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茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用

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茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用 茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作 用 山东医药2010年第5O卷第19期 茶黄素对人骨髓基质干细胞的 成骨诱导作用 尚希福,路玉峰,张文志,张梅,贺瑞,姚刚,胡飞,曾建学 (1安徽医科大学附属省立医院,合肥230001;2北京丰台医院; 3安徽医科大学基础医学院免疫教研室) 摘要:目的探讨茶黄素对体外培养人骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨诱导作用及其能力.方法将第二代 ,茶黄素组加入浓度为10mmoVL茶黄索,对照组人BMSCs分为茶黄素组,对照组 不干预.对比观...
茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用
茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用 茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作 用 山东医药2010年第5O卷第19期 茶黄素对人骨髓基质干细胞的 成骨诱导作用 尚希福,路玉峰,张文志,张梅,贺瑞,姚刚,胡飞,曾建学 (1安徽医科大学附属省立医院,合肥230001;2北京丰台医院; 3安徽医科大学基础医学院免疫教研室) 摘要:目的探讨茶黄素对体外培养人骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨诱导作用及其能力.方法将第二代 ,茶黄素组加入浓度为10mmoVL茶黄索,对照组人BMSCs分为茶黄素组,对照组 不干预.对比观察两组干预后细 胞形态,钙结节,碱性磷酸酶(ALP),I型胶原及骨钙素(OCN)免疫组化染色结果,并检测各组4,8,12,16d各时点 ALP,OCN活性.结果茶黄素组钙结节,ALP,I型胶原及OCN免疫组化染色均呈阳性,对照组均为阴性;茶黄素 组各时点ALP,OCN活性均高于对照组(P均<0.05).结论茶黄素可促进人BMSCs向成骨细胞分化. 关键词:人骨髓基质干细胞;成骨细胞,诱导;茶黄素;骨钙素 中图分类号:R329.29,R931.71文献标志码:A文章编号:1002-266X(2010)19-0007-03 EffectsofthetheaflavinonosteodifferentiationofhumanbonemarrowstromaIstemceils SHANGXi-fa,LUYu-feng,ZHANGWen-zhi,ZHANGMei,HERui,YAO,HUFei,ZENGJ ian—Xlle (1AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedwalUniversity,Hefei230001,P.R.China) Abstract:0bjectiveToinvestigatetheeffectandabilityoftheaflavinonosteogeniedifferentia tionofhumanbone ma/TOWstromalcellsinvitro.MethodsThe2ndpassagehumanBMSCsweredividedintotheaflavingroupandcontrol group,thetheaflavingroupwereculturedwith10mmol/Ltheaflavin,thecontrolgroupwasnotintervened.Thentheosteo- blastphenotypedifferentiation,VonKossa,alkalinephosphatase(ALP),typeIcollagenandosteocalcin(OCN)immunohis- tochemicalstainingofthetwogroupswereobserved,theALPandOCNactivitywereassayedrespectivelyat4,8,12,16d. ResultsTheimmunohistochemiealstainingofosteoblast,ALP,typeIcollagenandOCNintheaflavingroupwereallposi— five,andwhichinthecontrolgroupwereallnegative;TheALPandOCNactivityatdifferenttimeintheaflavingroupwere bothsignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionTheaflavincanpromotethedifferentia— tionofosteoblastinducedbyhumanbonereal'rowstromalcells. Keywords:humanbonemarrowstromalcells;gegenbaurcell,induce;theaflavin;osteocalcin 骨髓基质干细胞(BMSCs)具有较强的成骨分 化潜能,易于分离提取,并容易体外培养,诱导,扩 增,是骨组织工程研究中最常用的种子细胞.但其 体外单纯进行培养时并无成骨发生,须在具有成骨 诱导作用条件下才能向成骨方向分化.茶黄素是茶 色素的一种,具有抗氧化,降血脂等作用.2008年5 — 8月,我们观察了茶黄素对体外培养的人BMSCs 的成骨诱导作用.现如下. 1材料与方法 1.1材料1O例骨折或骨不连患者于髂骨术中抽 取骨髓5Hll(患者及亲属知情同意),患者男7例, 女3例;年龄19~42岁,平均33岁.胫骨平台骨折 5例,跟骨骨折1例,肱骨干骨不连2例,股骨干骨 基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(070413083). 不连1例,尺骨骨不连l例.茶黄素溶液(将茶黄素 粉剂溶于DSMO中,制成浓度为10mmol/L的溶液, 置人一20?冰箱备用),高糖DMEM,胰酉每/EDTA, 胎牛血清(FBS),二甲基亚砜(DSMO),碱性磷酸酶 (ALP)检测试剂盒,钙染色试剂,TriPure提取液,骨 钙素(OCN)放免试剂盒,骨钙素抗血清. 1.2BMSCs分离,培养及干预将骨髓以1000r/ min离心10min,弃上清,加人含10%FBS双抗的高 糖DMEM培养基,以5X10/cm接种于25cm培 养瓶中,置于37oC,5%CO:饱和湿度培养箱中培 养,第2天半量换液,后每3天换液1次,每天观察 细胞形态,贴壁及生长情况,待细胞融合达80%一 90%,用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化,传代.取 传代第二代细胞,2×10/cm的浓度接种于的2个 6孔板中,每孔内加2nd含10%FBS的H.DMEM培 7 养液及经过高压灭菌的盖玻片,放入CO培养箱中 培养.当细胞贴壁生长达到80%,90%汇合时分 为两组,茶黄素加人茶黄素溶液使终浓度为10 mmol/L,对照组不干预.重复上述实验4次,收集 细胞爬片,用于相关指标观察及检测. 1.3细胞形态特征观察?细胞形态及分化:光学 显微镜观察细胞培养及干预4周形态及分化特点. ?钙结节形成:采用VonKossa技术,分别对茶黄素 组和对照组收集细胞爬片进行钙结节染色,用蒸馏 水洗盖玻片,滴加l%硝酸银溶液置于强光下作用 l5,60min,用蒸馏水洗3min.2%硫代硫酸钠溶 液处理2min,流水冲洗5min,常规封片.于12d 及24d比较两组阳性情况.?ALP阳性细胞:干预 后3,6,9,12d后取两组细胞爬片,丙酮固定,用改 良钙钴法染色测定细胞ALP活性,每个爬片随机计 数100个细胞,计算ALP阳性细胞(呈浅棕色或棕 褐色)率.?I型胶原及OCN达:分别取两组诱 导培养2周的细胞爬片,用0.1mmol/L的PBS清洗 3遍,按照I型胶原及OCN染色方法及试剂盒说明 进行免疫组化染色. 1.4AIJP水平检测取生长状态良好的第三代细 胞,按1×10/ml密度接种于3个24孔板内,茶黄 素组加人浓度为10mmol/L茶黄素溶液进行培养, 对照组不干预.分别于第4,8,l2和16d各取5孑L 细胞,每孔加入500l浓度为0.1%TritonX一100细 胞裂解液,4?冰箱12h过夜,吸管反复吹打后,镜 下观察BMSCs全部破坏后,采用磷酸苯二钠法测定 各组BMSCs细胞ALP活性.用分光光度计于520 nm,1cm光镜比色条件下,测定吸光度(A)值,以 0.1%TritonX一100为空白对照调零.细胞ALP活性 (金氏单位)=管含酚量(0.005mg)X2000× 测定管吸光度/标准管吸光度. 1.5OCN水平测定诱导培养细胞同ALP检测, 检测时将第三代经茶黄素作用的和未经茶黄素作用 的一2O?