骨桥蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达及临床意义

骨桥蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的达及临床意义 -暨南大学硕士学位论文 摘要 目的 : 中耳胆脂瘤破坏鼓室结构导致严重的颅内?外并发症。本课题通过观察骨桥 蛋白(OPN)在胆脂瘤上皮的表达,探讨中耳胆脂瘤骨质破坏的可能机制。 : 选取符合纳入标准的胆脂瘤中耳炎住院患者 25例作为实验组,采集手术切除 标本 25份;同时选取其中 15例患者外耳道骨部皮肤作为对照组,采集正常外耳道皮 肤组织标本 15 份。所有标本按要求以福尔马林固定,石蜡包埋。每例标本经苏木素 ?伊红染色确定病理诊断。采用免疫组化二步法检测 25例中耳胆脂瘤上皮(实验组) 与(对照组)15例外耳道骨部皮肤组织中 OPN的表达。应用 SPSS13.0 软件进行统计 学分析。 结果 : 25例胆脂瘤上皮组织中17例呈强阳性表达,2例呈阳性表达,均在胞浆有阳性 着色。在基底层、棘层和颗粒层细胞表达明显,皮下组织也可见散在阳性表 达,6 例 呈阴性表达,15例外耳道骨部皮肤均呈阴性表达。结论 : 骨桥蛋白(OPN)在 中耳胆脂瘤上皮的表达明显高于外耳道骨部皮肤,提示 OPN可能与胆脂瘤引起骨质破坏有一定关系。 关键词 : 中耳 胆脂瘤 骨桥蛋白 免疫组织化学 I-暨南大学硕士学位论文 The expression and clinical significanceof OPN in Cholesteatoma Otitis Media Abstract Objective: Cholesteatoma Otitis Media destroys tympanic structure. It can cause the serious complications of intra and extra cranial. The aim is to investigate the mechanism of bony destruction in Cholesteatoma Otitis Media by the OPN expression on Cholesteatoma epithelium Methods: According to the standards, we selected 25 cases of cholesteatoma otitis media patients as experimental group,collected 25 surgical resection specimens, and at the same time to select 15 cases of bone with external auditory canal skin in these patients as a control group,collected 15 normal skin samples of the external auditory canal. All specimens required to formalin-fixed, paraffin-embedded. Each of the experimental specimens were done with hematoxylin and eosin staining to determine the pathological diagnosis. Two-step immunohistochemical method was used to detect the expression of OPN on epithelium of 25 cases with Cholesteatoma Media and on the skin tissue of bony portion for 10 cases with normal external auditory canal. SPSS13.0 system was used to perform the statistical analysisResults: 17 of 25 cases of Cholesteatoma showed strong positive expression on basal cell layer, prickel cell layer and stratum granulosum of cholesteatoma epithelium,while 2 cases showed moderate positive, they were positively pigmented in the cytoplasm. 