抗生长分化因子9抗体对化疗所致大鼠卵巢损伤的保护作用的研究

抗生长分化因子9抗体对化疗所致大鼠卵巢损伤的保护作用的研究 抗生长分化因子9抗体对化疗所致大鼠卵巢损伤的保护 作用的研究 南方医科大学级硕士学位论文 抗生长分化因子.抗体对化疗所致大鼠卵巢损伤的 保护作用的研究 . 课题来源:广东省科技项目 业 名 专 称 妇产科学 肖苑玲 学位申请人 指 导 教 师 何援利教授 答辩委员会主席 王沂峰教授 张晓薇教授 答辩委员会成员 谢梅青教授 论文评阅人 李洁教授 副教授 李志刚 彭冬先副教授 年月 日 广州硕士学位论文 抗生长分化因子.抗体对化疗 大鼠卵巢损伤的保护作用的研究 硕士研究生:肖苑玲 指导教师:何援利教授 摘 要 研究背景 ,是指月经初潮年龄正常或青 卵巢功能早衰 春期延迟、第二性征发育正常的女性在岁之前出现持续性不可逆性闭经 个月,伴高促性腺激素状态:血清卵泡刺激素/及雌二醇 /,并出现雌激素缺乏的症状:如性欲减退、潮热、出汗、骨质疏松、 闭经等,甚至导致不孕。据统计,岁以发生率为%,岁以前发生率 为/。原发性闭经中占%~%,继发性闭经中占%~%。卵巢早衰 具体的发病机制尚不清楚,其可能的原因包括:?相关基因异常:如染色体的 缺失、易位和点突变等;?免疫因素:据统计,大约%%的与免疫因 素有关。自身免疫性患者常合并其他自身免疫性疾病,如阿狄森 氏病,系统性红斑狼疮等;?感染:如盆腔炎、流行性腮腺炎病史,风 疹、麻疹病毒感染史等;?酶缺陷:研究证实.【羟化酶及,碳链裂解酶等 箔体激素合成关键酶的缺乏与相关;?医源性因素:如放疗、化疗等;?农 药等毒物接触史,吸烟、吸毒等;?心理因素;?其他。 随着化疗药物的广泛应用,许多恶性肿瘤和自身免疫性疾病患者的病情得 到控制或缓解,寿命延长。但年轻女性患者面临的一个问题是化疗本身引起 的 卵巢损伤,可导致患者出现潮热、骨质疏松、闭经等低雌激素症状,甚至导致 ,引起不孕,给患者带来一系列生理、心理、社会问题。如何减轻或预防化中文摘要 疗所敛的卵巢损伤,成为目前研究的热点。化疗引起卵巢损伤的具体原因尚不 清楚,可能的机制为化疗药物损伤卵巢颗粒细胞及卵母细胞,导致颗粒细胞凋 亡及卵母细胞闭锁。研究发现,细胞有丝分裂越活跃,化疗药物对其杀伤性越 大。化疗引起卵巢损伤主要与化疗药物的种类、剂量、累积剂量及患者年龄等 相关。引起卵巢损伤最主要的药物是烷化剂,烷化剂中主要是坏磷酰胺。 化疗药物的剂量及累积剂量越大,对卵巢的损伤越严重。患者年龄越小越不容 易发生,其导致所需的化疗药物剂量也越大。 预防或减轻化疗导致的卵巢损伤,缓解由于低雌激素导致的潮热、出汗、 烦躁、骨质疏松等临床症状,目前临床上主要的方法有:?药物:如促性腺激 素释放激素类似物.、口服避孕药等。?冷冻技术:包括冷冻胚胎、冷 冻卵母细胞和体外成熟、冷冻卵巢及移植等。而目前尚无特别有效、安全及可 长期使用的方法。目前临床上常用.预防化疗引起的卵巢损伤,但对已经 造成的损伤则没有作用,且长期使用有较重的并发症,价格较贵也限制了它 的 临床应用。补充性激素是目前临床最常用的方法,但雌激素在某些激素依赖性 肿瘤中的应用受到限制:如乳腺癌、子宫内膜癌等。冷冻保存技术尚不成熟, 目前主要是处于研究阶段。 ,.是由卵母细胞分泌 生长分化因子. 的细胞因子糖蛋白。大量研究证实其在卵泡的发育过程中起着不可缺少的作 用。卵泡发育分为不依赖促性腺激素阶段和依赖促性腺激素阶段:从始基卵泡 到初级卵泡窦前卵泡,此阶段不受生殖激素的调节,以后则在促性腺激素及 箔体激素的作用下发育成为成熟卵泡,而.主要在前一阶段起作用。. 能通过旁分泌方式对卵泡的生长和分化起着重要的作用,促进卵母细胞的正常 生长及有丝分裂。有研究发现,将人卵巢上皮组织培养于存在或缺少重组小鼠 .的培养基中,一周后发现加入了重组.的培养基中的卵泡有%达到 第二阶段,同时发现卵泡的活力也有所增强,而对照组仅%达到第二阶段。另 有研究证实,.在体外可使人类卵巢组织中大量始基卵泡生长启动,减少卵 泡闭锁,促进卵泡存活。 等研究发现,直接给母猪卵巢注射猪的.硕士学位论文 基因片段,可促使卵泡发育,初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡的数量增加,原 始卵泡数量减少。通过干扰技术,体外阻断窦前卵泡向窦状卵泡过渡期 .的表达,发现窦前卵泡的基础发育及诱导的发育均受阻。一基因 敲除的小鼠卵泡受阻在初级卵泡阶段,不形成优势卵泡,无法排卵,导致不 孕。 等发现,卵母细胞分泌的.的活性可被特异性抗.抗体 ...中和,使卵泡停滞在初级卵泡阶段,而不引起卵泡闭锁。目前, .与的关系成为研究热点。有报道在患者中发现了.基因的点 突变,有理由认为.突变可能是的发病原因之一。 化疗的细胞毒性常作用于分裂增殖期的细胞,处于静止期的卵泡可防止受 损害。化疗药物中以烷化剂最容易引起卵巢损伤,而烷化剂中以最具有代 表性,在体外无活性,磷酰胺氮芥,为其最终代 谢产物,具有体外活性。