神经丝的完整性对线状溶酶体形状与分布的影响

神经丝的完整性对线状溶酶体形状与分布的影响 神经丝的完整性对线状溶酶体形状与分布 的影响 第35卷第2期 2004年4月 解剖学报 ACTAANATOMICASINICA Vo1.35.No.2 ADr.2OO4 神经丝的完整性对线状溶酶体形状与分布的影响 黄瑛柳达石玉秀. (1.温州医学院附属二院超声科;2.温州医学院附属二院骨科,温州325027 3.中国医科大学组织学胚胎学教研室,沈阳110001) [摘要]目的观察神经丝的完整性是否对线状溶酶体的形状与分布有影响.方法采用SABC单克隆抗 体免疫组织化学法,免疫电镜及酶组织化学,电镜酶组织化学技术观察钒酸盐处理后培养的神经元内神经丝蛋白 NF-H及线状溶酶体的改变.结果当神经丝的完整性被破坏时,神经丝蛋白向核周聚集,并伴随线状溶酶体亦 向核周聚集并形状改变.结论钒酸盐通过多途径作用,使神经丝过度磷酸化,失去装配能力,当神经丝结构被 破坏时,线状溶酶体的形状及分布都发生变化.线状溶酶体的形状与分布对神经丝的完整性有依赖作用. [关键词]神经丝;线状溶酶体;钒酸盐;神经细胞培养;免疫组织化学;电镜;大鼠 [中图分类号]R329[文献标识码]A[文章编号]0529.1356(2004)02—198 THEEFFECTOFTHEINTEGRITYOFNEUROFILAMENTONTHE SHAPEANDDISTRIBUTIONOFNEMATOLYSOSOME HUANGYing.LIUDa2.SHIYu—xiu (J.DepartmentofUhra~ound,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou32 5027,China 2.DepartmentofOrthopaedics,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalColloge,Wenzhou 325027,China 3.O~partmentofHistologyandEmbryology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China) [Abstract]ObjectiveToconfirmthatiftheintegralityofNFhaseffectontheshapeanddistributionofNLY. Methods usingSABCmonocolonantibodyimmunohistochemistry,electronmicroscopy,immunoeytochemistr y,andenzymocytoehemistryto observethedisorderofNF—HandthechangesofdistributionandshapeofNLYaftervanadatetreated.Re sultsWhentheinte— gralityofNFwasdamaged,theproteinsofNFgatheredtowardsnuclearaccompanywiththesimilarmov ementsofNLY,meanwhile theshapeofNLYalsochangedintoroundfromthread—likeshape.ConclusionThroughdifferentwaysw eused,vanadatecan over—phosphateNFproteinsanddestroytheassembleability.WhetherNFhasacompletestructureisim portanttotheshapeand distributionofNLY,whichwillbechangedwhenthestructureofNFisdisorganized. [Keywords]Neurofilament;Nematolysosome(NLY);Vanadate;Neuronculture;Immun0cyt0chemis ry;Eleetonmicros— copy;Rat 神经组织中的神经丝(neurofilament,NF)作为神 经元骨架中间丝的一种,是极为复杂和特殊的.它 不仅起支持细胞的作用,并决定细胞的形状,还参与 一 些细胞内和细胞外的运动,如物质运输,能量转 换,细胞分化,细胞转化以及细胞器在细胞内分布及 跨膜信号的传递等一系列重要的生物学过程…. SDS电泳表明,神经丝蛋白分为200,160,68kD3种, 分别称NF—H,NF—M,NF—L.NF—H在相邻的NF之间 或NF与微管之间形成横桥,使轴突的结构更稳定. 