6 of 25 cases showed negative expression, 10 cases with normal skin tissue on bony portion of external acoustic meatus were all negative expression Conclusions: The expression of OPN in cholesteatoma otitis media is significantly higher than the skin tissue of the bony portion with the external auditory canal, suggesting that OPN may be a correlation of bone destruction in Cholesteatoma Key words: Middle Ear Cholesteatoma Osteopontin Immunohistochemistry II-暨南大学硕士学位论文 目录 中文摘要???????????????????????????????????I 英文摘要?????????????????????????????????????????? II前 言???????????????????????????????????????? 1 材料与方法???????????????????????????????????????????? 7结 果??????????????????????????????????????????? 13 讨论??????????????????????????????????????????? 14结 论????????????????????????????????????????? 17 参考文献??????????????????????????????????????? 28附 图?????????????????????????????????????????? 21英文缩写 词??????????????????????????????????????? 23 在校期间发表论文????????????????????????????????????????? 24 致谢?????????????????????????????????????????? 25 III-暨南大学硕士学位论文 前言 中耳胆脂瘤(cholesteatomatica otitis media)是临床上一个常见病, 其特征是中 耳腔内存在高度增殖的角化鳞状上皮和邻近骨质的破坏, 以及程序性角质细胞凋亡, 导致腔内角化碎屑的堆积。胆脂瘤形成机制主要包括以下几种学说:(1)袋状内陷学 说:由于咽鼓管功能不良,中耳长期处于负压状态,以致粘膜充血、肿胀、增厚。位 于鼓室膈处的粘膜及粘膜皱襞以及韧带等出肿胀、增厚、粘连,上、下鼓室之间的两 个小孔(鼓前峡及鼓后峡)全部或部分发生闭锁。受上鼓室长期高负压的影响,鼓膜 松弛部或紧张部后上向内陷,局部逐渐形成内陷囊袋(pocket retraction), 如遇潮湿或 发生感染,上皮屑排出受阻而堆积于囊内,囊袋不断扩大,周围骨质遭到破坏。(2) 上皮移行学说:急性坏死型中耳炎形成鼓膜大穿孔或后方边缘性穿孔,鼓沟骨质裸露, 外耳道皮肤越过骨面向鼓室内生长,伸达上鼓室或鼓窦区, 其脱落的上皮及角化物堆 积于该处而不能自洁, 逐渐堆积成团,形成胆脂瘤。 (3)鳞状上皮化生学说: 所谓上 皮化生是指正常的粘膜上皮被角化性鳞状上皮所取代, 如化生的角化性鳞 状上皮伸 入鼓窦或鼓室,脱落的角化物质发生堆积,可形成胆脂瘤。(4)基底细胞增殖学说: Lange1925提出,鼓膜松弛部的上皮细胞能通过增殖形成上皮小柱,破坏基底膜,而 伸入上皮下组织, 在此基础上产生胆脂瘤。胆脂瘤或因其对周围组织的压迫,或由于 基质及基质下方的炎性肉芽组织所产生的多种酶(如溶酶体酶、胶原酶等),前列腺 [1] 素和某些细胞因子的作用,致使周围的骨质脱钙,骨壁破坏 。如不进行手术切除, 它将无限制地生长膨大侵蚀邻近组织如骨迷路、听小骨、面神经、脑膜、乙状窦等, 引 起各种颅内、外并发症, 甚至危及生命。 目前,国内外学者从分子生物学角度研究胆脂瘤的染色体异常、上皮高度增生、 骨质破坏吸收、细胞因子的表达以及细胞凋亡机制等等。在中耳胆脂瘤引起的骨质破 坏吸收的研究中,研究较多的的有肿瘤坏死因子(TNF2A)、白细胞介素(IL 21、IL 26)、血小板源性生长因子(PDGF)等细胞因子。目前,骨桥蛋白(OPN)在各种 恶性肿瘤方面的研究比较多,但在中耳胆脂瘤骨质破坏方面的研究甚少。 调节骨代谢的细胞因子很多,骨吸收与骨形成之间存在动态平衡,现就骨桥蛋白 对骨吸收作叙述。 骨桥蛋白(Osteopontin ,OPN)是一种分泌型的磷酸化蛋白,它有着广泛的组织 [2-3] 分布,存在于骨组织,外周血液和某些肿瘤中 。近年来的研究显示它在体外具有调1-暨南大学硕士学位论文 节细胞粘附、浸润与迁移的功能,参与多种生命现象,如骨代谢、肿瘤的生长、转移、 抗感染和免疫等。OPN与成骨细胞的分化和骨形成有关,又与破骨细胞在骨吸收的过 程有密切关系。 1.OPN 的结构特点OPN分子大约由300个氨基酸残基组成,分子量44-75kD,信号肽由16个氨基酸 残基组成,骨组织中的OPN含有285个氨基酸残基,其突出结构特点是在OPN分子中 段含有精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸(RGD)序列。 [4]OPN的后加工主要是通过OPN的磷酸化过程掺入唾液酸和硫酸盐基 , OPN 分子被糖基化、硫化或磷酸化的程度与表达的组织和存在于血液或组织中的 时间有 关。磷酸化的OPN可调节成骨细胞和破骨细胞的功能,对其与各种细胞结合的能力也 [5] [6] 有一定影响 。硫化型OPN可调节培养成骨细胞的矿化结节形成 。但体内的情况是 否如此尚未明了,人们正在用转基因技术来阐明其生理意义。 人OPN基因定位于4q13-21,含7个外显子。启动子中含有与SP1、AP1、AP4、AP5 的顺式作用元件、ras激活元件、TPA反应元件、甲状腺激素反应元件和维生素D反应 [7] 元件,见图。但因剪接差异,可表达多种mRNA 。这些OPN异构体的作用仍不清楚, 可能是在不同条件下,对不同的组织或细胞具有不同的调节作用。 图 骨桥蛋白的份子结构 注: 骨桥蛋白Osteopontin, OPN)分子中含很多 α螺旋(以 表示和一些 β片层结构以箭头表示 3- 含有RGD。OPN分子中的多Asppoly Asp和大量PO , 使OPN呈酸性, 骨组织中OPN不含C端短肽 42-暨南大学硕士学位论文 2.OPN的功能 2.1与骨组织的其他组分结合,形成骨代谢的调节网络 在骨基质中,OPN与骨基质中的一些组分相互作用,OPN可与骨连蛋白 [8] (osteonectin)以共价成式结合,进而与胶原纤维结合 ,骨涎蛋白(bone sialoprotein) 也与?型胶原形成共价结合的复合物,而骨钙素抑制OPN与这种复合物的进一步结 合,但它们在骨重建中的意义不明。在OPN分子中还存在10?12个门冬氨酸残基重复序列,形成的强负电荷性是 OPN与骨矿物质结合的重要结构基础。OPN与钙化的骨基质、异位骨化组织和动脉钙 2+ 化灶有极高的亲和性,这是因为OPN与Ca 有极高的亲和性,是骨矿化和磷酸钙结石 [9] 形成的重要原因 ,但OPN基因缺失小鼠的骨矿化功能是正常的,此可能是其他调节 骨矿化的因子代偿了OPN的作用所致。 2+ 2+ 与Ca 结合后,OPN分子发生变构,其变构的程度和方式与Ca 的浓度有关。 因 2+ 2+ 此,可能是通过Ca 浓度来调节OPN分子中RGD序列。在骨吸收时,局部的Ca 浓度明 2+ 显升高,Ca 促进OPN变构,产生相应的物理化学变化,有利于骨吸收的持续进行。 另一条调节途径是破骨细胞膜上的钙受体CaR。 2.2 OPN与骨组织细胞 在破骨细胞的足小体podosomes和成骨性谱系细胞内均存在OPN,但这种异构 的结构和功能尚未明了。一些资料提示,破骨细胞足小体中的OPN与CD44/ α β 受体形 v 3 [10] 成复合物,可促进破骨细胞的移行 ,由于成骨细胞也合成和分泌OPN与α β ,故成 v 3 骨细胞的移行也可能受这种复合物调节。 成骨性谱系细胞表达孤核雌激素受体相关受体- α(orphan unclear estrogen receptor-related receptor alpha,ERR α),其表达远高于雌激素受体β (ER β)或α(ER α); 同时骨髓细胞亦呈ERR α高表达。资料表明,ERR α可与ER α(或ER β)相互作用,调 节骨形成,但在成骨性谱系细胞的不同份化阶段, ERR α、ERR α和ER β所起的作用有 [11] 差异 。此外,组织转氨酶(tissue transglutaminase,tTG)是维持基质稳定和细胞粘 附的一种重要的交联酶。成骨细胞和骨细胞可合成tTG,tTG与底物(OPN、 DSP、 [12] AHSG交联,是调节骨基质与矿化的主要因素 。 2.3 OPN受体与骨吸收 [13,14] OPN可与整合素(integrin)的α β 、 α β 、 α β 、 α β 、 α β 、 α β 亚型结合 , v 1 v 3 v 5 4 1 5 1 9 13-暨南大学硕士学位论文 但CD44并不发生在OPN的RGDS上,而是先与整合素β亚基结合后,在使CD44与OPN 结合。除了调节破骨细胞的活性外,OPN还与 α β 整合素结合,进而促进OPN表达, v 3 [15] 防止内皮细胞凋亡 。 α β 缺失小鼠可发生骨质硬化症。因此,OPN可作为破骨细胞 v 3 的一种功能标志物。维生素D促进OPN的表达,在免疫电镜下,OPN位于破骨细胞透 亮带的下方(透亮带与骨基质接触有关)。因此,OPN参与了破骨细胞破骨过程的调 节。同样,OPN也与成骨细胞的功能有密切关系,在骨吸收停止后,OPN位于粘合带 处,它的功能是为成骨细胞的骨形成提供偶联信号。 [16] 在破骨细胞表面, OPN与整合素结合,并诱导OPN依赖性细胞内信号转导 。 OPN 受体的酪氨酸残基(402位)被磷酸化后,启动其与src结合,并扩增其他部位的酪氨 酸残基磷酸化效应,使其他效应分子与PYK2结合,从而表达出OPN的细胞生物效应 (如细胞粘附、细胞内骨架的变构与运动等)。此外, OPN还激活p21GTP酶,通过rho、 mDial等的作用促进肌动蛋白环(actin ring)的形成。OPN缺失小鼠的破骨细胞虽然 [17] 也形成“足小体”,但足小体中无mDial和gelsolin,因而细胞的活动能力下降 ,细 胞表面的CD44表达减少。