安捷伦1260高效液相操作规程

安捷伦1260高效液相操作规程 安捷伦液相1260高效液相色谱 操作规程 1.前期工作 查找资料(最好是外文文献)了解别人做该样品时常用的流动相和固定相。如果还不清楚样品是什么物质，最起码也应该对其极性进行了解，为选择合适的流动相和固定相打好基础。 流动相选择: ? 避免使用高粘度的溶剂作为流动相; ? 所选用的流动相一定要与样品相溶; ? 各流动相之间可以很好的相溶; 固定相选择注意事项: a. 正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其他具有极性官能团胺基团，如(NH2，APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷(Hexane)，氯仿(Chloroform)，二氯甲烷(Methylene Chloride)等。 b. 反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相 对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。 1 2.准备工作 ? 用于液相色谱分析的样品溶液使用前要经过0.15µm过滤器过滤，必须达到均匀而无颗粒的状态; ? 流动相一定要选用色谱级别的(最好是默克、飞世尔、时联等牌子的)，并且在使用之前一定要使用0.4µm过滤器过滤，再用超声波清洗仪脱气处理20-30min; ? 在连接柱子和色谱仪之前，阀件或管路一定要清洗干净，(一般用异丙醇将管路清洗) 3.仪器操作 (一)将所选择的流动相加入相应的试剂瓶中:棕色瓶对应A泵，该瓶中只能加双蒸水或娃哈哈纯净水;B、C、D泵根据需要添加。 注:若流动相中有水、乙腈最好现用现处理，不宜放置太长时间。 (二)先打开计算机登陆windows操作系统，再将仪器的泵、色谱柱、检测器打开，待计算机界面显示连接好后，双击桌面“联机”图标，进入化学工作站，从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面。 2 模块右上角状态灯颜色说明:无色，未开电源或者模块准备就绪 黄色，模块未准备就绪 绿色，正在进样分析 红色，模块出错 所有模块红色，仪器有漏液 工作站图形颜色说明: 绿色，模块准备就绪 黄色，模块未准备就绪 蓝色，正在进样分析 红色，出错或者不能联机 灰色, 此模块没启用 , , 3 等度洗脱:直接选择比; 梯度洗脱:在,中设定好初始比例，再点击,，设置一定时间内不同的比例。 方法如下: 前10min中，A:B=10:90 第10-15min中，用B:100% 第15-30min，A逐渐增加到 20%，B逐渐减少80%。 设置: 10min， A:B=10:90; 10.1min， B:100%; 15min ， A:B=0:100%; 30min， A:B=20:80 (三)右击四元泵界面: ,选择“瓶填充”点击“溶剂瓶填充量”设置溶剂瓶中流动相实际体积，也可设定低体积关泵。 ,旋开排气阀(逆时针)，点击“方法”选项进入泵编辑的画面。将泵的流量设到5ml/min,溶剂A设到100%，打开泵，观察排出管线中的气体，直到管线内由溶剂瓶到泵入口无其起泡为止，查看柱前压力(若大于10bar，则应更换排气阀内的过滤白头)。 ,依次切换到B、C、D溶剂分别排气。 4 (四)将泵的流速调到0.5ml/min,设定四元泵最初的溶剂比例，如A=80%，B=20%;关闭排气阀。 (五)再将流速设定到所需流量，待压力视数稳定，打开检测器灯，观察基线情况。 注:若反复几次检测器显示错误，右击“视图”中的“工作日志”“当前工作日志”查看是什么错误。 以上步骤用文字也可描述为 1) 打开计算机，登陆windows操作系统。 2) 打开主机各模块电源(从上至下)，待各模块完成自检后，再双击桌面“仪器1联机” 图标,进入化学工作站，从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面。 3) 把各流动相放入溶剂瓶中。 