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食管鳞癌p16、p15基因杂合子缺失的研究

2017-12-03 8页 doc 23KB 28阅读

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食管鳞癌p16、p15基因杂合子缺失的研究食管鳞癌p16、p15基因杂合子缺失的研究 食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究 摘 要 目的:探讨P16和P15基因与ESCC发生发展的关系。 方法:应用显微切割、PCR、凝胶电泳、AgNO3染色等技术,检测食管 鳞癌(ESCC)和高级别不典型增生中P16、P15基因杂合子缺失(LOH), 对照正常细胞,分析ESCC和高级别不典型增生组织中LOH的变化,并 就LOH率与患者的临床病理参数分别进行单因素分析。结果:ESCC组 织中的LOH率为29.7%,高级别不典型增生组织中的LOH率为16.5%。 应用SPSS软件...
食管鳞癌p16、p15基因杂合子缺失的研究
食管鳞癌p16、p15基因杂合子缺失的研究 食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究 摘 要 目的:探讨P16和P15基因与ESCC发生发展的关系。 方法:应用显微切割、PCR、凝胶电泳、AgNO3染色等技术,检测食管 鳞癌(ESCC)和高级别不典型增生中P16、P15基因杂合子缺失(LOH), 对照正常细胞,分析ESCC和高级别不典型增生组织中LOH的变化,并 就LOH率与患者的临床病理参数分别进行单因素分析。结果:ESCC组 织中的LOH率为29.7%,高级别不典型增生组织中的LOH率为16.5%。 应用SPSS软件对LOH率与患者的性别、组织分化、淋巴结转移进行单 因素分析,差异均无显著性(P>0.05)。结论:?从正常鳞状上皮 到不典型增生再到癌变的过程中存在基因的异常累积。?P15基因可 能与食管鳞癌的发生发展相关。?D9S162位点或其附近可能存在与 ESCC发展相关的抑癌基因。 关键词 食管鳞状细胞癌;P16;P15;抑癌基因;杂合性丢失 Abstract Objective:To investigate P16 protein expression ,we infer the role and clinical significance of P16 gene during the occurrence and development of hepatocellular carcinoma. Methods:P16 protein expression was quantitatively determined by im muno-histochemistry in 26 cases of hepatocellular carcinoma.Simultaneously adjacent tumor tissues were contrasted. Results:P16 protein expression in 26 cases of 1 hepatocellular carcinoma was significantly lower than that in adjacent tumor tissues. The expression of P16 protein becomes lower with the increase in grading (P<0.05).Conclusions: Expression absence of P16 gene exist in part of HCC cell,which may be related with developmentand histo - differentiation of HCC.P16 protein may serve as an indicator to predict the prognosis of patients. Key words Hepatocellular carcinoma;P16gene;Immunohistochemistry 食管癌分子生物学研究证明EC中存在一些有规律的染色体 改变。P16和P15基因定位于9p21,是目前公认的抑癌基因,但其与 ESCC发生发展的分子机制尚不十分清楚。我们通过显微切割、PCR、 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、AgNO3染色等技术,检测食管高级别不典 型增生和鳞癌组织中P16、P15基因上3个微卫星位点的LOH情况,并 就LOH率与患者的临床病理参数进行相关分析,探讨ESCC发生发展过 程中基因的变化,为ESCC的早期诊断及预防提供一定的依据。 1 与方法 1.1 材料 2 45例ESCC标本(均伴有高级别不典型增生及正常组织)均来自山西省肿瘤医院,按照世界卫生组织2003年新标准进行病理分级、分期,,,。所有标本术后立即无菌取材,70%酒精固定,石蜡包埋,同时收集病人有关的临床病理资料。 1.2 主要试剂及仪器 主要试剂购自美国Research Genetics公司;基因扩增仪:TC-48/H(t)(美国);高压电泳仪:EC3000-90(美国)。 