蛋白质、核酸、酶复习（生化）

蛋白质、核酸、酶复习（生化） 生物化学是利用化学的原理和方法研究生物的一门科学。主要是研究生物分子，特别是生物 大分子的相互作用、相互影响，揭示生命活动现象的原理和本质。 四大基本物质：糖类、脂类、蛋白质和核酸 三大活性物质：酶、维生素、激素 蛋白质组学 是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。 蛋白质一般含碳、氢、氧、氮、硫及微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素 , 蛋白质的含量=含氮量/16% =含氮量×6.25 蛋白质的基本组成单位 是 a-氨基酸，存在于自然界中的氨基酸有300多种，而组成人体蛋白质的氨基酸则只有20种，除脯氨酸外，均为 a-氨基酸，除甘氨酸外，均为L-氨基酸（甘氨酸因无侧链故只是a-氨基酸） 。 a-碳原子：-C- 与 -COOH 相连的碳原子称为a-碳原子 一般来说，天然蛋白质中的所有氨基酸都是L-型氨基酸。 氨基酸的分类 1，非极性氨基酸（疏水性氨基酸）9种： 2，不带电荷极性氨基酸（中性氨基酸）：丝ser，苏thr，天冬asn，谷氨酰胺gln，酪tyr， 半胱氨酸cys 3，带正电荷极性氨基酸（碱性氨基酸）组his，赖lys，精arg 4，带负电荷极性氨基酸（酸性氨基酸）：天冬asp，谷glu 氨基酸的重要理化性质 2.氨基酸的光吸收特征： , 在可见光区，无光吸收。 , 在紫外光区，色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）有吸收光能 力，三者 的最大光吸收波长分别为279、278、259nm 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm 波长附近，大多数蛋白质含有色氨酸和酪氨酸，故 测280 nm 的吸光值可反映出溶液中的蛋白质含量。 氨基酸的两性解离及等电点： , 两性离子：带有数量相等的正负两种电荷的离子。 , 氨基酸的等电点：对某种氨基酸来讲，当溶液在某一特定的pH时，氨基酸 以两性离子的形式存在，正电荷数与负电荷数相等，净电荷为零，在直流电 场中，既不向正极移动，也不向负极移。这时，溶液的pH，称为该氨基酸 的等电点，用pI表示。 , 氨基酸是两性电解质。在PH值小于其等电点的溶液中，氨基酸带正电，在 电场中向阴极移动；在PH值大于其等电点的溶液中，氨基酸带负电，在电 场中向阳极移动。 , 等电点状态下，氨基酸溶解度最小，易发生沉淀，可用于从氨基酸混合物溶 液中分离制取某种氨基酸。 一分子氨基酸与另一分子氨基酸缩合，脱去一分子水形成二肽 连接两个氨基酸的酰胺键称为肽键 蛋白质的三维结构又称蛋白质的高级结构或蛋白质的构象，包括蛋白质的二级结构、过度结 构、三级结构和四级结构。 , 蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、 旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。 , 主要有,-螺旋、,-折叠、,-转角、自由回转。 一级结构?二级结构?超二级结构?结构域?三级结构?亚基?四级结构 别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活 性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式. • 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 • 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液 中沉淀出来。 1、加高浓度盐 破坏了蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀。 盐析：向蛋白质溶液中加盐而使蛋白质沉淀析出的现象，称为盐析。 应用：蛋白质的分离纯化。 2、加有机溶剂（破坏蛋白质分子周围的水膜） 应用：蛋白质的分离纯化。 3、加重金属盐（与蛋白质结合成不溶性盐） 4、加某些酸类（与蛋白质合成不溶性盐） 可逆沉淀 (1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 (2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液， 所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 (3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法 等。 不可逆沉淀 (1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构 和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 (2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 (3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 H NHN N 2 N N H H H H 嘌呤 腺嘌呤 adenine N N N N H H H NH2 NHHN N H H 嘧啶 胞嘧啶 Cytosine NHH OOH H H NH N DNA双螺旋 B型结构 * 两条链反向平行，右手螺旋，有一共同螺旋轴，有大沟和小沟 * 碱基在内，互补（A＝T，G?C） * 碱基平面垂直于螺旋轴，戊糖在外，双螺旋每转一周为10碱基对（bp） * 多数天然DNA为双链结构DNA * 多数DNA分子比较刚硬，呈伸展结构，但少数DNA分子较柔韧，有三级结构 双螺旋DNA的结构参数 类型 旋转方螺旋直径螺距（nm） 每转碱基碱基对间垂直距碱基对与水 向 （nm） 对数目 离（nm） 平面倾角 A－DNA 右 2.3 2.8 11 0.255 20º B－DNA 右 2.0 3.4 10 0.34 0º Z－DNA 左 1.8 4.5 12 0.27 7º 基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。 RNA的结构与功能 一、结构主要特点 碱基组成 A、G、C、U （A＝U/G?C） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解 主要特征： 1.四臂四环； 2.氨基酸臂3′端有-CCA-OH的共有结构； 3.D环上有二氢尿嘧啶（D）； 4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用； 5.可变环上的核苷酸数目可以变动； 6.TψC环含有T和ψ； 7.含有修饰碱基和不变核苷酸。 核酸的性质 （一）一般理化性质 1.为两性电解质，通常表现为酸性。 2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有机溶剂。 3.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。 4.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。 5.利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。 （二）核酸的紫外吸收性质 核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。 核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增 加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。 （三）核酸结构的稳定性 1.碱基对间的氢键；2.碱基堆积力；3.