为此,本研究采用作为引起体外培养大鼠卵巢损伤 的药物,建立体外培养大鼠卵巢损伤的模型,在给予的同时加入抗.抗 体中和.,观察是否可使卵泡发育停滞在早期阶段,阻止原始卵泡向成熟卵 泡转变,使卵巢中的卵泡尽可能多的处于对化疗药物低敏感的状态,从而减 轻 化疗对卵泡的损伤。 第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥 的适宜剂量 目的: 观察不同剂量的磷酰胺氮芥,引起体外培养大鼠 卵巢结构和内分泌功能损伤的情况,确定一个适宜浓度,作为建立体外培养 大 鼠卵巢损伤模型的剂量,并用于下一步的实验研究。 方法: 无菌条件下分离大鼠卵巢。实验分为组,正常对照组及实验、、组。每中文摘 要 组个卵巢,来源于出生周的大鼠体重~ 。组均先只加入 培养基.%./ %%双抗,后更换全液, 实验、、组培养基中分别加入浓度为/、,/、/的磷酰胺氮 芥,萨常对照组培养基中不含,培养后均隔天全量更换不含的 培养基即作用,共培养即加入的。在加入前及加入后 、时更换的培养基用放射免疫法测定其雌二醇浓度。加入 时取出大鼠卵巢,染色,显微镜下计数各级卵泡总数。 结果: .浓度: 加入前个组浓度差异无统计学意义.,.;两 两比较差异均无统计学意义.。 加入,个组浓度比较差异有统计学意义.,.。 组间两两比较差异也均有统计学意义.,其中个实验组浓度 .. /;../;.. /均低于正常对照组 .. /,且剂量越大,浓度降低越明显。 加入,个组浓度比较差异办有统计学意义., .。组问两两比较差异也均有统计学意义.,个实验组浓度 .:. .. /均低于『常对照组 /; /;.. .. /。同样,剂量越大,浓度降低越明显。 .卵泡总数:加入,组比较各级卵泡总数差异均有统计学意义 .,.。组问两两比较差异亦均有统计学意义尸.,其 中个实验组的各级卵泡总数.:.个;..个:..个 均较正常对照组.士.个少,且剂量越大,各级卵泡总数减少越 明显。 硕士学位论文 结论: 种不同浓度的均可导致本实验的浓度下降和各级卵泡总数减少, 与正常对照组比较差异均有统计学意义,且剂量越大,大鼠的卵巢结构及内 分泌功能损伤越重,即浓度下降及各级卵泡总数减少越明显,故我们选择了 个剂量中最低的浓度??‖作为建立体外培养大鼠卵巢损伤模型的 适宜剂量,并用于下一步的实验研究。 第二部分 抗生长分化因子.抗体对所致大鼠卵巢损伤的治疗 作用的体外实验研究 目的: 探讨抗生长分化因子.抗体..对化疗所致的体外培养大鼠卵巢 损伤是否具有治疗作用。 方法: 实验分为组,共个卵巢只大鼠,其中:?正常对照组 的生理盐水; 个;组个;?生理盐水组个:加入含。/ ?抗体组个:先钿/的,后./。下 常对照组和生理盐水组培养基中不含。均为单次给药,作用后组均隔 天全量更换不含的培养基或生理盐水。正常对照组、组、生理盐水组 的卵巢共培养,而抗体组有个卵巢培养,.卵巢培养。培养 及时按上述要求分别取出标本,染色,显微镜下计数各级卵泡总数。 结果: .培养, 组各级卵泡总数比较差异有统计学意义., .。抗体组各级卵泡总数与其他组比较差异均有统计学意义 .,其中抗体组各级卵泡总数..个少于平常对照组 中文摘要 . .个,但较组..个和生理特水组.士.个 多。 抗体组培养各级卵泡总数..个与培养.. 个比较,差异无统计学意义.,.。 结论: 体外培养大鼠卵巢,抗体组的卵泡总数虽较组多,但仍少于正 常对照组,差异有统计学意义。且抗体组随着培养时『白的延长从天到 天,各级卵泡总数的差异并无统计学意义,说明卵巢功能没有恢复。实验 提示我们加入后再加入..并不能减轻所致的体外培养大 鼠卵巢功能的损伤,根据统计结果,尚不能得出有治疗作用的结论,但因样本 量较小,增加样本量是否得出同样的结论,尚需进一步的研究。 第三部分 抗生长分化因子.抗体对化疗所致体外培养大鼠卵巢 损伤的保护作用的实验研究 目的: 从大鼠卵巢结构和内分泌功能的改变,进一步探讨..对化疗所致 的体外培养大鼠卵巢损伤是否具有保护作用,为体内实验和临床试验提供理 论 依据。因上述实验抗体组是在加入后方加入抗体,经统计学分析, 抗体组对化疗所致的体外培养大鼠卵巢损伤的治疗作用不明显。下步的实 验结合抗体的中和作用原理,先加入抗体..,用于中和卵母细胞分泌的尘长 分化因子 .,后再加入, 观察能否使卵泡停滞在早期发育阶段,从而减轻化疗对体外培养大鼠卵巢的 损 伤,起到保护作用。 硕士学位论文 方法: 无菌条件下收集大鼠的卵巢,共个只大鼠,随机分为组, 每组个卵巢:?正常对照组;组:加入/的;?实验组:在 给予前加入..。.常对照组与组先只加入培养基, 实验组另在培养基中加入?/。培养后均全量更换培养基, 其中正常对照组仍只加入培养基,组和实验组均另在培养基中加入 /的,后组均隔天全量更换不含的培养基即只作用 ,共培养即加入的。