加入外源性OPN后,又可使破骨细胞的功能恢复正常。 2.4 OPN与骨的机械应力 成骨细胞和骨细胞表达OPN。而成骨细胞、骨细胞和软骨细胞均与骨的机械应 [18,19] 力有关 。有人发现,拨牙后,施压部位的破骨细胞数目增加17倍之多,但如注入 [20] RGD肽,则可抑制这一细胞反应 。这些实验细果表明:成骨细胞、软骨细胞、骨细 胞、平滑肌细胞等在受到机械刺激后,细胞表达的OPN均增加,说明OPN的合成和分 泌受机械作用力的调节。在骨组织中,OPN介导了机械力对骨重建的作用。将OPN缺 失鼠进行吊尾(tail suspension)试验,以了解解除重力负荷对OPN表达的影响,CT [21] 分析发现,正常鼠的长骨发生骨丢失,而OPN缺失鼠则没有 。 成骨细胞在骨形成中起着十分重要的作用,成骨细胞可表达PTH受体,PG受体 和维生素D受体,同时也是对机械应力作出相应反应的一种骨组织细胞。正常鼠在吊 尾试验后,成骨细胞的活性和对机械应力的反应被抑制,但OPN缺失鼠则无上述反应 [22] 。 2.5. OPN与异位钙化 异位钙化是软组织损伤后经常出现的一种病理反应,主要表现为局部羟磷灰石晶 体的形成,而在某些重要的器官或组织中出现的异位钙化往往是致命的。OPN分子中4-暨南大学硕士学位论文 大量存在的天冬氨酸和磷酸丝氨酸能够帮助其结合于矿化组织中的钙磷晶体表面,抑 制该晶体的生长。研究表明,钙化介质能够诱导VSMC中OPN的表达。在b2FGF诱导的 VSMC细胞外基质的钙化过程中,OPN能够抑制其钙化的进程,该作用在大鼠动脉粥 样硬化以及动脉瓣膜钙化的发病过程中表现得尤为明显。另外,在钙化组织中,OPN 能够诱导破骨细胞的聚集,促进钙化组织的吸收。将钙化骨盘植入大鼠肌组 织中,野 生鼠的骨质吸收速度要比OPN基因敲除的大鼠快得多,而且OPN缺失的大鼠其骨盘机 化的程度和破骨细胞黏附的数量也明显削弱。在尾悬吊术骨质疏松的动物模型中, OPN敲除大鼠的骨组织中没有发现矿物质的缺失,同样手术的野生鼠则出现了明显的 骨质缺陷。 3. 敲除OPN基因动物的特征 3.1 OPN缺失与骨质疏松症 OPN缺失小鼠的表型特征是:?OPN缺失鼠的骨量增加,说明OPN是骨矿生长和 [23] 成熟的抑制因子 ,OPN缺失鼠骨的发育仍正常,但可有伤口愈合延迟及免疫功能障 碍,这可能是因为其他细胞因子部分代偿了OPN的作用。?OPN缺失合并雌激素缺乏 时,因骨重建加速可导致骨质疏松症;卵巢切除后的野生型鼠和OPN缺失鼠的子宫重 量下降程度相似(说明雌激素缺乏的程度相近),但用微CT分析骨小梁的结构时发现, 野生型鼠的骨小梁骨量下降60%,对照组即OPN正常,但已切除卵巢的骨小梁 骨量 稍增加,这是由于骨吸收减少和骨成形增加所致,并不出现骨代谢的高转换状态。? 正常鼠在切除卵巢后,破骨细胞数目增加3倍以上,而OPN缺失鼠在切除卵巢后破骨 细胞数目仍正常。这说明OPN是雌激素缺乏性骨质疏松发病的前提条件之一,缺乏 OPN具有某种拮抗骨质疏松发生的作用。 3.2 OPN缺失与骨吸收 [24]骨吸收的另一前提是血管生成,OPN促进骨吸收需要血管生成的参与 。将外 来骨片植入正常鼠的肌肉内,骨被吸收25%,而植入OPN缺失鼠的肌肉内,植入的骨 片被吸收的量5%,这是因为破骨细胞可大量聚集于正常鼠的外来骨片中,而不能聚 集于OPN缺失鼠的外来骨片中。如将外源性骨片移植到皮下,也可OPN具有促进 移植骨血管生成的作用。 3.3 OPN与PTH诱导骨质吸收 如上所述,卵巢切除试验和异位骨移植试验都发现OPN缺失鼠的骨吸收的能力5-暨南大学硕士学位论文 下降,故推论OPN缺乏可抑制破骨细胞的骨吸收功能。在PTH诱导的骨吸收 试验中发 现,OPN直接参与骨吸收局部新生血管形成的调节,而且不受其他因子包括PTH的 2+ 影响。OPN缺乏骨在加入PTH后,释放入培养液中的Ca 含量极少;而在正常骨中, 2+ 加入PTH后,由于骨吸收增加,被Ca 的释放增加。众所周知,PTH促进骨吸收的机 制是诱导了RANKL、可溶性RANKL和M-CSF的表达。但OPN缺失鼠在加入PTH后, 破骨细胞数目不增加,亦无RANKL和M-CSF的表达。因而认为,缺乏OPN时,PTH 不能刺激破骨细胞的形成。 4.OPN与肿瘤转移 现已发现,目前很多肿瘤可表达OPN,当肿瘤具有高转移潜能时,血中的OPN升高 [25] 。例如在激素?抗性前列腺癌病人,血浆OPN明显升高,往往提示已有骨转移,血 [26] 中OPN升高越明显,预后也越差 。实验证明,肿瘤细胞合成OPN,可保护自身 不被 巨噬细胞吞噬。例如,一旦黑色素细胞瘤转移到骨组织,转移性骨肿瘤的发展十分迅 速,OPN缺失鼠具有抵抗黑色素细胞瘤骨转移和限制骨肿瘤在骨中生长的特点,同样 的情况也见于该肿瘤的肺转移灶。OPN的主要作用可能是促进肿瘤细胞在转移灶的克 隆形成。恶性肿瘤的转移扩散受很多因素影响,其中OPN基因被认为是一种肿瘤转移基因。 CD44是OPN的受体, α β 促进肿瘤的扩散和血管生成。由于正常细胞很少表达OPN, v 3 故可将OPN的基因?OPN的蛋白?OPN的受体CD44作为肿瘤治疗的靶目标,通过 改变基因表达?