环境中的正离子。 （四）核酸的的变性 双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏， 形成单链无规线团状的过程，只涉及次级键的破坏。 DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度 称熔解温度(melting temperature, Tm)。 影响Tm的因素： （1）G-C的相对含量 （G+C）% =（Tm — 69.3）× 2.44 （2）介质离子强度低，Tm低。 （3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。 （4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。 （五）核酸的复性（退火） 复性：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋 的过程。 退火：变性核酸复性时需要缓慢冷却，称为退火。 影响复性速度的因素： （1）单链片段浓度 （2）单链片段的大小 （3）片段内重复序列的多少 （4）溶液离子强度的大小 （5）溶液温度的高低 （T – 25?） 生物膜:细胞膜及其内膜系统。 即细胞膜和各种细胞器、亚细胞结构的膜。厚约4—7nm。 膜的化学组成 生物膜由水、蛋白质、脂类、糖类、金属离子等构成。 膜的流动镶嵌模型结构要点 1.膜结构的连续主体是极性的脂质双分子层。 2.脂质双分子层具有流动性。 3.内嵌蛋白“溶解”于脂质双分子层的中心疏水部分。 4.外周蛋白与脂质双分子层的极性头部连接。 5.双分子层中的脂质分子之间或蛋白质组分与脂质之间无共价结合。 一、酶:是生物体内进行新陈代谢不可缺少的、受多种因素调节控制的具有催化能力的生物 催化剂 酶突出的催化特点： 1.高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍。 2.专一性：酶对底物具有严格的选择性。 3.敏感性：对环境条件极为敏感。 4.可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。 二、酶的分类与命名 1. 氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。 （1）脱氢酶类 （2）氧化酶类 （3）过氧化物酶 （4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶） 2. 转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。 3. 水解酶类：催化加水分解作用。 4. 裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。 5. 异构酶：催化 各种异构体之间的互变。 6. 合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。 三、酶的化学本质 酶分为： 1.单纯酶 2.结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子 辅因子分为： 1.辅酶：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物 2.辅基：与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 3.金属激活剂：金属离子作为辅助因子。 酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载 体。 （三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物 四、酶的结构与功能的关系 （一）活性部位和必需基团 必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。 活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。 （二）酶原的激活 没有活性的酶的前体称为酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。这个过程实 质上是酶活性部位形成和暴露的过程。 （三）同工酶(isoenzyme) 同工酶能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在 明显差异的一组酶。 五、酶作用的专一性 酶作用的专一性 结构专一性：1.族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物 2.绝对专一性：只能作用于某一底物。 立体异构专一性 六、酶的作用机理 （一）酶的催化作用与分子活化能 化学反应自由能方程式ΔG =ΔH -TΔS （ ΔG是总自由能的变化， ΔH 是总热能的变化，ΔS是熵的变化） 当ΔG＞0，反应不能自发进行。当ΔG＜0，反应能自发进行。 活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进 入活化状态所需的自由能。 促使化学反应进行的途径： 1. 用加热或光照给反应体系提供能量。 2. 使用催化剂降低反应活化能。 酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应 速度加快。 （二）中间产物学说 中间产物存在的证据： 1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）； 2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。 （三）诱导嵌合学说 诱导嵌合学说（Koshland，1958）：酶活性中心的结构有一定的灵活性，当底物（激活剂或 抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催 化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合， 结合成中间产物。 （四）酶与反应的过渡态互补 酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，释放出结合能使ES的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应速度。 （五）抗体酶（abzyme） 即是抗体又具有催化功能的蛋白质，是具有催化活性的抗体。 （六）使酶具有高催化效率的因素 酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使 分子间的催化反应转变为分子内的催化反应。 1. 邻近定向效应： 酶与底物结合成中间产物过程中，底物分子从稀溶液中密集到活性中心区，并使活性中 心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应。 2. “张力”与“形变”： 酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物 分子的某些键的键能减弱，产生键扭曲，降低了反应活化能。 3. 酸碱催化： 通过想反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作为酸）夺取质子来达到加速反应的一 类催化。（广义酸碱催化，Bronsted的酸碱定义） 蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基 影响酸碱催化反应速度的两种因素： （1）酸或碱的强度（pK）； （2）质子传递的速度。His的咪唑基最活跃。 4. 共价催化：底物分子的一部分与酶分子上的活性基团间通过共价结合而形成的中间物， 快速完成反应。 5. 