在加入前及加入、、时每 组各时间点均分别取出个大鼠卵巢,用染色、切片,显微镜下计算各级卵 泡总数;另外,在上述的各时间点将更换下来的培养基用放射免疫法测量其 浓度。 结果: .浓度: 加入前,组浓度差异无统计学意义.,., 两两比较差异也均无统计学意义尸.。 加入, 组浓度差异均有统计学意义.,.。 其中实验组.. /和讵常对照组.. /差异无统 计学意义.,而实验组浓度明显高于组.. /,有显 著性差异尸.。 加入,组浓度差异仍有统计学意义.,.。 其中实验组浓度.. /, /明显高于组.. 有显著性差异.。而实验组浓度和正常对照组.:. / 比较,差异无统计学意义仁.。 加入,组浓度差异均有统计学意义.,.。 其中实验组浓度.. /高于组../,差异 有统计学意义.;而实验组浓度和正常对照组../ 比较,差异无统计学意义尸.。 中文摘要 .卵泡总数: 加入前,组各级卵泡总数差异无统计学意义.,.。 加入,组各级卵泡总数差异有统计学意义.,.。 两两比较卵泡总数差异均有统计学意义.,其中实验组各级卵泡总数 .士.个多于组.士.个,但少于『常对照组.士. 个。 加入,各级组卵泡总数差异有统计学意义.,.。 其中实验组各级卵泡总数.士.个与正常对照组.士.个比 较差异无统计学意义.,而实验组各级卵泡总数明显多于组 .士.个,有显著性差异.。 加入,组各级卵泡总数差异办有统计学意义., . .。其中实验组各级卵泡总数.士.个与正常对照组.士 个比较差异无统计学意义.,而实验组各级卵泡总数多于组 ..个,差异有统计学意义肚.。 结论: 体外实验,在加入入..,能减轻所致体外培养大鼠 卵巢损伤所引起的浓度降低和各级卵泡总数的减少,经统计分析,与组比 较差异均有统计学意义,而与正常对照组比较差异均无统计学意义。因此, 一对所致体外培养大鼠卵巢损伤具有一定的保护作用。但本实验采 用的化疗药物剂量较小,在较大化疗剂量的情况下能否减轻化疗对大鼠卵巢 的 损伤;体内实验是否还会具有同样的结果,尚需进一步研究。另外,由于种属 差异,本研究结果是否适用于人类也有待于进一步研究。 关键词:抗生分化冈子.抗体; 人鼠; 磷酰胺氮芥; 化疗; 卵巢损伤 硕士学位论文 :? 骶 , ??? .: :. , / / . :, ,,,, % % ,. % %.% . % .,, : : % % ;: ,, ;:: ;??一一. 垒呈兰坠垒曼 ,. .. . .. .. . ? :: , ?, , ;趸 . . . , . . . ,. . . 一..一 硕士学位论叉一 .. . . , . . . 一 ,??, .. . , .. . / .一 ., 。 /. /: .:, , . . . , %% %./ ??.. 垒里兰垦垒竺, . ,, / ,.. , .. .:尸.... .士./;.士./; .士./ .士. /.,尸...士. .士. /; /;.士. /.. /.至.. .士.;.士.:.. . 士. .: 硕士学位论文 , ,? , . , . . /..一 /?一./ . , .? . . . , : .. .. .士.. . .. ... ?.: .士. ...... . . . ? ?? 垒竖兰垒里 , . , .,. ?/. / . . . ? . ,,, , .: 尸.. ,.. / .. /., .. /. ... . / . / 卢?..士./肛.. .. / .. /.,.士. /..喜 ...士., .:. . .:. . .硕士学位论文 尸:.,.... ...尸., . .: .士.仁. .. ’? / .. 一一 . ’ . .: 一;; ;; ?硕士学位论文 目 录 摘 要?. 肓订 日 ’言舌第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适 宜剂量. 一、目的和意义? 二、材料和方法? 三、结果? 四、讨论.. 五、结论? 参考文献? 第二部分抗生长分化因子.抗体对所致大鼠卵巢损伤的治疗作用的体外 实验研究??. 一、目的和意义.. 二、材料和方法.. 四、讨论。 血、结论? 第三部分抗生长分化因子.抗体对化疗所致体外培养大鼠卵巢损伤的保护作 用的实验研究. 一、目的和意义? 二、材料和方法.. 四、讨论.. 血、结论. 参考文献.. 综述?.目 录 在读期间发表论文?. 致 谢?. 学位论文原创性声明. 统计学证明?. 硕士学位论文 ?厶?. 日 吞 化疗是治疗恶性肿瘤和自身免疫性疾病的重要手段。随着化疗药物的广泛 应用,使得恶性肿瘤和自身免疫性疾病患者的预后明显改善,生命延长。但是 化疗药物对细胞的杀伤作用是非特异性的,在杀伤肿瘤细胞的同时也会损伤正 常的组织细胞。因此,年轻的女性患者面临的一个重要问题就是化疗药物对卵 巢的损伤,这种损伤经常是不可逆的,甚至导致卵巢早衰 ,,临床上表现为潮热、出汗、闭经、阴道干涩、骨质疏松等低雌 激素症状,继而导致不孕,给患者带来一系列生理、心理、社会问题,严重影 响患者的生活质量。