芪丹通脉片对急性缺血再灌注大鼠心肌信号转导系统PI3K

芪丹通脉片对急性缺血再灌注大鼠心肌信号转导系统PI3K 芪丹通脉片对急性缺血再灌注大鼠心肌信 号转导系统PI3K 作者:李军昌，王宗仁，王跃民，王文，王文勇，王长海，姚菊峰 【摘要】 目的 观察中药芪丹通脉片对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡和细胞信号转导系统中磷脂酰肌醇 3激酶(PI3K)、丝(苏)氨酸激酶(Akt)和细胞外信号调节激酶(Erk1/2)的 影响 。 方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(模型组)和芪丹通脉片预处理组。生理盐水或芪丹通脉片灌胃7d后，大鼠麻醉开胸，结扎冠状动脉前降支40min，再灌注4h。伊文氏兰和TTC染色测定心肌梗死范围， 计算 梗死面积(IS)与缺血区面积(AAR)的比值(%, IS/AAR);TUNEL方法定性和定量检测心肌细胞凋亡指数;Westernblot测定信号蛋白的表达。结果 芪丹通脉片组的心肌梗死范围明显小于模型组[(?)% vs. (?)%，P 【关键词】 芪丹通脉片;再灌注;心肌;磷脂酰肌醇 3激酶;丝(苏)氨酸激酶;细胞外信号调节激酶 Effect of Qidan Tongmai Tablets on myocardial signal transaction PI3K/Akt and Erk1/in rats with acute ischemia reperfusion ABSTRACT: Objective To investigate the effect of Qidan Tongmai Tablet (QDTMT) on myocardium ischemia reperfusion injury and signal pathway phosphatidylinositol kinase (PI3K)/ serine/threonine kinase (Akt) and (the mitogen activated protEin kinase p42/4extra cellular signal regulated kinases (Erk1/2). Methods Male Sprague Dawley rats were divided into groups randomly: sham, ischemia reperfusion(model) and QDTMT treatment. The animals were anesthetized and open chest animals were subjected to0min mycardial ischemia followed byh reperfusion after administering saline in sham and model or QDTMT ford. The area at risk and infarct size were determined by Evan s blue and triphenyl tetrazolium chloride methods; cardiac myocyte apoptosis was determined both qualitatively and quantitatively by terminal deoxynucleotidyl transfease mediated dUTP by nick end labeling analysis methods. The expression of PI3K signaling cascade and Erk1/was determined by Western blotting analysis. Results The IS/AAR and apoptosis index were significantly attenuated respectively in QDTMT treated animals (?)%,(?)% vs. (?)%, (?)% in models (P KEY WORDS: Qidan Tongmai tablet; reperfusion injury; myocardium; phosphatidylinositol kinase; serine/threonine kinase; mitogen activated protEIn kinase p42/4extra cellular signal regulated kinase 缺血性心脏病本质的病理改变是缺血心肌细胞因缺氧而坏死 或凋亡，尽早恢复血液灌流是 治疗 缺血性心脏病的首要措施。然而， 再灌注损伤成为患者从缺血后复流获益的最大障碍。多种预适应方法 和后处理能够减轻再灌注损伤,而且这种保护作用与生存信号通路的活化相关[1]。 研究 表明，芪丹通脉片能够减少急性心肌梗塞面积，促进心脏功能恢复[2]。本研究旨在进一步观察芪丹通脉片在对急性缺血再灌注心肌的保护作用，及其对信号转导系统磷脂酰肌醇 3激酶(phosphatidylinositol kinase, PI3K)、丝(苏)氨酸激酶/(serine/threonine kinase, Akt)和细胞外信号调节激酶(the mitogen activated protein kinase p42/4extra cellular signal regulated kinase, Erk1/2)活性的影响。 1 材料与方法 实验动物 健康成年SD雄性大鼠30只，体重250-270g，由第四军医大学动物中心提供。 药品和主要试剂 芪丹通脉片浸膏干粉(黄芪30g、丹参30g、当归15g、红花30g、桂枝10g、生药/g干粉，配制成324g/L混悬液，第四军医大学科研药厂提供);原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司;PI3K、Akt、p Akts437、Erk1/2和pErk1/2均购自Cell Signaling公司。 心肌缺血再灌注模型的制备 按照 参考 文献 [3]的方法。雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉。颈部正中切口，分离气管并插入套管，行呼气末正压通气(空气通气量:20mL/kg，频率48-50次/min)。经右颈总动脉插入左心导管以测心功能参数。