封闭OPN受体等方法,阻滞OPN的合成和OPN的生物作用,达到治疗 [27] 肿瘤的目的 。 6-暨南大学硕士学位论文材料与方法 1 .材料 1.1 临床资料与材料 1.1.1 临床资料 收集暨南大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科2007年3月~2008年9月期间胆脂瘤 中耳炎病人标本25例。术前诊断标淮参照“中耳炎的分类和分型(2004年,西安)” (中华耳鼻喉头颈外科杂志2005年第一期)。所有病例均综合病史、听力检查、乳突 高分辨率螺旋CT、虚拟耳镜、术中探查及病理检查,明确诊断为胆脂瘤中耳炎。 1.1.2 分组与检查 实验组 :胆脂瘤中耳炎,男性13例(13耳),女性患者12例(12耳),年龄16-65 岁,中位年龄34.8岁,平均病史5.4年;持续耳流脓史13例,间断少量流脓史9例,无 流脓史3例。松弛部边缘性穿孔7例,紧张部边缘性穿孔5例,紧张部中央性穿孔8例, 紧张部大穿孔5例。经纯音电测听检查语言频率0.5kHZ、 1.0kHZ和2.0 kHz气导缩小的 平均值,25耳中气导下降<15dB 3例,15-25dB 5例,25-35dB 11例,>35dB 6例。影 像学检查:高分辨率螺旋CT颞骨扫描,并行三维重建即虚拟耳镜观察,25耳术前轴位、 冠状位CT显示锤骨、砧骨和镫骨上部结构部份破坏,虚拟耳镜提示22耳有 听骨链不同 程度破坏。对照组 :选取其中15例患者外耳道骨部皮肤。 1.2 试剂及来源 鼠抗人OPN单克隆抗体试剂编号:Sc-21742为美国Santa Cruz公司生产,产 品购自北 京中杉生物技术有限公司。 免疫组织化学超敏试剂盒 PV-9000 柠檬酸抗原修复缓冲液 MVS-0066 PBS缓冲液 PBS-0060 多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine) 以上试剂均由北京中杉生物技术有限公司提供 7-暨南大学硕士学位论文 1.3主要仪器 ZEISS-88手术显微镜德国卡尔蔡司公司 National NN-5252型一按感应微波炉 National公司 自动双重纯水蒸馏器上海玻璃仪器厂 YT 6生物组织摊烤机 湖北孝感亚光医用电子技术研究所 SHANDON-AS325切片机 日本奥林巴斯公司 KMY 103型电热千燥机日本奥林巴斯公司 Olympus光学显微镜日本尼康公司 微量移液器 日本Nichiryo公司 DM20 显微镜德国Leica DFC280 图像采集系统 德国Leica BI2000 图像分析系统成都泰盟电子有限公司 工作液:磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)存储液配方:A液:0.25M磷酸二氢钠液 NaH PO 2H O 78g蒸馏水溶解并加至总量2000ml2 4 2 B液:0.25M磷酸氢二钠液 Na HPO 12H 0 179g蒸馏水溶解并加至总量2000ml2 4 2 配制PBS 0.01M,PH 7.2~7.5。柠檬酸缓冲液(Citral-buffer 0.01M,pH 6.0) 配制:取2.1g柠檬酸(批号20050401-1 广 州化学试剂厂分析纯)加1000ml蒸馏水配成,每次用前,用2N的NaOH 调至pH 6.0~6.32.实验方法 免疫组织化学的实验过程(采用PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒) 2.1 实验前的准备: (1)载玻片和盖玻片的准备:先将用清洁剂清洗干净,再浸泡在酸性溶液中24 小时, 然后用流水冲洗干净后用蒸馏水清洗数遍,再浸入95%酒精中2 小时,用绸布檫干, 放在干净的玻片盒中备用。 (2)载玻片涂布黏附剂:首先将多聚赖氨酸溶液从冰箱内取出,倒进塑料的容器中 恢复至室温,然后将处理好的载玻片插入玻片架,再将玻片架放入容器中,等待5分 钟,让其孵育。昀后于室温下过夜。 2.2 组织的准备: 先准备好棕色小磨口瓶装数毫升多聚甲醛固定液,在瓶外进行编号,然后从-70?超低 温冰箱内取出组织,等待解冻后立即放入对应编号固定液中固定12 小时。固定时在8-暨南大学硕士学位论文 4?冰箱内进行。 2.3 组织块的修整: 组织固定后取一新的手术刀片将组织块切取平整,修掉一些不规则的部位,将过大过 厚的组织改小改薄。 2.4 组织的洗涤: 用冰冷自来水将固定液冲洗干净。 2.5 组织的脱水: 将组织块依次浸泡在冰冷的70%、80%、90%、95%酒精各2 小时左右和无水乙醇中半 小时左右进行脱水。 2.6 透明或媒染: 脱水后将组织依次浸泡在二甲苯?和二甲苯?中各20 分钟左右进行透明。 2.7 浸蜡: (1)将事先准备好的几只浸蜡杯放置于温度恒定在60?的恒温箱内,然后将52~ 54?、54~56?、56~58?固体状的“切片石蜡”分别置于不同的浸蜡杯中, 并在杯 上作记号标记以区分软、硬蜡。 (2)将透明好的组织块从二甲苯中取出,直接投进已经熔化的“浸蜡?”中浸泡30 分钟后,再顺序浸入已经熔化的“浸蜡?”和“浸蜡?”中,每次各1 至2 小时即可 进行包埋。 2.8 包埋: (1)先在60?