近年来,恶性肿瘤呈年轻化趋势,且自身免疫性疾病好发 于年轻女性,据文献报道,年每个成人中就有人在儿章期或青春期进 行过肿瘤治疗。故如何预防或减轻化疗引起的卵巢损伤,成为科研工作者和临 床医生关注和研究的重点。 化疗引起卵巢损伤的具体原因尚不清楚,可能与卵巢颗粒细胞凋亡及卵母 细胞闭锁有关。目前,临床上尚无特别安全有效的方法可以防治化疗所致的卵 巢损伤。天然促性腺激素释放激素是下丘脑肽能神经元分泌的肽激 素,主要通过垂体门脉系统刺激垂体自百叶细胞合成卵泡刺激激素黄体生 成激素。通过改变第位和第位氨基酸得到促性腺激素类似物 .,其生物效应较天然提高~倍。研究发现,化疗药物对发 育中的卵泡损伤远远大于原始卵泡。.可逆性抑制下丘脑.垂体.卵巢轴, 阻止原始卵泡向成熟卵泡转变,使卵巢中的卵泡尽可能多的处于对化疗药物低 敏感的状态,从而减轻化疗对卵巢的损伤。目前在临床上应用.主要用于 预防化疗引起的卵巢损伤,但对已经造成的卵巢损伤则没有作用,且长期应用 可出现较重的并发症,主要是神经一内分泌功能紊乱,表现为潮热、性情急躁、 性欲减退、骨质疏松等,另外价格较昂贵也限制了它的临床应用。补充性激素 可以部分改善患者的雌激素低下症状,但不适合雌激素依赖性疾病的患者,如 乳腺癌、子宫内膜癌患者,且不能预防化疗对卵巢的损伤及不能解决患者的生前言 育问题。胚胎、卵母细胞、卵巢组织的冷冻保存目前尚属于研究阶段,亦不能 有效地解决患者的生育问题。 .,.是由卵母细胞分泌的 生长分化因子. 生长因子,己证实其在卵泡的发育中起着非常重要的作用。卵泡的发育分为不 依赖促性腺激素阶段和依赖促性腺激素阶段:从始基卵泡到初级卵泡窦前卵 泡,此阶段不受生殖激素的调节,以后则在促性腺激素及甾体激素的作用下 发 育成成熟卵泡。.主要是在从始基卵泡到初级卵泡的发育阶段起作用,它能 通过旁分泌方式对卵泡的生长和分化起着重要作用,促进卵母细胞的正常生 长 及有丝分裂。.在体外可使人类卵巢组织中大量始基卵泡生长启动,减少卵 泡闭锁,促进卵泡存活。有研究发现将人卵巢上皮组织培养于存在重组小鼠 .的培养基中,一周后发现与培养基中不加重组小鼠.的对照组比较, 可使较多的卵泡达到第二阶段,且卵泡的活力也有所增强。 等研究发 现,直接给母猪卵巢注射猪的.基因片段,可促使卵泡发育,初级卵泡、次 级卵泡、成熟卵泡的数量增加,原始卵泡数量减少。通过干扰技术,体外 阻断窦前卵泡向窦状卵泡过渡期.的表达,发现窦前卵泡的基础发育及 诱导的发育均受阻。.基因敲除的小鼠卵泡受阻在初级卵泡阶段,不形成优 势卵泡,无法排卵,导致不孕。目前,.与的关系成为研究的热点。有 报道在患者中发现了.基因的点突变,有理由认为.突变可能是 的发病原因之一。等发现,卵母细胞分泌的.的活性可被特异 性抗.抗体...中和,使卵泡停滞在初级卵泡阶段,而不引起卵 泡闭锁。同时发现/的...可中币%的.促进卵母细胞有 丝分裂的活性。而目前尚未见抗生长分化因子.抗体..与化疗引起 的卵巢损伤的相关性报道。 化疗药物中以烷化剂最容易引起卵巢损伤,而烷化剂中以最常用, 在体外无活性。为此,本研究采用其具有体外活性的代谢终产物磷酰胺氮芥 ,作为引起体外培养大鼠卵巢损伤的药物。本研究先 是探索引起体外培养大鼠卵巢损伤的适宜浓度,然后用于建立体外培养大鼠 硕士学位论文 卵巢损伤的模型,在给予的同时加入.一中和.的作用,观察能 否减轻或治疗化疗所致体外培养大鼠卵巢的损伤。..的剂量依据 的研究,采用/。 在本研究的第一部分,通过大鼠卵巢结构和内分泌功能的变化,观察不同 剂量的磷酰胺氮芥对体外培养大鼠卵巢的损伤情况,确定一个适宜的 浓度,作为建立体外培养大鼠卵巢损伤模型的剂量,并用于下一步实验。第二 部分,探讨..对适宜剂量的所致的体外培养大鼠卵巢损伤是否具有 治疗作用。第三部分,结合抗体的作用原理,先加入..中和一, 后再加入,观察能否使卵泡发育停滞在早期阶段,从而减轻化疗对体外培养 大鼠卵巢功能的损伤,起到保护卵巢功能的作用,为体内实验和临床试验提 供 依据。第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适宜剂量 第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的 磷酰胺氮芥的适宜剂量 一、目的和意义 观察不同剂量的磷酰胺氮芥,引起体外培养大鼠 卵巢结构和内分泌功能损伤的情况,确定一个适宜浓度,作为建立体外培养 大 鼠卵巢损伤模型的剂量,并用于下一步的实验研究。 随着化疗药物的广泛应用,许多恶性肿瘤和自身免疫性疾病患者的病情得 到控制或缓解,寿命延长,但化疗也带来一系列问题,其中一个主要的问题就 是引起卵巢功能的损伤甚至衰竭,临床上表现为一系列雌激素低下症状甚至 导 致不孕,严重影响患者的生活质量。化疗药物中以烷化剂最容易引起卵巢损 伤, 其中以环磷酰胺最常用。