神经元内线状溶酶体(nematolysosome,NLY)的 [收稿日期]2002—0827[修回日期]2003—02.21 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(39970383) [作者简介]黄瑛(1975一),女(汉族),辽宁省沈阳市人,医师. *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) E-mail:Huangying712@eyou.conlTel:(0577)88427521 存在与神经元的功能有着密切的关系.轴突不能合 成的物质,可以通过溶酶体及其前体借轴浆运输供 给.有学者认为,NLY的运动依赖于细胞骨架的完 整性. 为了证实神经丝的完整性对NLY形状与分布 的影响,观察神经丝的网络样结构被破坏后溶酶体 形状与分布的改变.本实验主要采用神经细胞培养 方法,以NF—H的分布代表神经丝的分布,采用优先 解聚神经丝的药物——钒酸盐处理神经元.钒酸盐 是一种小分子,容易通透细胞膜.低浓度的钒酸盐 被认为具有模拟胰岛素的第二类作用,也是酪氨 酸磷酸酶(PTPase)的抑制剂,它可使神经丝过度 磷酸化,降解为小分子,从而破坏其整体结构,由此 推测线状溶酶体的物质运输可能依赖于神经丝的完 整性 黄瑛等.神经丝的完整性对线状溶酶体形状与分布的影响 材料和方法 1.细胞培养 健康Wistar新生大鼠,出生1d,由中国医科大 学实验动物部提供.断颈处死大鼠,取出胸腰段脊 髓,胰酶消化后用DMEM培养基的全培养液(含 10%胎牛血清,10IU/L青霉素,100mg/L链霉素, 100mmol/LHEPES)培养脊髓神经元.调整细胞密 度为10×105个/ml,接种于涂有大鼠尾胶的盖玻片 或聚苯乙烯薄膜上,置于含有5%CO,的孵箱中,每 3d更换培养基的2/3,37clC下培养至11d. 2.神经丝的完整性对NLY的影响 将神经元随机分成2组:A组:正常组;B组:加 入10~mol/L正钒酸钠(pH7.2),50l/孔,培养12h 结束. 2.ISABC免疫细胞化学操作及电镜技术:免疫 细胞化学反应——将盖玻片用Hank液漂洗,冷丙酮 固定5rain,1%TritonX一100作用10rain.漂洗后用 正常血清封闭液室温作用20rain.将抗小鼠神经丝 单克隆抗体200(NF200,sigma公司)稀释成1:300, 4clC过夜.对照组以PBS代替一抗孵育,用生物素标 记的二抗(羊抗鼠)室温作用60rain,再用0.02mol/L PBS漂洗,SABC室温作用60rain,漂洗.DAB—H,O, 作用10min,封片,镜检.电镜技术将聚苯乙烯薄膜 用1%锇酸在4clC条件下固定30rain,经酒精梯度脱 水,丙酮置换后,Epon812树脂包埋,37clC12h,45clC 12h,60clC24h,超薄切片,醋酸铀单染色,JEM一 1200EX透射电镜下(65kv)观察. 2.2ACP(AcidPhosphatase)酶组织化学操作及电 镜技术:光镜操作:将接种有细胞的盖玻片用Hank 液漂洗,用含有3%的多聚甲醛和0.25%戊二醛的 混合固定液(0.1mol/L二甲砷酸钠配制,含8%蔗 糖,pH7.4)4~C固定30rain.漂洗后,在孵育液中 37clC孵育100rain.组织化学对照组加入终浓度为 10mmol/L的NaF.1%硫化胺染色,光镜镜检.电镜 操作同免疫细胞化学反应的电镜操作. 结果 1.光镜免疫染色 A组:可见神经元体积较大,突起明显,NF—H阳 性反应为棕黄色,分布在胞质及突起内,染色均匀; 核膜及核仁处浓染,核质淡染(图1).B组:神经元 形状变化不大,NF阳性反应呈不均匀分布,主要聚 集在核周,细胞周边及轴突内,而胞质则呈淡染区, 核区呈浓染(图2). 2.免疫电镜 A组:神经元核大而圆,核仁明显,NF—H呈丝絮 状,遍布胞质,突起内可见排列呈整齐的束状,核膜 处呈高电子密度浓染(图3).B组:阳性反应呈不均 匀团絮状,大多集中在核周,胞膜处亦有密集区(图 4). 3.光镜下ACP酶反应 A组:ACP酶阳性反应为棕色颗粒,散在分布于 整个神经元胞质,突起内亦有同密度着色;细胞核呈 阴性反应(图5).B组:ACP酶阳性反应密集在神经 元的核周,也有部分集中在轴突内(图6). 4.