4) 旋开排气阀(逆时针)，右单击“四元泵”图标出现快捷键，点击“方法”选项进入泵 编辑画面。将泵流量设到5ml/min，溶剂A设到100%，打开泵，排出管线中的气体2— 3分钟，直到管线内由溶剂瓶到泵入口无气泡为止,查看柱前压力(若大于10bar，则应 更换排气阀内过滤白头)。 5) 依此切换到B、C、D溶剂分别排气。 6) 将泵的流量设到0.5ml/min，多元泵则再设定溶剂配比，如A=80%，B=20%;关闭排气阀 (顺时针)。 7) 再将泵的流量设到0.8ml/min，2分钟后将泵的流量设到1ml/min，冲洗色谱柱20—30 分钟。 8) 把缓冲液换成流动相，待柱前压力基本稳定后,打开检测器灯，观察基线情况。 (六)编辑样品信息:由“运行控制”进入“样品信息”，设定操作者姓名，样品数据文件名等。 (七)四元泵参数设置: 5 (八)色谱柱设置(TCC检测器参数设置) 右击TCC模块中的空白区域，在“温度”左侧下面的方框内输入所需的温度，并选中它，右侧选中“与左侧相同”——使柱温箱的温度左右一致。 (九)VWD检测器参数设定 右键点击 VWD 模块视图空白处，选择“方法”进入 VWD 的参数设置界面 波长---设置 VWD 检测波长 峰宽---设置为色谱图中的预期的最窄峰。峰检测器将忽略比峰宽设置 窄很多或者宽很多的所有峰 停止时间---设置 VWD 停止分析时间。一般设置为“与泵一致”即可 杂项---当 VWD 与其他检测器一起工作或者设定冲洗色谱柱的梯度方法时，关闭检测器的灯，分析将停止。如果希望关闭检测器的灯时也能进行分析，将“采集所需的等已打开”一栏不选定即可。 时间表---此处可以变化的参数包括自动平衡、改变波长、执行扫描。 (十)进样 在设置“运行控制->样品信息”后，将手动进样阀扳至“load”状态进样(将样品装入到定量环内)。进样后，将手动进样器扳至“inject”状态，工作站自动开始记录采集数据。 分析完成后，将手动进样阀扳至“load”状态，用定量环的 5 倍体积左右的甲醇清洗定量环，再在“inject”状态下清洗排空管路。清洗进样口，防止残留样品污染下次进样。 注:手不要拿注射器的针头和有样品的部位，不要有气泡，吸样时要慢、快速排出再慢吸，反复几次，10µL注射器金属针头部分体积0.6µL，有气泡也看不到，多吸1-2µL把注射器针尖朝上，气泡上走到顶端，再推动针杆排除气泡，进样的速度要快，每次进样要保持 6 相同的速度。 (十一)在线信号检测 “视图”中打开在线信号，可以随时了解样品出峰情况。 (十二)关机 关闭检测器的灯:G1314B/C/E/F(可变波长紫外检测器)，关闭检 测器的灯后冲洗系统，可以延长检测器灯的寿命。 冲洗系统:没有盐缓冲溶液的流动相，(反相系统)用 85%~90%有机相+15%~10%水相冲洗系统和反相色谱柱或者适宜的流动相冲洗系统和反相色谱柱。有盐缓冲溶液的流动相，(反相系统)用 85%~90%水相+15%~10%有机相冲洗系统和反相色谱柱(反相系统)，除去反相色谱柱与系统中的盐溶液。然后用85%~90%有机相 +15%~10%水相冲洗系统和反相色谱柱。 封存色谱柱:(反相系统)用 90%~95%有机相+10%~5%水相封存反相色谱柱，两端封死。(如长时间存放可将柱子完全侵泡有机相内，以防用纯有机相封存反相色谱柱，如果长期保存有机相会挥发)。 关闭电脑:将泵流速逐步降至 0ml/min，单击“关闭”按钮关闭所有模块，退出化学工作站，关闭电脑。 4.注意事项 ? 使用反向柱时，要注意正相溶液的比例最好不要超过5%，否 则会对柱子产生影响。 ? 氘灯是易耗品，应最后开灯，不分析样品时即关灯，洗柱子 时应关灯。 5.操作中常见问的解决方法 ?宽峰:系统未达到平衡;溶解样品的溶剂极性比流动相差不多; 色谱柱尺寸及类型选择不正确;色谱柱或保护柱被污染或柱校降低;温度变化造成的影响。 7 ?过滤白头可以用10%异丙醇超声30min ?含水流动相最好在实验前配置，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌的生长。 8 9