在体外无活性,为其最终代谢产物, 具有体外活性。引起体外培养大鼠卵巢损伤所需的适宜剂量,目前鲜有报道, 故本实验探索该适宜的剂量,用于下一步的实验。 二、材料和方法 一实验材料 .实验动物:出生周:同皇侗级近交系雌性大鼠体重 ,购 、粤监证字 自中山大学医学院实验动物中心,许可证号:嗯. 。 .主要实验设备: 设备 型号 生产地 实验动物手术台 深圳 德国 恒温水浴箱 .. 超净工作台 上海 法国 加样枪 .一 美囤 培养箱 硕士学位论文 . 同本 倒置显微镜同本 佳能照相机 德国 电子分析天平 . 同本 高压蒸汽消毒器 美国 孔培养板 美国 滤器 同本 普通显微镜 德国 低温离心机 . 上海 放射免疫计数器 同本 解剖显微镜 青岛 海尔 冰箱 .主要实验试剂 生产公司 试剂 吉诺生物技术有限公司 .培养液 杭州四季青生物工程材料有限公司 胎牛血清 珠海丽珠制药集团 尿促性素 广州威佳试剂公司 体系胰岛素.转铁蛋白.硒 美国国立癌症研究所 广州威佳试剂公司 双抗 北京北方生物技术研究所 试剂盒 珠江医院 %水合氯醛第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适宜剂 量 溶液 使用保存于.?冰箱中。按计算好的每组用药量用电子分析天平称 重,。的温生理盐水完全溶解后用.孑径的过滤器过滤,使 溶液中分 另含 、、肛的。 培养基 ? . . 生理盐水溶解,共含. 体系 双抗 根据各组剂量,分别含.、、. ,正常对照组用等量生理盐水代替 二实验方法 .实验分组 实验分为组,下常对照组和个实验组,每组个大 鼠的卵巢。实验分组是根据医学统计学第二版孙振球主编附表中的随机数 字表进行随机分组。实验组的用药量参考相关文献?,培养基中浓度分别 为/、/、/,正常对照组培养基中不。 .大鼠卵巢的分离 高压蒸汽消毒手术器械,?温箱中烘干。用紫外线 消毒实验动物手术台半小时并打开鼓风机。戴口罩和帽子,用肥皂清洗双手。 以%水合氯醛按/臀部注射麻醉大鼠,麻醉起效后把大鼠放入实验 动物台,用橡皮筋固定四肢。再用%酒精喷双手自订臂及手掌,戴无菌手套, 点 酒精灯,确保所有的操作都在无菌条件下进行。用剪刀剪去大鼠背部手术区 域 的毛发,用碘伏消毒次,再用酒精消毒次。在无菌条件下从背部迅速取出双 侧卵巢,置于滤纸上,在解剖显微镜下快速仔细地除去周围的脂肪组织,然后 用不含血清的.培养液冲洗次,置入盛有?的温生理能水的无菌培养皿 中。 .大鼠卵巢组织的培养卵巢标本处理好后再用?的温生理盐水冲洗 硕士学位论文 % 次。将卵巢标本移入经紫外线消毒的超净工作台。再次用肥皂清沈双手, 酒精喷双手前臂及手掌,点酒精灯。每次操作前、后都把瓶口、瓶盖、手术 器 械等在酒精灯上过火。将各组卵巢组织分别置入数个孔培养板中,每孔放 个卵巢。组均先只加入不含的培养基%./ %%双抗,在培养温度为、%、%空气、湿度为% 的培养箱中培养。放入培养箱前在倒置显微镜下观察卵巢生长情况,拍照, 然后用酒精棉球仔细擦拭培养板表面,再放入培养箱中。培养后更换全液, 此时诈常对照组仍加入不含的培养基,个实验组加入含不同浓度 的培养基,后组均隔天全量更换不含的培养基即只作用, 共培养即加入后。每次换液后均在倒置显微镜下观察卵巢生长情况 并拍照。 、 留取加入前即培养,. .浓度测定及卵泡计数 更换的培养基,.。保存,统一用放射免疫法测定这些标本中的浓度。在加 入 时即共培养取出标本,用滤纸吸去表面的培养基,用?生理盐 水洗涤次,在%多聚甲醛中固定,经梯度乙醇脱水从%、%、%直 至纯酒精,每个浓度时间为.,二甲苯透明替换出组织内的酒精,石蜡包 埋,连续切片厚度,每隔张切片抽取张切片,苏木素一伊红染 色,显微镜下计数各级卵泡总数【】 用放射免疫法检测培养基中的浓度。雌二醇放射免 .浓度测定方法 疫分析试剂盒购白北京北方生物技术研究所,操作严格按说明书进行,用雌 二 醇放射免疫丫计数器.检测,检测单位为南方医科大学附属南方医院核 医学科。 浓度检测步骤如下: 取出储存于.。中的培养基标本,常温下解冻。 取圆底聚苯乙烯试管,用记号笔编号总管,, ,高值、低 值和待测样品。 在管内加入 “蒸馏水。 第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氛芥的适宜剂量 在、管中各加入“”。 标准,同法加入~ 在管中加入“ 标准,在管中加入 管。 在高值质控管中加入高值,低值质控管加入氐值。 在各样品管中分别加入肛待测样品。 所有的管中均加入“?。 在~、高低值质控管及样品管中各加入“兔抗.抗体。 所有管摇匀,在恒温水浴箱中水浴。 除总管,所有的管中均入驴抗兔免疫分离剂。 /,离心,除总管外, 充分摇匀,室温下放置, 用吸管吸取上清液。 在放射免疫丫计数器~数值框中分别输入、、、、 、 、 /。 数据处理模式是采用?法。 记录由放射免疫丫计数器自动处理的结果,统计分析。 .