电镜酶组织化学染色 A组:在神经元的突起内有电子密度高的长条 状ACP酶阳性反应,NLY多分布在轴突内,伴有线 粒体的存在(图7).B组:神经元突起内的线状ACP 酶阳性反应分布减少,核周溶酶体数有增加(图8). 讨论 近年来发现,以胰岛素为代表的因子是通过靶 细胞表面的一类称为酪氨酸激酶受体的蛋白质起作 用的,钒酸盐具有模拟胰岛素第二信使的作用,是通 过蛋白激酶旁路作用的.钒酸盐所导致NF—H的 “皱缩”可能是由于:1.钒酸盐特异性抑制酪氨酸磷 酸酶(PTPase),通过抑制酪氨酸的去磷酸化,使酪 氨酸激酶(F’TKase)处于磷酸化状态,2.发挥胰岛素 样作用,激活酪氨酸激酶,使神经丝过度磷酸化,优 先改变神经丝的磷酸化状态,破坏其网络样结构,导 致其功能异常j.实验中观察到NF—H的网络样结 构的消失,多数集中到核区附近. 此外钒酸盐还可升高胞质钙离子及cAMP 浓度.通过改变胞质内的钙离子浓度激活胞质内的 某些酶,使其磷酸化.ca激活的中性硫醇蛋白酶 和另一种由ca激活的水解酶可优先解聚中问丝 蛋白的N末端,被切去N末端的中间纤维蛋白失去 了装配成纤维的能力. Vase曾证实溶酶体膜上的动蛋白(kinesin)和力 蛋白(dynesin)是存在于溶酶体和微管之间的横桥, 使溶酶体保持线性结构,进行顺向或逆向运动.正 如前述,NF—H恰恰是存在于相邻神经丝或神经丝与 微管之间的横桥,对于稳定细胞骨架起着重要的作 用.NLY,微管及NF—H三者在结构与功能上是不可 分割的.应用钒酸盐破坏神经丝的结构后,很有可 能是破坏了线状溶酶体,微管及NF—H三者相连的 部位,使作为侧臂的NF.H不再对微管起稳定的支 架作用,相互发生脱离,影响了线状溶酶体对微管的 依赖. 参考文献 [1]SakaiM,ArakiN,OgawaK.Lysosomalmovementduringheterophagy andautophagy:withspecialreferencetonematolysosomeandwrappingly- 袁华等大鼠侧啮窜注射甜珀酸后下丘脑视上核星形细胞和神经元埘高渗刺激反应的影 响?l29 甘珀酸+高渗组:高渗刺激后GVAP/Fos阳性星 形细胞的分布,时相特征与未注射CBX的单纯高渗 组相同(罔3.5,6);而Fos阳性神经元的数量明显比 单纯高渗组减少(图4.7,8) 2.血浆加压素含量 高渗组与高渗刺激前比较,经静脉注射高渗溶 液后45min,血浆加压素含量明显升高(P<001), 而事先经侧脑室注射CBX后再注射高渗溶液,45 rain后,血浆加压素含量与刺激前无明显差异(P> 005)(图9).. 9%NacICBX十q%NaCl 圈9各组l?浆VP含量9%NaCI组注射后45mln.血浆vP岔 量明显升高CBX+9%NaCI组注射9%NaCL后45min 血浆v})含赶没有明显升高??P<0()I ?昌9Vpcont~n[inInPbk,~MplasmaIn9e/,NaCIi@wti{mgroup thevasopm~sion(onte~t45mlnatIeJinjectionincrement slgnifit~nfiythanthebaselineWhilepre—injetring carI1Pnlmx(l0neintothelateralventntleandmHow~dby9% NaCIinjection,VPcont~riIflidn’IinE-m??P(0OI }一l; 讨论 越来越多的研究发现,神经胶质细胞不仅对神 经兀起支持,营养作用,神经元和神经胶质细胞之间 存在广泛的多种途径的相互信息交流,形成了一个 复杂的神经元.胶质细胞信息网 本实验观察到: 1.高渗刺激后45rain.血浆VP含量明显升高;SON 中的神经元和星形细胞在高渗刺激后大量激活.表 现为GFAP阳性(星形细胞)和Fos阳H(神经元).两 者分布相同,关系密切.提示SON星形细胞不仅对 低渗刺激起反应,抑制神经元释放vP,也可以对 高渗刺激发生反应.本摩的其他研究发现在多种 刺激条件下如低血压,LPS腹腔注射”,星形胶质 细胞可以被激活,并有一定的机能定位. SON中的神经元和星形细胞如何感知渗透压的 改变呢?目前主要有两个观点:(I)Voisin等.报道, 细胞外Na浓度的改变口以引起SON神经元Na 通道改变而导致信号转导;(2)另一些学者认为, 渗透压的改变可以引起细胞皱缩,通过容积依赖性 离子通道而不是Na通道引起神经元的去极化.本 实验中,给大鼠静脉注射的液体体积相同,差异仅在 于Na的浓度,结果显示9%NaCI溶液可以激活 SON大量神经元和星形细胞,提示细胞外Na浓度 升高是引起神经元和星形细胞反应的一个重要因 素. 2星形细胞的Fos免疫组织化学反应阳性出现和到 达高峰的时间都要早于神经元其具体机制尚不清 楚.