细胞裂解液解冻,每孔取上清100Ixl,采 用骨钙素放免试剂盒进行测定,自动Y一计数仪器测 定沉淀物每分钟计数值,根据标准品曲线得出骨钙 素水平. 1.6统计学方法采用SPSS12.0统计软件,ALP 及OCN水平测定数据以?s表示,采用方差分析. 检验水准仪=0.05. 2结果 2.1细胞形态学特征BMSCs细胞接种于培养物 中,有较多血细胞悬浮,9,10h开始贴壁.培养第 2天时,可见大量梭形细胞贴壁,呈团块状,以后细 8 山东医药2010年第50卷第r9期 胞呈克隆样生长,随着换液次数增加,悬浮的血细胞 逐渐清除.培养第lO—l2天细胞长满瓶底.传代 细胞2—3h贴壁,向多角形转化,并形成多个突起. 诱导培养l2,15d可见圆形及椭圆形结节形成. 以后出现钙盐沉着,结节中央逐渐变浓,不透光,3 周时可见明显的矿化结节,4周时矿化结节增多且 互相融合.茶黄素组加入茶黄素后12d开始形成 钙结节,2周后开始增多;24d茶黄素组钙结节染色 均阳性,对照组钙结节阴性.茶黄素组第3,6,9, 12dALP染色均阳性(出现浅棕色或棕褐色颗粒状 或片状沉积)率分别为11%,65%,90%,98%,第8 天ALP细胞阳性率最高,达90%;对照组均阴性;茶 素组I型胶原表达呈阳性,对照组为阴性;茶黄素组 OCN表达阳性,对照组为阴性. 2.2ALP及OCN水平见表1. 表1两组ALP,OCN水平比较(i士s) 注:与对照组比较.'P<0.05 3讨论 BMSCs具有向成骨细胞的分化潜能,其体内成 骨机制目前仍不清楚.研究发现,单纯在体外进行 细胞培养并不能使MSCs向成骨方向转化,说明存 在诱导,促进和抑制因素.目前最常用的成骨细胞 分化诱导液是地塞米松(10,retooL/L),13-甘油磷酸 钠(10retool/L),维生素C(50mL).最近文献报 道,供者的年龄,性别,创伤情况?J,细胞传代次数 的增加亦影响BMSCs的成骨能力.支架孔隙的 大小,材质,低频激光,波长,降脂药物,中药及抑癌 基因p53丢失能促进人BMSCs向成骨方向分化. 而炎痛喜康,吡罗昔康,塞来考昔等抗炎药物则抑制 BMSCs的成骨分化. 对BMSCs进行成骨诱导后需进行成骨鉴定,钙 结节形成,ALP,I型胶原及OCN表达,细胞ALP及 OCN水平均为常用指标.由于单纯根据钙结节形 成情况并不能确定干细胞的体外成骨情况-4,本实 验对上述指标均进行了测定. 茶黄素为红茶的主要成分,研究发现其具有抗 肿瘤,抗炎,抗氧化,抗病毒,抑菌,降血脂及预防动 山东医药2010年第50卷第19期 脉粥样硬化等作用,目前临床多用于治疗高脂血症 和心脑血管疾病.有报道长期饮红茶可增加骨密 度],减少髋部骨折发生率【6;研究表明茶黄素能 促进成骨链中重要调节子Cbfal/Runx2的表达,从 而促进骨钙素(OCN),骨桥接蛋白(OPN),骨唾液 蛋白(BSP),I型胶原等成骨蛋白基因的表达,最终 促进成骨细胞的分化J.本研究显示,茶黄素对 BMSCs的成骨分化具有较强的诱导作用.其可能 机制:?促进BMSCsCbfal/Runx2骨钙素(OCN), AIJP基因的表达;?抑制BMSCs成脂基因的表达; 文献报道,成骨基因的表达与成脂基因的抑制具有 相关性;?促进Pcp4基因(一种成骨强相关基因) 的表达. 参考文献: [1]SeebachC,HenrlchD,TewksburyR,eta1.Numberandprolifera— tirecapacityofhumanmesenchymalstemcellsaremodulatedposi— tivelyinmultipletraumapatientsandnegativelyinatrophicnonun— ions[J].Calcif|rissueInt,2007,80(4):294—300. [2]SugiuraF,KitohH,lshiguroN,eta1.Osteogeniepotentialofrat ? 护理园地? mesenchymalstemcellsafterseveralpassages[J].BiochemBiophy ResCommun,2004,316(1):233-239. [3]ChangJK,LiCJ,WuSC,eta1.Effectsofanti—inflammatorydrugs onpmllfemtion,eytotoxicityandosteogenesisinbonemarrow"rues— enchymalstemcells[J].BiochemPharm,2007,74(9):1371一 l382. [4]BonewaldLF,HarrisSE,RosserJ,eta1.Vonkossastainingalone isnotsueienttoconformthatmineralizationinvitrorepresentsbone