统计学方法所有数据均采用.软件进行统计分析,多组间比较 采用.法,组间两两比较用法方差齐性或方 差不齐,方差不齐用检验,不同时间点比较用重复测量法,以.为检 验水准。 三、结果 一组各时间点浓度比较 .经统计分析,重复因素个时问点差异有统计学意义., .;组间差异有统计学意义.,.;分组和时间有交互作 用.,.; .加入前个组浓度差异无统计学意义.,.。两 两比较差异均无统计学意义.;硕士学位论文 .加入,个组浓度差异有统计学意义.,.。 组问两两比较差异均有统计学意义.。其中个实验组浓度 .:. /;../;.士. /均低于正常对照组 .. /,与讵常对照组比较差异均有统计学意义尸.,且 剂量越大,浓度降低越明显。实验组浓度高于实验组和实验组,差 异均有统计学意义户.,.,实验组和实验组比较差异无统计 学意义肛.; .加入,个组浓度差异刃有统计学意义.,.。 组间两两比较差异也均有统计学意义.,其中个实验组浓度 .. /均低于正常对照组 /;.. /;.. .. /,与『常对照组比较差异均有统计学意义尸.。实验 组与实验组比较浓度差异无统计学意义仁。;而实验组浓度 高于实验组,差异有统计学意义仁.;实验组浓度高于实验组, 差异有统计学意义.。个实验组均是在加入时浓度最低。 见表.。 二卵泡总数比较 加入,组各级卵泡总数差异有统计学意义 .,.。组间两两比较差异均有统计学意义尸.,其中 个实验组的各级卵泡总数.:.个;..个;..个均 较『常对照组..个少,与『常对照组比较差异均有统计学意义尸 .,且剂量越大,各级卵泡总数减少越明显。实验组各级卵泡总数 明显多于实验组及实验组,差异均有统计学意义尸.,.,实 验组和实验组比较各级卵泡总数比较差异有统计学意义尸.。见表 .。 第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适宜剂量 表 组培养基中浓度比较 商 一 抽 注:,土效应的统计值和值;交互效应的统计值和值。 表加入各组各级卵泡总数比较妇 士组别 卵泡总数个 .. 止常对照组 实验组 .. .. 实验组 .. 实验组 三卵巢形态学改变 加入前各组卵巢在倒置显微镜下,均可见到个薄壁、淡黄色较透亮 的卵泡,大小不均。 加入,各实验组仍可见透亮卵泡,但均较正常对照组少,且剂量 越大,卵泡数减少越明显;加入,除正常对照组仍可见到透亮卵泡外,各 实验组卵巢外观均呈葡萄状,包膜增厚,表面未见透亮的卵泡。 加入,卵巢标本染色见各实验组大部分成熟卵泡闭锁,卵母细胞 形态异常,呈变性、固缩或消失等退行性改变,卵母细胞周边颗粒细胞层次减 少、排列紊乱、细胞问隙增大;实验组部分始基卵泡、窦前卵泡的颗粒细胞 硕士学位论文 排列紊乱或卵母细胞闭锁,其余个实验组大部分始基卵泡、窦前卵泡形态未 见明显改变图一,。 :正常对照组 :/组 :仃 ? :上/组 :?/组: :?/ / 四、讨论 化疗是治疗恶性肿瘤和自身免疫性疾病的重要手段。但化疗对细胞的损伤 是非特异性的,除杀灭肿瘤细胞外,尚损伤正常的组织细胞,其中卵巢损伤是 化疗的毒副作用之一,且这种损伤往往是不可逆的,可使患者出现潮热、出汗、 骨质疏松、闭经等低雌激素症状甚至导致卵巢早衰,引起不孕。近年来, 恶性肿瘤呈年轻化趋势,且自身免疫性疾病好发于年轻女性,据文献报道, 年每个成人中就有人在儿童期或青春期进行过肿瘤治疗。因此化疗引起 卵巢损伤就使众多存活的年轻女性面临一系列生理、心理、社会问题,带上沉 重的思想包袱,严重影响生活质量。如何预防或减轻化疗对卵巢的损伤,成为 科研工作者和临床工作者关注和研究的焦点。化疗致卵巢损伤的具体原因尚不 清楚,可能的机制为化疗药物损伤卵巢颗粒细胞及卵母细胞,引起颗粒细胞凋 亡及卵母细胞闭锁。研究发现,细胞有丝分裂越活跃,化疗药物对其杀伤性越第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适宜剂量 大。其中对卵巢损害有关的化疗药物主要是:?烷化剂:如环磷酰胺、 苯丁酸氮芥、白消安等对卵巢损伤最大;?对卵巢的毒性损害作用居中的药物 主要是:顺铂、阿霉素等;?对卵巢的毒性损害作用很小或几乎无损害的药物 主要是:博来霉素、长春新碱、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等。引起卵巢损伤最主要 的药物是烷化剂。烷化剂引起卵巢损伤的可能机制为药物作用于细胞的, 引起的单链或双链断裂,导致、和蛋白质合成受到抑制,从而 使性腺组织出现永久性损伤。烷化剂中以最具有代表性。引起的卵巢 损伤与其剂量、累积剂量及患者年龄有关。剂量、累积剂量越大,越容易 出现卵巢损伤。据报道,患者使用后出现闭经的平均剂量为岁以上者 ,岁者 ,岁者 ,青春期前总剂量达 都不会导致卵巢功能衰竭。累积剂量是引起卵巢功能衰竭的独立的高危因 素。化疗引起卵巢损伤还跟患者的年龄有关,患者的年龄越小越不容易发生卵 巢早衰,发生卵巢早衰所需的剂量也越高。