星形细胞突起伸至室管膜直接与脑脊液接触. 终足与血管壁接触;可能与来自其他机能区神经元 的轴突终末之间形成突触样结构;因此星形细胞可 以直接感知来自脑脊液和血液的渗透压的变化. Nedergaard报道,神经元和星形细胞共培养. 局部电刺激使星形细胞钙升高,可以引起迟发的神 经元钙波Pasti等报道,用mGluR拮抗剂处理海 马和视皮质的脑片,星形细胞钙升高,随后神经元出 现滞后的钙峰Huss)发现下丘脑视上核的星形 细胞内含有丰富的牛磺酸.在低渗刺激下,胶质细胞 肿胀引起牛磺酸释放,牛磺酸与神经元上的甘氨酸 受体结合,引起抑制反应,神经元减少vP的释放 以上=结果都提示星形胶质细胞可更早感知渗透压的 改变,并调控神经兀的反应. 3.若事先经侧脑室注入甘珀酸(CBX)后,再给予高 渗刺激,血中vP含量不升高,视核内星形细胞 GFAP/Fc阳性反应与单纯高渗组无差别.而Fos阳 性神经元明显减少. 胶质细胞和神经元可以通过多种途径进行信息 交流:如突触样结构,缝隙连接和3种成分构成的突 触复合体结构”..!等,缝隙连接使偶联的细胞问 交换小分子物质,并使r?兴奋的细胞产电偶联.. 缝隙连接的偶联是动态的其强度受多种神经递质/ 凋质的影响神经元’i胶质细胞混合培养物中已证 实两者之间存在缝隙连接偶联,提示两者之问可以 通过缝隙连接进行离子和化学信息的交流…本 实验室在成体观察到星形细胞和神经元之间存在由 不同的Connexin蛋闩(Cx32/Cx43)构成的缝隙连 接 甘珀酸足缝隙连接的阻断剂.可阻断星形细胞 和神经之间的缝隙连接一单纯高渗刺激后45 rain,大鼠血浆VP含量显着升高;而预先脑窜注射 CBX后.血浆巾的vP含量却维持基态水平.不升 高免疫组织化学染色显示SON中GFAP/Fns双标 己的星形细胞形态,数量和时间序列与未阻断组无 差别,而Fos阳性的神经元数目显着减少,其中不能 排除甘珀酸阻断神经元之间的缝隙连接,但就其阻 断星形细胞和神经元之间缝隙连接后仪阻断神经元 的反应,提示两者之间通过缝隙连接进行的信息交 蔓 一 上 一 山I r...L一 V01.35.No.2黄瑛等.神经丝的完整性对线状溶酶体形状与分布的影响20l sosome[J].JElectronMicrTech,1989,12(2):101—131. [2]ShechterY.Insulin—mimeticeffectsofvanadate:Possibleimplicationsfor futaretreatmentofdiabeteslJj.Diabetes,1990,39(1):1-5. [3]ZhuMX,WuGL.Theresearchoftyrosinephosphataseofhumanrrohe- moglobin[Jj.JBiochem,1994,10(2):174-179. 朱茂祥,吴国利.人血红蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶的研究[J].生物 化学杂志,1994,10(2):174—179. [4]GomoriG.Histochemistryofenzymes[J].JMtSinaiHospNY,1952, 19(3):446—451. [5]FischerE,charbonneauH,TanksN.Proteintyrosinephosphatases:adi— versefamilyofintracellularandtransmembraneenzymeslJjScience, 1991,253(5018):401—406. [6]WanXC,YangTZH,XuCHT.ModernNeurobiology[M].Beijing, TheAssociatedPublishingCompanyofBeijingMedicalUniversityandPe- kingUnionMedicalCollege.1999:64—70. 万选才,杨天祝,徐承焘.现代神经生物学[M].北京,北京医科 大学中国协和医科大学联合出版社,1999:64—70. [7]NechayB.Mechanismsofactionofvanadium[J].AnnuRevPharmacol Toxical,1984,24:501—524. [8]RodenM,LienerK,FurnsinnC,eta1.Non—insulin-likeactionofsodi— umorthovanadateintheisolatedperfusedliveroffed,non—diabeticrats [JJ.Diabetologia,1993,36(7):602-607. 