标准导联II心电图(RM6200多导生理记录仪，成都仪器设备厂)。在胸骨左侧约处从第3至5肋纵行切口开胸，剪开心包，暴露心脏，以左 冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2mm处用无创小圆针穿过左冠状动脉左前降支根部下方的心肌表层，穿5 0线，将缝合线穿过小硅胶管后备用;待心电图恢复稳定10min后记录正常参数。在硅胶管远端的收紧缝合线至硅胶管形成弓状并固定，以阻断左前降支阻断血流造成缺血，以心电图ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功指标，缺血40min，松解并除去硅胶管和多余缝合线，恢复左冠状动脉前降支实现血再灌注，逐层缝合胸壁,恢复自主呼吸。 实验 将大鼠随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组和芪丹通脉片处理组。假手术组，动物开胸，冠脉下穿线但不结扎。模型组和假手术组均给予生理盐水[10mL/(kg?d)]灌胃，芪丹通脉片处理组给予芪丹通脉片浸膏混悬液灌胃[/(kg?d),10mL/(kg?d)]。第7天，灌胃完成30min后开始造模。 心肌梗死范围的测定 实验结束时，重新结扎包绕冠状动脉左降支，经颈动脉快速注入 10g/L伊文氏兰染色区分缺血区和非缺血区(显示为兰色),置于-20?冻存20min后在结扎线以下，以心脏长轴等份4-5份，切片，经10g/LTTC(triphenyl tetrazolium chloride)37?孵育30min区分坏死区呈不着色，缺血区呈砖红色，数码摄像，通过Optimax图象处理软件进行 分析 ，并计算梗死面积(infarct size, IS) 与缺血区面积(area at risk, AAR)的比值(%, IS/AAR) TUNNEL法检测心肌细胞凋亡情况 再灌注结束，迅速剪下心脏，置于冰的PBS中洗净残血，分离左心室前壁缺血区，40g/L的多聚甲醛固定12h，石蜡包埋。 应用 TUNEL凋亡检测试剂盒，严 格按照原位细胞凋亡检测试剂盒(POD)说明书进行操作。以已知阳性切片作为阳性对照，在染色过程中用PBS代替TdT反应液作为阴性对照。每张切片于缺血部位随机选取8个高倍视野，分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，并进行汇总，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数( apoptotic index, AI)，AI=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%。 Westernblot测定信号蛋白的表达 取心肌的缺血区，置于液氮中冻存后转至-70?存放。称取冻存心肌样品，冰浴，加入500μL组织裂解液[4]，冰浴匀浆，4?，12000离心10min，收集上清，应用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce, UK)进行蛋白定量。其余样品用4×上样缓冲液稀释，封闭后100?水浴10min，-70?保存。以每个样品的总蛋白为20μg上样，进行SDS PAGE凝胶电泳(浓缩胶为8%，分离胶为12%)，转膜至PVDF(invitrogen)，脱脂奶粉封闭，一抗封闭4?过夜，二抗37?孵育1h(羊抗兔)，漂洗后用增强化学发光法检测蛋白表达，自动扫描，进行灰度分析。 统计学处理 数据均以均数?标准差表示，应用软件进行数据统计。组间比较应用方差分析，以P 2 结果 .1 芪丹通脉片对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响 芪丹通脉片预处理组缺血再灌注后心肌梗死面积为(?)%，而缺血再灌注组的梗死面积为(?)%，二者之间差异有统计学意义(P .2 芪丹通脉片对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响 在假手术组中，很少有心肌细胞被染色;而在缺血再灌注组和芪丹通脉片预处理组均可见到凋亡的 阳性细胞，但后者的凋亡细胞明显减少，其凋亡指数分别为(?)%和 (?)%，二者比较差异有统计学意义(P转贴于联盟 .3 芪丹通 脉片对PI3K/Akt和Erk信号通路活化水平的 影响 通过检测芪丹通 脉片预处理对缺血再灌注大鼠心肌PI3K、Akt、pAkt、Erk1/2、pErk1/2 表达的影响(图1)，发现芪丹通脉片组中PI3K、Akt、Erk1/2的表达 水平与假手术组、模型组中的比较无显著性差异(图2)，但pAkt、pErk 的表达明显增加，与模型组比较pAkt、pErk1/2分别增加了倍和倍 [(?)au vs.(?)au，P 图1 大鼠心肌PI3K、Akt、pAkt、Erk、 pErk1/2 免疫印迹结果 The representative immunoblots of PI3K, Akt, pAkt, Erk, and pErk1/2 Lane A: sham; Lane B: model; Lane C: Qidan Tongmai tablet treatment 图2 PI3K、Akt、Erk蛋白的表达水平 arbitrary units (au) for the expression level of PI3K, Akt and Erk Lane A: sham; Lane B: model; Lane C: Qidan Tongmai tablet treatment 3 讨论 凋亡是缺血/再灌注导致心肌损伤、心肌细胞丢失的重要病理机 制之一[5]。通过某种 方法 ，减少再灌注心肌细胞的凋亡有助于心 肌梗死范围的减小和心肌功能的恢复[6]。 PI3K/Akt和Erk1/2是重要 的与心肌细胞存活相关的信号通路，被称为再灌注损伤存活激酶通路 (reperfusion injury salvage kinase pathway, RISK pathway)[1]。 研究 表明，缺血预处理、缺血后处理、胰岛素、胰岛素样生长因子等多种干预方法能够减少缺血再灌注心肌细胞凋亡，抑制心肌损伤;而这些保护方法均能够活化PI3K/Akt[4，7 9]或MEK1/2 Erk1/2[10 12]信号瀑布相关蛋白，募集和磷酸化一系列底物，包括eNOS、参与糖和蛋白代谢调节的GSK3β、GLUT4以及抗凋亡蛋白(Bcl 2、Bad、Bax、Caspase)等，抑制线粒体细胞色素C的释放，阻断凋亡的发生;而当 应用 特异性信号通路阻断剂抑制PI3K/Akt或Erk1/2及其某些底物磷酸化水平时，则上述的保护作用被减弱;在显性负突变Akt小鼠体内的这种保护作用也被明显抑制[9]。