一般初潮前的卵巢对毒性药物的耐 受性最强。有文献报道应用后出现闭经的时间为小于岁者。个月, 岁以上者为。个月。 在体外无活性,磷酰胺氮芥,为其最终代 谢产物,具有体外活性。故本实验采用作为建立体外培养大鼠卵巢损伤模型 的药物。 有研究证实,离体的大鼠卵巢组织能在体外培养的条件下生长,可能是因 为原始卵泡位于卵巢最外层,易获取营养,同时因其处于静止状态,代谢缓慢, 在体外培养条件下,不良反应较小,因此在培养体系中仍有生长的趋势【。而在 不同的培养液中,卵泡数量及卵泡形态可有差异。目前卵巢组织的基础培养液 有、、’等,其中最常用,是因为更有 利于卵泡的生长,能增加健康卵泡的平均直径,故本实验采用作为基础 培养液。而在中加入%的胎牛血清及体系胰岛素转铁蛋白牺, 更有利于卵泡的生长发育;因体外培养的卵巢组织缺乏下丘脑垂体聊巢轴的作 用,缺乏卵泡刺激素和黄体生成素,故需额外在培养液中加入 硕士学位论文 尿促性素,含和以促进卵泡发育成熟。有学者研究发现,在 培养液中加入某些化疗药物,可引起卵巢损伤,导致卵泡数量减少,卵泡形态 异常。】报道体外培养小鼠卵巢,可使卵泡数量减少,而且剂 量越大,卵泡数量减少越明显。研究发现,体外培养大鼠卵巢时,单次 给予化疗药物作用即可引起大鼠卵巢的损伤。另有报道在体外培养卵巢 的培养液中可检测到含量引。 本实验采用单次给药并作用,通过比较培养基中的浓度、大鼠 卵巢卵泡总数的变化,研究不同剂量的对体外培养大鼠卵巢的损伤情况。采 用放射免疫法检测培养基中的浓度是因为其有现成的试剂盒可以购买且价 格 较便宜,同时可以用雌二醇放射免疫计数器自动检测,操作简便,可快速得出 结果,且结果较精确和准确。 本研究结果提示:个实验组加入,培养基中的浓度均低于『常对 照组,差异均有统计学意义,同时体视显微镜下见各实验组透亮卵泡数不始 减 少,且剂量越大,透亮卵泡数减少越明显。加入,个实验组浓度 及各级卵泡总数办均低于『常对照组,差异均有统计学意义,同时各实验组均 未见透亮卵泡,而正常对照组仍可见透亮卵泡。这说明个实验组中剂量最低 的,/的已能引起体外培养大鼠卵巢的损伤,与正常对照组比较差异有 统计学意义。研究还发现不同剂量的对大鼠卵巢的损伤程度不同,剂量越大, 损伤越大,浓度下降越明显、卵泡总数减少越明显。在相同剂量的药物浓度 下,对始基卵泡、窦前卵泡损伤较轻,对窦状卵泡、成熟卵泡损伤较重,使大 部分成熟卵泡闭锁,其卵母细胞形念异常,颗粒细胞层次减少、排列紊乱,而 除实验组外,实验组和组的大部分始基卵泡、初级卵泡的形态未见明显 改变。 五、结论 种不同浓度的单次给药,作用均可导致本实验的浓度下降 和各级卵泡数量减少,与币常对照组比较差异均有统计学意义,且剂量越大, 第一部分确定引起体外培养大鼠卵巢损伤的磷酰胺氮芥的适宜剂量 大鼠的卵巢结构及内分泌功能损伤越重,即浓度下降及各级卵泡数量减少越 明显,故我们选择了个剂量中最低的浓度??‖作为建立体外培养 大鼠卵巢损伤模型的适宜剂量,并用于后续实验研究。 参考文献 . 【】 , , . ; . :?. 赵雪静,辛晓燕,黄艳红等.促性腺激素释放激素拮抗剂预防化疗大鼠卵巢 【】 功能损害的实验研究】.现代肿瘤医学,,:.. 袁光文,沈铿,杨佳欣.促性腺激素释放激素激动剂对化疗损伤卵巢功能保 【】 护作用的实验研究【】.中华妇产科杂志,,:. 】 黄健,郑月慧,徐良全等.新生大鼠卵巢体外培养体系的研究【】.生殖与避孕, ,:.. , 】 ,,.. . , , :, 【】 . . ,,: . , ,. 【】 【】. . : . ; 【】 谭丽,郑英.组织培养下胎儿卵巢雌二醇的分泌】.河南医科大学学报,, :.. 硕士学位论文 第二部分抗生长分化因子.抗体对所致大鼠卵巢损伤 的治疗作用的体外实验研究 一、目的和意义 探讨抗生长分化因子.抗体..对化疗所致的体外培养大鼠卵 巢损伤是否具有治疗作用。 生长分化因子一.是第一个被发现的卵母细胞来源的生长因子糖 蛋白,大量的研究证实其在卵泡的发育过程中起着不可缺少的作用。.能 通过旁分泌方式对卵泡的生长和分化起着重要的作用,促进卵母细胞的『常 生 长及有丝分裂,其主要是在从始基卵泡到初级卵泡窦前卵泡发育阶段中起 作用。.在体外可使人类卵巢组织中大量始基卵泡生长启动,减少卵泡闭 锁,促进卵泡存活。有研究报道在培养基中加入重组小鼠一及直接给母猪 卵巢注射猪的.基因片段,均可促进卵泡发育,使初级卵泡、次级卵泡、 成熟卵泡的数量增加,原始卵泡的数量减少。通过干扰技术,体外阻断窦 前卵泡向窦状卵泡过渡期的.表达,发现窦前卵泡的基础发育及诱导 的发育均受阻。.基因敲除的小鼠卵泡受阻在初级卵泡阶段,不形成优势 卵泡,无法排卵,导致不孕。而卵母细胞分泌的.的活性可被特异性抗 .抗体...中和,使卵泡停滞在初级卵泡阶段,但并不引起卵 泡凋亡。 ..能否治疗化疗引起的卵巢损伤,目前尚未见报道。