神经生物学论文-帕金森氏病的治疗研究进展

帕金森氏病的治疗研究进展 摘要     帕金森氏病是一种多巴胺能神经元数量减少、功能减弱导致多巴胺减少而产生的慢性神经退行性疾病，患者通常在中老年阶段开始发病并逐渐恶化。在疾病的早期阶段，补充多巴胺和刺激多巴胺产生的传统疗法比较有效，但随着疾病的进展，传统的治疗出现了较多的问题。一批新的治疗方法的研究由此应运而生，传统的治疗方法也在不断的改进和发展。本文主要介绍包括药物治疗、细胞替代治疗和基因治疗在内的帕金森氏病的主要治疗方法和它们的研究进展。 关键词     帕金森氏症（PD），多巴胺（DA），干细胞（stem cell）基因治疗（gene therapy） 帕金森氏病简介     帕金森氏病又称震颤麻痹，是中老年人最常见的中枢神经系统慢性退行性疾病。其得名是因为一个名为帕金森的英国医生首先描述了这些症状，包括运动障碍、震颤和肌肉僵直。一般在50～65岁开始发病，发病率随年龄增长而逐渐增加，统计表明我国目前大概有170多万人患有这种疾病，并且男性患者稍多于女性。 病因及分类     病因不明。目前公认的病因是神经细胞的退行性病变，即黑质和纹状体里的黑质细胞数量减少和功能丧失致使多巴胺减少。动物实验和流行病学的研究认为帕金森氏病与遗传也有一定的关系。     根据发病原因，可分为两类，一类为原发性震颤麻痹，即找不到明确的原因或者发病原因可能跟遗传有关，称帕金森（氏）病。另一类为继发性的，因某种脑炎、中毒、脑血管病、颅脑损伤、脑肿瘤等引起，称帕金森（氏）综合征或震颤麻痹综合征。 症状     该病被戏称为“让人不能动的病”，病人主要有如下三大症状：     1、运动障碍 运动不能：随意运动启动困难 运动减少：自发运动减少，运动幅度减小 运动徐缓：随意运动执行吃力、缓慢，做重复动作时，幅度和速度均逐渐减弱 运动不协：平衡和协调能力下降     2、震颤 典型表现为静止性震颤，即病人在静止的状况下，出现不自主的颤抖，主要累及上肢，两手像搓丸子那样颤动。     3、强直 即肌肉僵直。若面部的肌肉发硬，可造成“面具脸”，若四肢和颈部的肌肉变硬，则造成 “慌张步态”。     随着病情的发展，日常活动出现困难，还会出现“开一关”作用。有的患者还可出现植物神经功能紊乱，也可出现忧郁和痴呆症状。 常规治疗     帕金森氏病是由于脑内黑质细胞减少从而多巴胺生产减少，苍白球异常活跃而引起的。目前的常规疗法主要有以下几种：     1.药物治疗    目前许多药物，包括美多巴、金刚烷胺、单胺氧化酶抑制剂等分别通过补充多巴胺、刺激多巴胺的生成或抑制多巴胺的分解，以缓解症状，但药物治疗存在副作用多和长期应用后药效衰减的缺点。     2.手术治疗    立体定向手术主要是针对苍白球的异常活动，通过手术方法降低异常活动的苍白球的兴奋性，达到缓解症状的目的。现在还可以进行深部电极的刺激（DBS），用一个电极来刺激剩余的神经细胞来加快产生多巴胺物质。但手术治疗有适合的人群和时机，还面临着其他一些脑部的慢性疾病的干扰而导致早期难以确诊。     3.针灸治疗     4.其他  理疗、功能锻炼等可起辅助治疗作用。 　  由于帕金森病的病因尚有争议，以上的方法对帕金森病的治疗都是控制症状，暂不能根治。但近年来出现了不少对该病的最终治疗很有希望的方法，包括细胞移植和基因治疗等方法。本文就拟对近年来出现的帕金森氏病的治疗方法作一个总结。 研究进展     帕金森氏症的多数症状是由于在脑黑质区域产生多巴胺的神经元变性或过早死亡造成大脑内的神经递质多巴胺缺乏所致。所以现在的大部分研究均集中在如何补充多巴类物质和激活、改造和补充产多巴胺能神经元的研究上，干细胞移植替代治疗是其中研究较热的领域，此外，基因治疗的研究也在进展中。 1.    药物治疗进展     多巴胺替代治疗尽管存在着副作用多和长期应用后药效衰减的缺点，但迄今仍是最为安全和有效的治疗手段。左旋多巴被脑组织提取后转化为多巴胺是临床应用最广的。现今的研究方向是将左旋多巴与另外几种可以减少左旋多巴副作用的药物一起使用，如脱羧酶抑制剂能阻断酶对左旋多巴的分解作用，这样可使剂量明显减少。阻断儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)则可帮助将左旋多巴顺利传输至大脑。     某些研究已证实高剂量左旋多巴可能损害残存的多巴胺能神经，因而能替代或减少左旋多巴剂量的药物如多巴胺激动剂在最近几年中用得越来越多。