotin, J. N., Thomas, D., Glyceryl monophenylbutyrate 5.55 1997. Lipase-catalyzed synthesis of tricaprylin in a Glyceryl diphenylbutyrate 12.16 medium solely composed of substrates. Water Glyceryl triphenylbutyrate 25.52 production and elimination. Enzyme Microb. Technol. 20, 322-325. [9]Brusilow, S W., 2000. Triglycerides and ethyl esters of phenylalkanoic acid and phenylalkenoic acid useful in the treatment of various disorders. US6083984. 表一. 內標物、基質及其酯類產物之滯留時間 表二. 密閉系統下有機溶劑與無溶劑系統之篩選，有機溶劑下甘油1 mM，苯基丁酸3 mM,無溶劑系統下甘油 1 mmole，苯基丁酸3 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，反應溫度45 ?，反應時間168小時。X、 X、 monodi X 、X分別為單苯基丁酸甘油酯、雙苯基丁酸甘油酯、三苯基丁酸甘油酯與總苯基丁酸甘油酯之轉化triT 率。 solvent log P X X X X monoditriT isooactane 4.5 0.7205 0.0039 0.0000 0.7244 cyclohexane 3.2 0.7963 0.0197 0.0000 0.8160 dichloromethane 1.25 0.6554 0.1929 0.0191 0.8675 free* 0.6248 0.2134 0.0419 0.8801 *:free表示無溶劑系統。 附:轉化率計算方式如下 ，，，，C，2C，3C ditrimonoX,X,X,ditrimono，，，，，，，，C，C，C，2，C，3C，C，C，2，C，3C，C，，，，，C，2，C，3SmonoditriSmonoditriSmonoditri X,X，X，XTmonoditri 符號說明:C、C、C、C分別為基質(苯基丁酸)、單苯基丁酸甘油酯、雙苯基丁酸甘油酯、三苯基Smonoditri 丁酸甘油酯之濃度。 唯有惜时才能成功,唯有努力方可成就, 时间就是金钱,效率就是生命, 1.01.0 monophenylbutyrate diphenylbutyratetriphenylbutyrate 0.80.8 tri 0.60.6, Xdi tri , XX 0.4 0.4mono X 綣/荒= 1 / 30.20.2綣/荒= 1 / 4綣/荒= 1 / 5 綣/荒= 1 / 6 0.00.0 020406080100120140160 Novo 435 Time (hr)lipase CC lipase A lipase AK lipase MY 圖一. 選用八種不同菌種來源之酵素，其中Novo 435 圖三. 開放系統下，基質比例對甘油酯化程度之影lipase OFlipase QLGlipase與lipase QLG屬固定化酵素，另外自製lipase 響。甘油分別為5 mmole、3.75 mmole、3 mmole、2.5 lipase PS IME lipase CCCC、MY冷凍乾燥之固定化酵素，在開放的無溶劑反mmole，苯基丁酸15 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，IME lipase MY 應系統中進行酯化反應。甘油1 mmole，苯基丁酸3 常壓，反應溫度為65 ?。轉化率以甘油酯化程度來mmole，酵素量 0.05 g，反應溫度為60 ?，常壓，計算。 反應時間為144小時。 1.01.060 65 70 75 0.80.880 0.60.6 tritriXX 0.40.4 760 torr 380 torr 0.2 0.2150 torr 50 torr 1 torr 0.00.0 020406080100120140160020406080100120140160 Time (hr)Time (hr) 圖二. 開放系統下，反應溫度對三苯基丁酸甘油酯轉圖四. 真空系統下，真空度對三苯基丁酸甘油酯轉化化率之影響。甘油5 mmole，苯基丁酸15 mmole，Novo 率之影響。甘油5 mmole，苯基丁酸15 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，常壓，反應溫度分別為60 ?、65 435 lipase 0.3 g，反應溫度為65 ?，真空度分別為?、70 ?、75 ?、80 ?。 760 torr、380 torr、150 torr、50 torr、1 torr。 唯有惜时才能成功,唯有努力方可成就,