化疗的细胞 毒性常作用于分裂增殖期的细胞,处于静止期的卵泡可防止受损害。根据以 上 研究, .的活性可被特异性抗.抗体...中和,使卵泡 停滞在初级卵泡阶段,但并不引起卵泡闭锁。故设想在化疗的同时加入 ?.中和.,使卵泡停滞在初级阶段,可能会减轻化疗对卵泡的损 伤。但是在化疗后加入抗体,是否具有治疗作用,尚需研究证实。本研究在给 第二部分抗生长分化因子一抗体对所致大鼠卵巢损伤的治疗作用的体外实 验研究 予 后加入..,观察..对化疗引起的体外培养大鼠卵 巢损伤是否具有治疗作用,为体内实验和临床试验提供依据。 二、材料和方法 一所用实验动物、试剂、器材同上,实验试剂另有羊抗小鼠.抗 体,由武汉博士德生物工程有限公司生产。 培养基配置 . . .生理盐水溶解,共含. “ 双抗 含,正常对照组用等量生理盐水代替 .... ?量为,正常对照组、组 用等量生理盐水代替 实验方法 .实验分组实验分为组,共个卵巢只大鼠,其中:? 『常对照组个;?组个;?生理盐水组个:加入含./ 的生理盐水;?抗体组个:先加入“的,后加入?一 /。 .大鼠卵巢组织分离及培养按上述方法在无菌条件下分离大鼠卵巢,将 卵巢标本放入数个孔培养板中,每孔个卵巢。正常对照组不加及抗体, 的生理盐水,不加 仅加入培养基;生理盐水组加入含./ 其他任何试剂及药物; 另组均为单次给药,作用。组加入 的培养基, 含/ 的培养基;抗体组先加入含/ 后加入‖的?一。在培养温度为,%,%空气,湿度为 硕士学位论文 %的培养箱中培养,组均隔天全量更换不含、抗体的培养基或生理 盐水即作用,..作用,下常对照组、组、生理盐水 组的卵巢培养,抗体组个大鼠卵巢培养,剩余个卵巢培养, 用于观察卵巢功能恢复情况。在培养前,培养、、抗体组时在 倒置显微镜下观察卵巢生长情况,并拍照。 .组织形态学观察及卵泡计数培养及时按上述要求分别取出标 本,用滤纸拭去表面的培养基,再用?生理盐水洗涤次,在%多聚甲醛中 固定,经梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切片厚度.,每 隔张切片抽取张切片,染色,显微镜下观察各期卵泡形态:?窦前卵 泡:始基卵泡初级卵泡由卵母细胞和围绕其周围的单层梭形或单层柱状颗粒 细 胞组成;?窦状卵泡:次级卵泡成熟卵泡由卵母细胞和围绕其周围的多层 颗粒细胞组成【】并计数各级卵泡总数。 .统计学方法所有数据均采用.软件进行统计分析,多组’日比较 方 法,组间两两比较用法方差齐性或 采用. 差不齐,方差不齐用检验,以.为检验水准。 三、结果 .培养时,组各级卵泡总数比较差异有统计学意义., .。十抗体组各级卵泡总数为.:.个,少于正常对照组的 .::.个,多于组..个和生理盐水组..个。 抗体组的各级卵泡总数与其他组比较差异均有统计学意义尸.,见表 . 。 .抗体组在不同时间点卵泡总数的比较:在培养时为..个, 培养时为..个,不同时间的比较,差异无统计学意义., .。见表.。第二部分抗生长分化因子一抗体对所致大鼠卵巢损伤的治疗作用 的体外实验研究 表培养的各组卵泡总数 墙 .蚵 表 抗体组培养和培养卵泡总数比较矗 ??一 士譬 嘞司 巧陌包营激个 住叼. 第天 .竭 第天 . 尸值 .卵巢形态学改变 培养,在倒置显微镜下,生理盐水组、组、抗体组的卵巢外观呈 葡萄状,表面凹凸不平,包膜明显增厚,未见透亮的卵泡,『常对照组卵巢肉 眼观仍可见~个透亮、薄壁的卵泡。 染色见抗体组及组大部分成熟卵泡闭锁,卵母细胞形念异常, 呈变性、固缩或消失等退行性改变,卵母细胞周边颗粒细胞层次减少、排列 紊 乱、细胞间隙增大,部分窦前卵泡闭锁。生理盐水组细胞空泡变性,排列紊乱、 失去极性,核碎裂、溶解图., 培养,抗体组包膜仍明显增厚,染色见成熟卵泡基本闭锁,大 部分窦前卵泡颗粒细胞不始脱落,卵母细胞形态不始出现变性图。 硕士学位论文 一一.一 :组 :正常对照组 ;生理盐水组 : : : 一一 :抗体组培养 :抗体组培养 :七 :?母 四、讨论 卵巢损伤是化疗的长期毒副作用之一。研究发现,细胞有丝分裂越活跃, 化疗药物对其杀伤性越大。其中引起卵巢损伤最主要的药物是烷化剂,烷化 剂 以最常用。引起卵巢损伤的可能机制为药物作用于细胞的,引 起的单链或双链断裂,导致、和蛋白质合成受到抑制,从而使 性腺组织出现永久性损伤。为的最终代谢产物,具有体外活性。 是由卵母细胞分泌的细胞因子,能通过旁分泌方式对卵泡的生长和 分化起着重要作用,促进卵母细胞的正常生长及有丝分裂,其主要是在从始 基 卵泡到初级卵泡发育阶段中起作用。研究证实在体外可使人类卵巢组织 中大量始基卵泡生长启动,减少卵泡闭锁,促进卵泡存活,其活性可被特异性 抗抗体认电一中和,使卵泡停滞在初级卵泡阶段,但并不引起 卵泡闭锁。 大部分研究在体外培养卵巢时即进行统计分析,得出结论;另有研究发 现,体外培养卵巢组织最长可存活。本研究正常对照组、组、生理盐水 组的卵巢及抗体组的部分卵巢培养,抗体组另有个卵巢培养。