根据以上研究结果，可以推测:通过活化PI3K/Akt和Erk1/2信号通路的介导，某种预处理或后处理措施活化下游抗凋亡分子，能够抑制再灌注心肌损伤。因此，PI3K/Akt和Erk1/2作为 治疗 新靶点日益受到关注[1,13]。芪丹通脉片能够抑制急性缺血所致的心肌损伤[3]。我们的研究证实芪丹通脉片预处理能够减轻再灌注所致的损伤，缩小心肌梗死的范围，抑制心肌细胞的凋亡，与模型组比较均存在统计学差异(P 基金项目:陕西省中医管理局资助项目() 【 参考 文献 】 [1]Hausenloy DJ, Yellon DM. New directions for protecting the heart against ischemia reperfusion injury: targeting the reperfusion injury salvage kinase(RISK) pathway [J]. Cardiovasc Res,004,1(3):448 460. [2]李晶华,王宗仁,卲中军,等. 芪丹通脉片对实验性急性心肌梗 死大鼠心肌的保护作用及其分子机制 [J]. 中国 临床康 复,004,(9):1706 1707. [3]严晓红，汪长华. 心肌缺血/再灌注损伤模型的制备 [M]. 朱 妙章，袁文俊，吴博威,等. 心血管生 理学 与临床. 北京:高等 教育 出版社,004:33 635. [4]Gao F, Gao E, Yue TL, et al. Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia reperfusion: the roles of PI3 kinase, Akt, and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation [J]. Circulation,002, 105:1497 1502. [5]Eefting F, Rensing B, Wigman J, et al. Role of apoptosis in reperfusion injury [J]. Cardiovasc Res,004,1(3):414 426. [6]Scarabelli TM, Gottlieb RA. Functional and clinical repercussions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/reperfusion injury: old and new concepts after 10 years of contributions [J]. Cell Death Differ,004, 11(Suppl):S144 152. [7]Raphael J, Abedat S, Rivo J, et al. Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling and modulation of Bcl family protEins [J]. J Pharmacol Exp Ther,006,18(1):186 194. [8]Zhu M, Feng JH, Lucchinetti E, et al. Ischemic post conditioning protects remodeled myocardium via the PI3K PKB/Akt reperfusion injury salvage kinase pathway [J]. Cardiovasc Res,006,2(1):152 162. [9]Fujio Y, Nguyen T, Wencker D, et al. Akt promotes survival of cardiomyocytes in vitro and protects against ischemia reperfusion injury in mouse heart [J]. Circulation,000, 101:660 667. [10]Li DY, Tao L, Liu H, et al. Role of ERK1/in the anti apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion [J]. Apoptosis,006, 11(6):923 930. [11]Darling CE, Jiang R, Maynard M, et al. Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts: role of ERK1/[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,005,89(4):1618 1626. [12]Hausenloy DJ, Tsang A, Mocanu MM, et al. Ischemic preconditioning protects by activating pro survival kinases at reperfusion [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,005,88(2):971 976. [13]Cannon RO. Mechanisms, management and future directions for reperfusion injury after acute myocardial infarction [J]. Nat Clin Pract Cardiovasc Med,005,(2):88 94. [14]龙铟，王宗仁，马静，等. 芪丹通脉片对大鼠血栓形成及 血液粘度的影响 [J]. 微循环学杂志,006,16(1):37 39. [15]王宗仁,李军昌,马爱玲,等. 芪丹通脉片对实验性动脉粥样 硬化大鼠单个核细胞细胞间黏附分子 1、血管细胞黏附分子 1 mRNA表达的影响 [J]. 中国临床康复,005,(27):77 79. [16]谢娟,王宗仁,王磊,等. 芪丹通脉片对急性心肌缺血大鼠降 钙素基因相关肽和内皮素的影响 [J]. 第四军医大学学 报,006,7(6):562 564. 转贴于论文联盟