的恒温箱内熔化包埋蜡,点燃酒精灯,将已经熔好的包埋蜡装在有柄 的容器内,置于酒精灯上加热。 (2)准备好包埋框(蜡块固定器)。 (3)将熔化好的石蜡倒入包埋框内,用加温后的镊子迅速将浸蜡后的组织块放入包 埋框内,当石蜡即将凝固而还没有凝固时,插入写有标本编号的标签纸,然后将包有 组织的石蜡块放进4?冰箱,等待包有组织的石蜡块自然冷却凝固变硬后,取下包埋 框就完成了组织的包埋。 2.9 石蜡切片: (1)安装并固定好切片刀,然后固定好蜡块,调整蜡块与切片刀至合适的位置。 (2)先修出标本,直到组织完全暴露于切面。 (3)调整切片厚度刻度指针,使切片厚度为4μm。 9-暨南大学硕士学位论文 (4)开始切片,将切下的蜡带用毛笔将其按顺序存放在培养平皿内,等候染色时展 片和贴片。 (5)展片、分片:用眼科镊夹起切片的一角,正面朝上轻轻平铺于恒温水浴箱的水 面上,使切片自然平整地展开,再将相邻的切片分开。 (6)捞片:将准备好涂有黏附剂的载玻片伸入水中将组织切片捞在载玻片的中央, 摆正切片,及时写上编号以免混淆。 (7)烤片:切片捞起后,在空气中稍微干燥后立即送进37?左右烤箱中烘烤30分钟 左右。 2.10 切片的脱蜡和加水: 2.10.1 切片脱蜡: (1)在二甲苯?中脱蜡10~15 分钟。 (2)在二甲苯?中脱蜡10~15 分钟。 (3)在100%酒精中脱二甲苯1 分钟。 2.10.2 切片加水: (1)浸泡在95%酒精中1~2 分钟。 (2)浸泡在80%酒精中1~2 分钟。 (3)浸泡在70%酒精中1~2 分钟。 (4)自来水冲洗1~2 分钟。 (5)蒸馏水冲洗1~2 分钟。 2.11 抗原修复: 石蜡切片经过脱蜡和加水后即可进行抗原修复,本实验采用微波炉加热法,步骤 如下: (1)将切片置于微波炉专用的塑料切片盒内。 (2)将200ml 柠檬酸缓冲液加入塑料切片盒内,并盖上带有小孔的盖子。 (3)将塑料盒放置于微波炉的中央,加热使温度保持在92?~100?之间,并持续5 分钟2次;第一次加热后要观察抗原修复液是否减少,如有减少要加抗原修复液或蒸 馏水适当补充,然后再进行第二次加热;加热过程中一直要保持组织切片湿润。 (4)将微波炉中的切片盒移至室温冷却15~20分钟。 (5)蒸馏水水洗5分钟2次。 (6)加3%H O 作用10分钟以阻断内源性过氧化物酶。 2 2 10-暨南大学硕士学位论文 (7)浸泡在蒸馏水中10 分钟。 (8)用PBS 液洗5分钟2次。 (9)稍后即可用于免疫组织化学染色。 ?采用链霉菌抗生物素一过氧化酶免疫组化染色法S-P method ,石蜡切片脱蜡水化 (玻片经多聚赖氨酸防脱片处理,PBS(0.01M,pH7.5?0.1)冲洗三次,每次3分钟; ?1mM EDTA(乙二胺四乙酸)抗原修复液修复,蒸馏水洗1次3分钟, PBS 液洗两次, 每次3 分钟。 ?3%H O 室温下孵育10分钟消除内源性过氧化物酶活性, PBS 冲洗三次,每次3分 2 2 钟。 ?滴加非免疫动物血清,室温下孵育10 分钟;倾去血清,分别滴加预先稀释好的OPN 鼠抗人单克隆抗体在切片组织上,放置在免疫组化湿盒内,4?冰箱室温作用过夜。 同时用PBS溶液替代一抗作阴性对照,用已知阳性片作为阳性对照。 ?PBS 冲洗三次,每次3 分钟后,滴加生物素标记的第二抗体,室温下孵育10 分 钟,PBS 冲洗三次, 每次3分钟。 ?除去PBS液,滴加链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液,室温下孵育10分 钟,PBS冲 洗三次,每次3分钟;3.3'一二氨基联苯胺(3.3'一DAB)显色。 ?自来水充分水洗,蒸馏水水洗10 秒钟。 ?用苏木素染色溶液复染细胞核30 秒左右。 ?自来水水洗10 分钟。 2.12 切片的脱水、透明和封片: 2.12.1 脱水: (1)在70%酒精中脱水30秒。 (2)在80%酒精中脱水30秒。 (3)在95%酒精?中脱水1~2分钟。 (4)在95%酒精?中脱水1~2分钟。 (5)在100%酒精?中脱水2~5分钟。 (6)在100%酒精?中脱水2~5分钟。 2.12.2 透明: (1)在二甲苯?中透明5~10分钟。 (2)在二甲苯?中透明5~10分钟。 11-暨南大学硕士学位论文 2.12.3 封片: 将带有染色好组织的载玻片平放在实验台上,有组织切片的面朝上,在组织 切片面上 滴加一小滴中性树胶封固剂,然后用眼科镊夹住盖玻片,轻轻覆盖在中性树 胶上面, 干燥后即可进行显微镜观察。 2.12.4 对照实验:阴性对照:用0.01M PBS代替一抗。 3 实验结果判定标准 结果判定方法:选择5 个高倍(×200)视野,以细胞浆中出现土黄色或黄褐色颗 粒者为阳性细胞,合并计算所分析的5个不同视野染色细胞百分数及染色强度,根据 阳性细胞的百分率及显色深浅分级:?阳性细胞的百分率:无细胞显色或阳性细胞的 百分率?5%者为0分;5%~25%细胞显色者为1分;25%~50%细胞显色者为2分;? 50%细胞显色者为3分。?显色深浅:不显色或显色不清楚为0分;淡黄色者为1分;棕 黄色者为2分;深褐色者为3分。将两种评分相加除以2,即为该切片的昀终评分。将0、 0.5~1、1.5~3,分别定为阴性(-)、阳性(+)、强阳性(++)。