图版说明 图1SABC染色可见培养的神经元体积较大,突起明显,NF—H阳性 反应为棕黄色,分布在胞质及突起内,神经丝染色均匀(?), 核膜及核仁深染,核质淡染.×400 图2钒酸盐处理后,B组的神经元NF.H免疫组织化学染色,可见 细胞形状变化不大,神经丝免疫阳性反应主要聚集在核周 (?).×400 图3A组的脊髓神经元NF.H免疫电镜观察可见电子密度高的NF. H呈丝絮状,突起内可见排列呈整齐的束状(?).×100000 图4钒酸盐处理后,B组的脊髓神经元NF.H免疫电镜观察可见免 疫反应产物呈现不均匀团絮状?集中在核周.×30000 图5A组的脊髓神经元ACP酶组织化学染色,可见阳性产物为棕 色颗粒,散在分布于整个胞质(?),突起内亦有着色,细胞核 呈阴性反应.×400 图6钒酸盐处理后,B组的脊髓神经元ACP酶组织化学染色,可见 ACP酶阳性反应产物在核周密集分布(?).×400 图7A组的脊髓神经元ACP酶电镜观察可见在突起内有电子密度 高的长条状ACP酶阳性反应产物,沿突起长轴走行(?). ×24000 图8钒酸盐处理后,B组的脊髓神经元ACP酶电镜观察可见线状 ACP酶阳性反应产物在突起内的分布减少,核周有圆形溶酶 体(?).×24000 Explanationoffigures Fig.1SABCImmun0cvtochemicalstaining:theneuronhasafullvolumand processes.Immunochemicalpositivereactionsarewell-distributedin theperikaryonandprocesses(?).Thenuclearmembraneandnucle- olusweretinnedwithdensitysedimentandthenucleoplasmwas light.×400 Fig.2Immunocytochemicalstaining:B,afterthetreatmentwithvanadate, nosignificantchangeoftheshapeofthecell,butthenetworkofNF- Hhasdisappeared,mostofthemaggregatingaroundthenucleus (?).whiletheplasmawasnegativereactionregion.×400 Fig.3Electronmicroscopeimmunocvt0chemicaJstaing:A.NFisconsistedof bundlesoffilamentsthroughouttheprocesseswithwell-arranged structure.(?).×100000 Fig.4Electronmicroscopyimmunoc1rtochemicalstaing:B,afterthetreat— mentwithvanadate,NFaggregatdaroundthenucleus(?),many masswithpositivereactionappeared.×30000 Fig.5Enymocytochemicalstaing:A,ACPasepositivereactionswerebrown- blackgranules,whichwerefoundinthecytoplasm(?),axon,ex- ceptthenuclearregion.×400 Fig.6Enymo.ytochemicalstaing:B,ACPasepositivereactionalsocollected tothenucleus(?J.×400 Fig.7Electronmicroscopeenzymocytochemicalstaing:A,itwasthread-like highdensityblacksedimentinaxon(?).×24000 Fig.8Electronmicroscopeenymocytochemicalstaing:B,thethread-like structureofNLYdecreaseintheprosessesandtheroundlysosomein- creasearoundthenucleusf?)x24000 (编辑郭崇洁)