formation[J].CaleifTissuelnt,2003,72(5):537-547. [5]ChenZ,PettingerMB,RitenbaughC,eta1.Habitualteaeonsump. tionandriskofosteopomsis:aprospectivestudyinthewomen,吕 healthinitiativeobservationalcohort[J].AmJEpidemiol,2003, 158(8):772-781. [6]WuCH,YangYC,YaoWJ.eta1.Epidemiologicalevidenceofin. creasedbonemineraldensityinhabitualteadrinkers[J].ArchIn- ternMed,2002,162(9):1001—1006. [7]ChenCH,HoML,ChangJK,eta1.Greenteacatechinenhances esteogenesisinabonemalTowmesenchymalstemcellline[J].Os— teopomsInt,2005,16(12):2039-2045. [8]赵宇,陆应麟,乔群,等.培养的人骨髓问充质干细胞向成骨细 胞,脂肪细胞分化[J].安徽医科大学,2004,39(1):22-25. (收稿日期:2009—11—17) 重症急性胰腺炎33例护理体会 李娆仙 (海南医学院附属医院,海口570102) 急性胰腺炎预后差,病死率高.2003年12月.一2008年 11月,我们共收治33例重症急性胰腺炎患者(年龄29—88 岁),经积极抢救,合理治疗,严密监护,精心护理痊愈3O例, 死亡3例(多脏器衰竭2例,感染性休克1例).现将护理体 会介绍如下. 护理体会:?病情观察:患者入院后在监护室进行生命 体征监测.给予心电监护,密切观察患者意识,面色,体温, 皮肤温湿度,监测血压,心率,心律,血氧饱和度变化情况;监 测血糖,血钙,血尿淀粉酶,肝肾功能,血气分析,准确记录 24h出入量,神志改变,血压下降,尿量减少,皮肤苍白,出冷 汗等为低血容量性休克表现,一旦出现应立即通知医生并配 合抢救.?腹痛的护理:腹痛为急性胰腺炎主要症状,疼痛 剧烈而持续,由于渗液扩散可引起全腹剧痛.患者应绝对卧 床,指导患者用深呼吸,冥想,听音乐等方法转移注意力,减 轻痛苦.为减轻疼痛,可协助患者取弯腰,屈膝侧卧位;为降 低机体代谢率,增加脏器血流量,促进组织修复和体力恢复, 取半卧位有利于炎症局限,松弛腹肌,缓解疼痛.对烦躁不 安,躁动者应加强防护,加床栏防止患者坠床.腹痛剧 烈者遵医嘱予哌替啶等止痛药,但禁用吗啡,以防引起Oddi 括约肌痉挛,加重病情.腹胀明显者可予芒硝袋外敷:用棉 布袋装芒硝约500g,外敷于患者腹部,与皮肤直接相贴,待 芒硝变成块状时更换另一袋,使用芒硝时应注意观察腹胀, 肠鸣音及肛门排气情况.?饮食护理:患者需禁饮食,行胃 肠减压,其目的在于减少胃酸分泌,进而减少胰液分泌,以减 轻腹痛和腹胀.注意观察和记录胃液的量及颜色,待腹痛, 呕吐基本消失后才能停止胃肠减压.应向患者及家属解释 禁饮食的意义,取得患者及家属的配合.患者口渴时可含漱 或湿润口唇,并做好口腔护理.禁食期后,临床症状基本?肖 失,查血,尿淀粉酶正常后,先饮少量开水1d,如无腹部不 适,第2天进食少量米汤,藕粉,果汁等高碳水化合物无脂流 食,而后逐渐增加食量,少量多餐,再过渡到无脂半流食,到 含少量蛋白和脂肪的半流质食物.?用药护理:重症急性胰 腺炎患者需24h不问断持续用药,应密切观察药物不良反 应.抗生素要现配现用.注射时选用静脉留置针,严格执行 无操作原则,注意保持静脉通道的通畅,保护血管,防止静脉 炎发生.?心理护理:患者住院过程中因疾病,医疗费用过 高等因素,会产生恐惧,焦虑等不良情绪,如病情无明显好转 或者出现反复,其对治疗会丧失信心,甚至不配合治疗.我 们通过与患者沟通,观察患者面部表情,言词,发现其心理问 题,有针对性的给予疏导和安慰,介绍疾病病程或请康复期 患者介绍经验,给患者康复的希望.同时,动员其亲属给患 者更多的关心和帮助,使患者尽快消除不良情绪,从而更好 地配合治疗和护理.?健康指导:向患者和家属介绍本病的 相关知识,解释本病病因多见为胆道疾病(胆石症,胆道感染 和胆道蛔虫)及暴饮暴食,酗酒.应积极治疗胆道疾病,防治 胆道蛔虫;养成规律进食的习惯,避免暴饮暴食.康复期应 从少量低脂,低糖饮食开始逐渐恢复正常饮食,应避免刺激 强,产气多,高脂肪和高蛋白食物,戒除烟酒,预防复发. 9
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