采用双盲法,由 两个独立的观察者分别评分。 4 统计学处理 2 实验结果均采用SPSS13.0软件进行统计学分析。有关数据采用? 检验,结果以 P?0.05为检验水平。12-暨南大学硕士学位论文结果 OPN在胆脂瘤上皮的阳性表达是胞浆中出现棕黄或褐色颗粒,实验组中大部 份胆 脂瘤上皮细胞浆被染成棕黄色和褐色。17例强阳性标本中基底层、棘层和颗粒层细胞 均可见深褐色颗粒(图3、图4),部分细胞膜及皮下组织也见着色;2例阳性标本中(图 6),见棘层和颗粒层细胞出现淡黄色颗粒,皮下组织见散在分布。细胞核未见着色颗 粒(图8)。6例胆脂瘤标本上皮及皮下组织未见明显染色颗粒。15例外耳道皮肤中, 部分见皮下组织散在淡黄色颗粒,细胞浆及细胞核未见着色(图9、图10),经细胞计 数及计算机图像分析评分均评定为阴性。OPN在胆脂瘤中表达的阳性率为76%,17例 呈强阳性表达,2例呈中等强度阳性表达,6例不染色,外耳道骨部皮肤均为阴性表达, 2 经统计学分析有显著性差异(?21.71 P?0.05)。 表一 OPN在中耳胆脂瘤及外耳道上皮中的表达 例数 阳性阴性 胆脂瘤 25 19 6 外耳道皮肤15 015 2 (?21.71 P?0.05) 13-暨南大学硕士学位论文讨论 胆脂瘤中耳炎其主要的特征表现为中耳腔内存在大量的、增殖的、角化的鳞状上 皮和邻近骨质的破坏,以及程序性角化细胞凋亡,导致腔内角化碎屑的堆积。目前国 内外学者研究了胆脂瘤上皮的特征、骨质破坏吸收和角化碎屑的堆积等,把中耳胆脂 瘤的病因和骨破坏发病机理的研究带到了一个新的领域,但尚未完全阐明其的确切机 [28] 理 。胆脂瘤最重要的临床特征和病理生理学过程,就是对骨质的破坏和吸收,导致 严重的颅内、外并发症。人们对中耳胆脂瘤引起的骨质破坏机制进行了大量研究,并提 出了许多理论:胆脂瘤的机械压迫作用、慢性感染引起骨髓炎、pH 值改变、破骨细 [29] 胞的骨溶解作用、酶类介质的骨吸收作用、细胞因子参与的骨质破坏作用等等 。这 些理论并非相互独立,而是彼此联系,如细胞因子不但能激活破骨细胞的活性,还能 激活炎性细胞和上皮细胞释放一系列生物酶引起骨组织脱钙,骨基质、骨蛋白的溶解, [30] 最终导致骨吸收 。尽管胆脂瘤骨质破坏的确切病因尚未清楚,但细胞因子在中耳胆 脂瘤骨质破坏机制中所起的重要作用日益受到人们的重视。研究较多的是白细胞介 素、肿瘤坏死因子、淋巴毒素、细胞黏附分子、热休克蛋白、膜联蛋白、转化生长因 子、细胞角蛋白等。目前,骨桥蛋白OPN在各种恶性肿瘤方面的研究比较多,但在 中耳胆脂瘤骨质破坏方面的研究甚少。 1. OPN与胆脂瘤骨质破坏的关系 本实验的25例胆脂瘤的标本中,大部份胆脂瘤上皮细胞浆被染成棕黄色和褐色。 OPN在胆脂瘤中表达的阳性率为76%,19例呈阳性表达,与正常外耳道皮肤比较,存 2 在显著性差异(?21.71 P0.05)。25例胆脂瘤的病例中,经高分辨率螺旋CT颞骨扫 描,并行三维重建即虚拟耳镜观察,25耳术前轴位、冠状位锤骨、砧骨和镫骨上部结 构部分破坏,上鼓室及鼓窦入口扩大。虚拟耳镜提示22耳有听骨链不同程度的骨质破 坏,其中19例OPN表达阳性。手术证实,胆脂瘤中耳炎均引起骨质不同程度破坏,其 中听骨链更明显,被胆脂瘤包绕者破坏更重。本实验结果表明,OPN阳性者均为CT 和手术证明骨质破坏较严重病例,说明胆脂瘤中耳炎对鼓室结构及听骨链的骨质破坏 可能与OPN有一定关系。骨质破坏泛指骨吸收大于骨形成,从而导致骨质的丢失。在生理上,随着年龄的 增长,骨吸收也大于骨形成,但在一些病理过程中,只有骨的吸收而不伴骨的重建,14-暨南大学硕士学位论文 同时有炎症介导破骨细胞增加,导致明显的骨质破坏。在骨吸收过程中,起主要作用 的是多核破骨细胞,它的多少以及活性直接决定骨吸收的能力。破骨细胞与骨表面接 触后,其腹部覆盖在骨的表面,其背部与骨髓接触。在覆盖区的周边,由游离核糖体 组成的均质状透明带(clear zone)把细胞边缘和骨表面封闭起来。透明带通过足体与 骨表面相连,体内的长束状肌动蛋白细丝可穿越细胞膜,通过粘连蛋白与细胞外基质 相连,使被覆盖区形成一个封闭的微环境,这一过程称为破骨细胞的粘附,破骨细胞 [31] 的骨吸收就在这个微环镜内进行 。 [32] OPN在破骨细胞黏附于骨基质的过程中发挥了重要作用。Uno Y 等通过电镜观 察胆脂瘤周围的破坏骨片,发现了活性破骨细胞的存在,认为破骨细胞在胆脂瘤的骨 破坏中发挥重要作用。破骨细胞性骨吸收是一个细微的调节过程,包括以下序列步骤: 多核细胞的移动和成熟、破骨细胞前体细胞聚集到吸收位点、破骨细胞识别和黏附于 骨基质、破骨细胞的极化和基质的降解。OPN 在破骨细胞黏附于骨基质的过程中发挥 了重要作用,它可促进破骨细胞与骨基质的黏附,诱导破骨细胞的破骨过程,OPN分 子中的 RGD 序列对于破骨细胞与骨基质间黏附以及破骨细胞的极化和破骨细胞介导 的骨吸收非常重要,在破骨细胞表面存在 α β 整合素受体,可以结合 OPN 分子中的 v 3 特殊的 RGD 序列,从而激活整合素受体,通过信号系统的传递调控某些水解酶基因 的表达,促进破骨细胞在骨基质内的黏附和迁移,为骨吸收创造条件。 [33] OPN 对破骨细胞有趋化作用,可增强破骨细胞的移动和聚集。Uemura 等 证实 OPN 可通过与 α β 整合素受体间相互作用来调节破骨细胞的活性,OPN 可诱导破骨 v 3 细胞表达 MMP-9、组织蛋白酶-K 和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)来降解骨基质; [34] Chellaiah等 实验显示 OPN可刺激破骨细胞表面 CD 44的表达,而 CD 44可显著提 高破骨细胞的活力以及促进骨吸收作用,当在动物实验中敲除 OPN基因后,观察到 CD [35] 44在破骨细胞的表达明显减少,同时发现破骨细胞功能异常和骨吸收减少; Ihara 等 也观察到 OPN 基因敲除后骨内破骨细胞数量明显减少,PTH 诱导的骨吸收作用也明 [36] 显减弱;Koyama 等 研究了 OPN在高磷负荷饮食诱导的骨丢失中所起的作用,发现 野生型小鼠在给予高磷饮食后出现明显的骨密度降低和骨量减少,而 OPN 基因敲除 小鼠则无此改变,进一步研究显示两种小鼠的骨生成参数无明显差别,而野生型小鼠 的骨吸收参数破骨细胞的数量、活性却明显高于 OPN 基因敲除小鼠提示 OPN 可能 对刺激破骨细胞的数量和活性具有重要作用。 此外,胆脂瘤组织对周围骨壁是一种持续性的机械性压力。有研究证实,对于机15-暨南大学硕士学位论文 械压力骨细胞的分子反应中的 OPN的 mRNA表达水平在早期急速增加,破骨细胞及 吸收陷窝的数量在这一时期也增加。在压力区中,破骨细胞、成骨细胞及骨相关细胞 等的 OPN 表达可达 90%。这些高表达的 OPN可作为一种趋化因子引致前体破骨细胞 迁移到骨表面,并介导与破骨细胞表面整合素的结合而增强骨吸收。胆脂瘤组织对周 围组织的机械性压力也可能引起 OPN 表达水平增加,从而发挥对破骨细胞的作用, 促进周围骨质破坏。以上研究均证明 OPN 对破骨细胞的生理功能起到积极 的促进作 用,其原因可能是 OPN 促进破骨细胞的黏附和提高破骨细胞的溶骨活性,其中具体 的作用机制还有待更深入的研究。 2.展望目前,随着耳显微外科技术的进步,胆脂瘤中耳炎已经得到有效的治疗。但即使 是手术技术很熟练的耳外科医师完成很成功的手术,仍难免术后中耳胆脂瘤的复发 [37] 。胆脂瘤中耳炎仍然是严重威胁人类健康的中耳疾病之一,其发生、发展和侵袭性 是一个复杂的病理过程,OPN靶向药物治疗有望通过改变OPN的基因表达?封闭OPN 受体等方法,阻滞OPN的合成和OPN的生物作用,从而达到预防和治疗中耳脂胆瘤的 目的,对于胆脂瘤中耳炎防治的深入研究可能会有新的启示。16-暨南大学硕士学位论文结论 骨桥蛋白 OPN在中耳胆脂瘤上皮的表达明显高于外耳道骨部皮肤,提示 OPN 可 能与胆脂瘤引起骨质破坏有一定关系。 17-暨南大学硕士学位论文 ?考文? 1. 黄选兆,汪吉宝.实用耳鼻咽喉科学[M],北京:人民卫生出版社第一 版,1998:852~ 854 2. Nanci A. Content and distribution of nonoclollagenous matrix proteins in bone and cementum: relationship to speed of formation and collagen packing density. J Struct BiolAbstract, 1999,126:256~269 3. Denhardt DT, Noda M, O’ Regan AW, et al. Osteopontin as a means to cope with environmental insults: regulation of inflammation, tissue remodeling, and cell survival.J Clin Invest, 2001,107:1055~1061 4. Safran JB, Butler WT, Faxach-Carson MC. Modulation of OPN posttranslational state by +2 1α,25-OH2D3. dependence on Ca influx.J boil Chem, 1998,273:29935~29941 5.Ashkar S, Weber GF, Panontsakopoulou V,et al. Eta-aOPN: an early component of type ?cell-mediated immunity.Science,2000,287:860~864 6.Nagata,T,Todescan R, Goldberg HA, et al. Sulphation of secreted phosphoprotein 1Suppl,OPN is associated with mineralized tissue formation. Biochem Biophys Res Commun, 1989,165:234~240 7. Parrish AR, Raoms KS. 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