微环境的影响： 酶的活动中心由于微环境的影响，存在高浓度的酸和高浓度的碱，可以有多种催化方式的环 境有利于反应的进行。 七、酶促反应的速度和影响酶促反应速度的因素 （一）酶反应速度的测量 用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。测定反应的初速度。 （二）酶浓度对酶作用的影响 在有足够底物和其他条件不变的情况下： v = k [E] （三）底物浓度对酶作用的影响 1. 底物浓度对酶反应速度的影响 2. 米氏方程式（Michaelis-Menten equation） 3. 米氏常数的意义及测定 意义 （1） km是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且 随着温度、pH和离子强度而改变。 （2）从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。 （3）当k2＞＞k3时， km的大小可以表示酶与底物的亲和性。 （4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。 （5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。 （四）pH对酶作用的影响 1.最适pH 表现出酶最大活力的pH值 2.pH稳定性 在一定的pH范围内酶是稳定的 pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。 （五）温度对酶作用的影响 两种不同影响： 1.温度升高，反应速度加快； 2.温度升高，热变性速度加快。 （六）激活剂对酶作用的影响 凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。 （七）抑制剂对酶作用的影响 使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称 为抑制剂（I）。 1. 不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。 2.可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。 抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。 ?竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。 特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位 2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。 3）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。 ?非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。 ?反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。 反馈抑制：在代谢过程中局部反应产物对催化该反应的酶所起的抑制作用。 别构抑制：酶的别构位与变构剂结合即会引起酶活性位的构象改变从而改变酶的活 性。凡因负变构剂与酶的别构位结合而引起的酶活性下降称为别构抑制。 抑制作用的机制 1. 抑制剂与酶结合成极稳定的络合物，从而减低或破坏酶的活性。 2. 破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构象。（如重金属（Ag+、Hg2+）和类金属（As3+）破坏SH） 3. 夺取酶与底物结合的机会，从而减少酶的作用。（竞争性抑制剂） 4. 阻抑S + E??ES?E + P反应的顺利进行（反馈抑制） 八、酶的制备与活力的测定 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。 酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（U/g，U/ml） 在最适的反应条件（25?）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活 力单位，即 1IU=1μmol/min 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s 工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。 优点： • 不受气候、地理条件的限制 • 动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到 • 微生物繁殖快，产酶量由丰富 • 可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产 酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂 酶的纯度： 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮） 酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法 酶的保存： 1.低温（0~4?，-20?）； 2.高浓度较稳定； 3.加入稳定剂； 4.固定化。 酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法） 处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。 九、酶的应用 工业上酶应用的优点： 1. 酶的催化效率高，专一性强，不发生副作用。 2. 酶作用条件温和。 3. 酶及其反应产物大多无毒性。酶工程：酶的生产、制备和应用。 酶工程：酶的生产、制备和应用。 维生素是维持生物正常生命过程所必需的一类小分子有机物。 维生素不能供给机体热能，也不能作为构成机体组织的物质。 其主要功能是通过作为辅酶的成分调节机体代谢。 水溶性维生素： 维生素B族（B1、B2、泛酸、维生素PP、B6、生物素、叶酸，B12）和维生素C等 脂溶性维生素： 维生素A、D、E、K等 维生素B2的生理功能是作为递氢辅酶，参与生物氧化作用。 泛酸的生物功能是以CoA形式参加代谢，是酰基的载体，是体内酰化酶的辅酶，对糖、脂、 蛋白质代谢过程中的乙酰基转移有重要作用。 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+） 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+） 维生素PP功能：1.以NAD+或NADP+形式作为脱氢酶的辅酶而起到递氢体的作用。 2. 维持神经组织的健康。尼克酰胺对中枢及交感神经系统有维护作用，缺 乏，则常产生神经损害和精神紊乱。3. 促进微生物生长。4.尼克酸可使血 管扩张，使皮肤发赤发痒，尼克酰胺无此作用。大剂量尼克酸有降低血浆 胆固醇和脂肪的作用。 维生素B6又称吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺。 叶酸（folic acid）即维生素B11，由蝶呤啶、对氨基苯甲酸与L-谷氨酸连接而成。 叶酸的5、6、7、8位置，在NADPH2存在下，可被还原成四氢叶酸（FH4或THFA）。 四氢叶酸的N5 和N10位可与多种一碳单位结合作为它们的载体。 维生素A只存在于动物性食物中，包括A1 和 A2两种。A1即视黄醇，主要存在于咸水鱼的 肝脏；A2即3-脱氢视黄醇，主要存在于淡水鱼肝脏 维生素E又称生育酚或抗不育维生素，已知有8种，其中4种（α、β、γ、δ-生育酚） 较为重要，α-生育酚的效价最高。动物组织的维生素E都是从食物中取得的。 维生素K是一类能促进血液凝固的萘醌衍生物。有K1、K2、K3三种，K1、K2为天然产物， K3为人工合成品。