与左旋多巴比较，这些药物可以减少发生运动障碍的危险和“开一关”作用。许多专家主张对新诊断的病人使用多巴胺激动剂开始治疗，当病人的症状不再能控制时，再加用左旋多巴。2002年，两种新的多巴胺激动剂开始用于一些病人，发现比用左旋多巴者较少丧失多巴胺神经元。产生神经保护作用的药物尚处早期开发阶段，其后的目标是改善耐受性，减轻症状。而某些正在临床试验的药物“多巴胺”仍然是目标，开发它们的公司正在寻找不同的传输方式。另外一些公司正在试验非多巴胺能化合物，希望改变神经递质机制，这样能有利于帕金森氏症的治疗。谷氨酸盐和腺苷化合物像多巴胺一样，两者都与控制正常运动有关，均是研究开发的方向。     Lundbeck(荷兰)和Cophalon(美国)公司的CEP-1347 (Ⅲ期临床)通过细胞内信号途径奏效而不是一种神经递质。它是一种激酶抑制剂，通过阻断应激反应激活的蛋白质激酶途径产生效果。事实上是应激反应应答激活蛋白质激酶导致神经元死亡。证据提示通过抑制这一途径，CEP-1347能保护多巴胺神经元黑质免遭进一步损害。但近期这两个公司已宣布停止该药的研究，理由是无显著的临床效果，但该药的安全没有问题。 还有一系列有希望的药物正在研究开发之中，例如:     Schwarz(德国)的Rotigotine CDS处于Ⅲ期临床阶段，这是一种含多巴胺激动剂的皮肤贴剂，其作用是持续刺激多巴胺能系统，避免或延缓运动综合征。试验证明rotigotine能明显改善患者的运动性症状和日常活动。 Astra Zeneca(英国)的新的NMDA拮抗剂remacemide能降低谷氨酸盐通道过度的活性，谷氨酸盐通道活性过度是由多巴胺缺乏所引起，如不妥善处理则可导致神经细胞死亡。本品主要用于增强左旋多巴的效果并防止脑部退行性变。     Lundbeck (丹麦)和Teva(以色列)的甲磺酸雷沙吉兰（rasagiline mesylate）有不可逆阻断单胺氧化酶B的作用。该酶与脑多巴胺的代谢及摄人有关。可单独作用或与左旋多巴联合治疗,05年后已全面上市。     Neurosearch（丹麦）和Boehringer Ingelheim(德国)的单胺重摄入抑制剂NS2330，能增加多巴胺和去甲肾上腺素的活性，同时也激活其抑制机制以刺激乙酰胆碱在大脑皮层（包括感知部位）的释放。目前该药的I期临床工作已经完成。     Vernalis (英国)的腺苷A2A-受体拮抗剂VER-11135能缓解综合征症状，而无多巴胺相关的副作用。它还具有神经保护作用，可防止或减少神经细胞死亡。已开始临床试验。 图1.用于帕金森氏病细胞替代治疗的不同来源干细胞 2.细胞替代治疗进展     目前的研究主要集中在三种来源的干细胞，即胚胎干细胞、神经干细胞和间质干细胞，帕金森氏病模型动物的干细胞移植实验证实细胞替代治疗有缓解症状和恢复受损细胞功能的作用。 2.1胚胎干细胞     未分化的胚胎干细胞因其在体的全能性和体外的多能性首先被作为细胞移植的候选者，1998年胚胎干细胞的成功分离引起了公众对干细胞治疗的兴趣。为了保持其未分化状态，胚胎干细胞必须与饲养细胞共培养并且加入白细胞抑制因子。而它的直接分化还是十分困难。     在适当的条件下，胚胎干细胞可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。体外的多巴胺能神经元产生主要有两方面：遗传修饰和培养条件的控制。酪氨酸羟化酶（TH）是多巴胺合成的限速酶，可作为多巴胺能神经元的指示者。核受体相关受体因子 (Nurr1)缺陷型小鼠不能产生TH+ 中脑多巴胺能神经元暗示Nurr1过表达可促进干细胞的分化，该设想已在后来的实验中得到了证实。Pitx3是另一个中脑多巴胺能神经元群落存活和成熟的必要因子，并且与Nurr1相互协同作用。     当加入shh、FGF-8和维生素C并与PA6基质细胞共培养时，鼠干细胞分化成TH+神经元的比例显著增高（~90%），并且小鼠的旋转行为减少。除了PA6，当与鼠睾丸细胞共培养经三周的诱导后，90%灵长类胚胎干细胞抓转化为TH阳性并可在鼠类模型中存活两个月。人类胚胎干细胞也可在体或在体外诱导为多巴胺能神经元。07年的一篇指出，几个人类胚胎干细胞系可在一种无饲养细胞方法中分化为多巴胺能神经元，并在移植后表现出其特征。近几年来的研究主要集中在各种细胞因子和蛋白对ES的分化诱导和控制作用上，BMP、Noggin、GFAP、FGFs、MPTP等因子都被证明对ES的分化诱导和控制有重要作用。     胚胎干细胞是最有用的细胞移植来源，但它存在着可形成肿瘤和基因组改变两个缺陷，所以临床上必须定期观察，对Cripto的遗传修饰或抗体阻遏也可一定程度上抑制其转化为肿瘤。还可以用表达自杀基因的方法。 2.2神经干细胞（NSCs）     神经干细胞存在于中枢系统中用于自我更新并且只转化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，经过在终脑脑室的对称和不对称分裂迁移形成皮质，虽然在成年人脑中还存在神经干细胞，但由于其较差的分化潜能，只能外源输入神经干细胞用于治疗PD。有两种方法获得NSCs，一是悬浮培养，形成神经球，二是贴壁生长，两者都需要加入EGF 和/或 FGF-2。悬浮生长的神经球除了多巴胺能神经元，还包括了其他几种神经细胞，可以整合到脑中病存活五个月。培养条件的控制和遗传可以帮助NSCs的分化，FGF-20、Nurr1、Bcl-XL等均被报道可帮助诱导NSCs。此外，NSCs的另一个重要功能为可通过释放营养因子如GDNF（Glial cell line-derived neurotrophic factor）保护神经元的功能，在一个实验中，经GDNF和neurturin（另一种神经营养因子）转染的NSCs可存活几个月并且明显提高帕金森氏小鼠的运动能力，但为避免GDNF严重的副作用，GDNF必须直接连续的导入细胞核中。对在体和体外的多巴胺能减少，通过v-myc基因转移的人NSCs移植均可通过Bcl-2上游调节抑制细胞凋亡而起到神经保护作用。6-羟多巴胺损伤大鼠在NSCs移植后在营养因子分泌和神经细胞分化能力方面与对照组相比得到了显著的改善。通过TH和GTP环化水解酶1转化的人NSCs的移植也提供了PD动物模型的功能改善。     NSCs比ES细胞移植的范围更广、整合得更好，并且没有发生肿瘤的报道，但其载体的增殖和存活不如ES细胞。 2.3间质干细胞     骨髓干细胞因其易于分离和无伦理和技术问题是一种十分有希望的移植来源。骨髓基质干细胞（MSCs）因其转分化特性而可以分化为神经产生细胞。一些研究已表明骨髓衍生细胞可以通过血液循环进入鼠CNS分化为神经元，MSCs的纹状体内移植在旋转实验中取得了明显效果，并且细胞存活了四个月。TH工程化的MSCs移植的帕金森氏大鼠减少了旋转圈数并且TH基因表达效率提高到75%。所以，MSCs可以作为基因疗法的载体。并且与其他干细胞不同，MSCs可修复病变细胞和组织。     脐带血（UCB）也是一种移植用造血干细胞的来源，有骨髓中1/10的干细胞。人脐带血源CD133+造血干细胞经维甲酸处理可转分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。人非受限UCB来源体干细胞可以分化为在无血清培养基中有神经特性的细胞，该细胞可以表达包括En1, En2, Nurr1, Ptx3, Pax2, Wnt1, and Wnt3a在内的多巴胺能神经元发育和/或存活相关基因的转录物。从人脐带“华顿氏果胶”衍生的脐带基质干细胞（UCMS，umbilical cord matrix stem）是另一个MSCs来源。人UCMS细胞已在体外通过在神经元培养基（加入Shh、FGF-8）中逐步培养、诱导转化为多巴胺能神经元（12.7%的细胞为TH阳性）。在初步试验中未分化人UCMS细胞被移植入半帕金森氏大鼠脑中无免疫抑制的改善了阿朴吗啡诱导的旋转。     MSCs的自移植是防止免疫排斥的最好方法，并且它们可以十分方便的从外周循环迁移到脑部并在受损处聚集。UCB的另一个显著优点是难以找到匹配骨髓的病人可较容易的找到匹配的UCB。但MSCs不能像ES细胞那样易存活和有效。纯化和培养技术进一步提高可能会帮助抵消这些缺点。 2.4其他来源细胞     其他来源的干细胞包括胚胎生殖细胞和据认为多能的羊膜液源干细胞。已有体外实验将培养的人胚胎生殖细胞（hEG）诱导为TH阳性细胞，并且在受损小鼠脑中分化的hEG细胞可替代神经元。这些实验证明hEG细胞可能为移植提供细胞。人羊膜液源干细胞在体外稳定的表达多巴胺能标志物，包括对中脑多巴胺能神经元诱导和存活至关重要的Pitx3和Nurr1。高效液相层析分析表明在多巴胺能诱导克隆的羊膜液源干细胞提取液中多巴胺释放的证据。 2.5干细胞移植的免疫因素     干细胞移植的一个主要考虑的因素是免疫排异，尽管脑被认为是免疫豁免区，但在异体移植中还是出现了排异反应，好在已有很多针对异体移植的免疫抑制药物和方法。糖皮质激素是第一种用于移植的免疫抑制剂，尽管应用广泛，但选择性最差。并且还影响多种白细胞系，包括T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞和颗粒细胞。其他方法，如强力镇痉剂，病人很难耐受，而且会影响到移植细胞的有效性。有实验通过核转移将接受者体细胞核转移到卵母细胞形成胚胎干细胞，不仅可避免免疫反应，还解决了细胞来源的匹配问题。还有方法是将异源细胞放入微囊中导入，尽管该法效力还有待改进，但体外实验表明它的分化能力和未包被的胚胎干细胞相比没有明显降低。 表1.  用于临床移植干细胞的必需性质 3.基因治疗进展     基因疗法从一开始似乎就是瞄准临床的，目前大量的实验结果和数据已经见证了其飞速的发展，但很多基础的问题比起几年前还是没有得到更明确的。     从2003年起病毒导入法产生了许多对研究PD十分有价值的疾病模型，同时，基因疗法的在体和体外研究已在PD治疗中得到了广泛的研究。比如，体外基因疗法将经过基因修饰的原代细胞或细胞系植入PD患者，基因转移在这里的目标是提高细胞存活率，将其转换到多巴胺能表型或者在分泌营养因子的情况下提供营养支持。再如，在体直接将基因注射到无功能黒质细胞可以为多巴胺能神经元提供营养因子（最典型的为GDNF，可增加纹状体多巴胺合成和释放、保护多巴胺能神经元、帮助多巴胺能纤维生长）、纠正多巴胺产生缺陷（生化放大，例如TH、GTP-CH1、 AADC 、VMAT表达）、调整有害的细胞内通路（抗凋亡策略，如Bcl-2）和改变神经递质和功能恶化基底节环路中的电生理不平衡（例如GAD， glutamic acid decarboxylase）。     目前体外培养中的一系列实验已经证明用基因疗法导入的有保护性的神经营养因子的表达对原始的移植神经元的存活有重要作用。体外基因转导的理想细胞是易得、易存活、易转化、长期高表达、无致癌性质和无免疫原性质的细胞，原始神经元、肾上腺嗜铬细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞、斯旺细胞、成肌细胞和骨髓基质细胞各有长短，但目前有很多用基因疗法改造的研究很好的弥补了它们各自的缺点，取得了很好的结果。     在体基因疗法的研究用病毒载体直接将基因注入脑中的方法与细胞移植相比对纹状体影响更小，引起的免疫反应和肿瘤形成的可能性也较小。但另一方面，多巴胺能黒质细胞基因表达的效果会随着PD后期进行性的细胞死亡而减弱。理想的基因在体治疗病毒载体应有携片段大、易操作、特异高效转送和毒性小、稳定可控等特点，载体趋向性和启动子的选择对型特异性细胞表达也起着很关键的作用。目前有很多神经特异性的启动子，但都不能保证高表达。现在已应用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体，直接注射mRNA也得到了一定的成功。 结语 药物治疗仍是目前最安全和有效的治疗方式，新药物的不断涌现就体现了其强大的生命力，新的给药方法和药物配合使用是今后的发展方向。     尽管干细胞移植疗法十分有前景，但在用于帕金森氏症治疗上仍存在许多待解决的科学、临床和伦理问题。用于移植的干细胞也必须符合表1的标准。胚胎干细胞是最佳的来源，但伦理问题和致瘤风险阻碍了它的应用。NSCs和MSCs可从获得方便，也减少了排斥。长期培养导致基因组变化和表达修饰的变化会增加细胞生长失控的危险，所以细胞移植的安全性问题还需进一步研究。     包括神经营养因子和多巴胺替代的在体和体外基因疗法也已得到了很好的实践，尽管还存在引发自身免疫、激活内源病毒、插入突变等诸多安全问题，很多问题都可以寄希望于更有效的在体转基因调控，而锁定了目标蛋白后，副作用也会大大减少。基因调节的两个十分有前景的选择是四环素启动子和雷帕霉素系统。另一个需重点解决的问题是转基因的长期高效表达。GDNF和各种通路模型的研究甚至RNAi都可能为问题的进一步解决提供途径。 参考 1.Parish CL, Parisi S, Persico MG.et al. 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