1.3 制片 选定具有鳞状细胞癌、高级别不典型增生及正常组织的蜡块,切取5μm厚的切片若干张,取其中1张做HE染色,供判断病变部位和显微切割参照 用。其余切片采用改良HE染色:常规脱蜡,去离子水冲洗1次;快速伊红染色,去离子水冲洗2次,浸泡在10%的甘油TE缓冲液中待用。 1.4 显微切割并制备目的DNA 3 将改良HE染色的组织切片置于显微镜工作台上,根据HE染色切片所示区域,在低倍显微镜下找到目的细胞区,用一次性的无菌皮试针头在被切割组织周围刻划,将目的细胞与周围组织分离,然后用针尖粘取纯目的细胞组织,分别放入已标记好的盛有1%蛋白酶K消化液的eppendoff管中。37?恒温消化24h,48h,95?灭活蛋白酶K 10min,离心后取上清制成样本DNA液,4?保存。 1.5 PCR扩增 反应体系:10μL(包括ddH2O 5.7μL、10×buffer液1.0μL、dNTP 2.5mmoL/L 0.8μL、引物20μmoL/L 0.2μL、Taq酶5U/μL 0.1μL、待扩增样本DNA液2.0μL);反应条件:95?变性10min、95?变性1min,55?退火1min,72?延伸1min,35个循环、72?延伸10min;取出PCR反应管后立刻放入冰盒中,6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:取40%聚丙烯酰胺母液15mL,加入尿素48g,5%TBE 20mL,加水至100mL;用前取上述液80mL,加入500μL的APS和35μL的 TEMED混匀。电泳液为1%TBE缓冲液。60W,1800V电泳1.5h,2.5h。AgNO3染色,室温凉干。 1.6 结果判断 当正常组织扩增产物为2条分开的主要条带时,说明此位点 4 为杂合性,判为有意义的信息个体。肿瘤条带中的一条信号强度与其正常对照组织相应产物比较,如减弱50%以上或消失,判断为杂合性丢失;与正常对照相比,如显示两个密度相似的条带,判为未丢失;当样本的正常对照组织的扩增产物仅为1条时,说明此位点为纯合子,为非信息个体。 2 结果 45例伴有高级别不典型增生的ESCC患者,男29例,女16例;年龄41岁,70岁,平均年龄为65.2岁;高分化5例,中分化34例,低分化6例;15例伴有淋巴结转移。 2.1 等位基因的LOH分析 45例ESCC标本中3个微卫星点的检测结果见图1、表1。表1 45例伴高级别不典型增生的ESCC患者的LOH检测结果(略) 食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究有信息的病例中,食管鳞癌总LOH率为29.7%,高级别不典型增生总LOH率为16.5%;在食管鳞癌组织中,3个微卫星位点的LOH率依次为D9S171(36%)、D9S162(36%)、D9S1748(17%);在高级别不典型增生组织中,3个微卫星位点的LOH依次为D9S171(29%)、D9S162(15%)、D9S1748(7%)。其中,第6例患者的D9S162位点,在高级别不典型增生组织中出现了LOH, 5 而在相应的鳞癌组织中却未出现LOH。 2.2 临床病理参数分析 应用SPSS11.0软件对LOH检测结果与患者的性别、病理组织学分化及淋巴结转移进行单因素分析未见明显相关性(P>0.05),故未再进行多因素分析。 3 讨论 食管癌的发生是环境因素和宿主因素相互作用的结果,涉及多因素的作用、多基因的变化和多阶段的发展过程,其中一项重要的遗传变化就是多种抑癌基因的失活和癌基因的激活,研究发现抑癌基因的失活常伴有邻近DNA多态标记的丢失,若观察到癌组织的某一染色体区域频发的LOH,此现象提示目标区域可能存在与所研究的肿瘤相关的抑癌基因。 P16和P15属于INK4I(cyclin-dependent kinase 4 inhibitors)家族,都定位于9p21,在细胞周期G1期调控细胞增生。P16蛋白为CDK4特异性抑制剂,通过与细胞周期素D-CDK4复合物紧密结合或与CDK4结合竞争性地阻断细胞周期素D-CDK4复合物的形成,维持RB蛋白非磷酸化状态,阻止细胞从G1期进入S期,抑制细胞增 6 殖。P15从P16分离而来,与P16有95%的序列相同,P16的改变往往伴有P15的改变,目前已被认为是另一个具有研究意义的新的抑癌基因。P16和P15通过不同的机制失活,2,3,,P16失活占优势作用的是启动子区CPG岛异常甲基化,突变和纯合性缺失相对较低,而P15常发生纯合性缺失。 对某种肿瘤的抑癌基因而言,若受检病例中的25%以上发生LOH可视为有意义,4,。有关9p21区域的LOH在各种肿瘤中可见报道,但检测结果很不一致。Hu等,5,通过对56例ESCC患者9p21,p22上多个微卫星位点LOH的检测,并就其与CDKN2A(P16)和CDKN2B的相关性分析认为,CDKN2A的突变和基因内的等位基因丢失在ESCC的演进中都起着重要的作用。本实验检测了与P16基因紧密连锁的D9S1748位点的LOH情况,结果显示其在高级别不典型增生中LOH率为7%(2/30),在癌组织中LOH率为17%(5/30),提示该位点与食管癌早期的发生关系较少。我们检测的另一个位点 D9S171,距9号染色体短臂末端42cm,是距P16较远的着丝粒侧的微卫星位点,座位于P15基因,故D9S171的LOH也就意味着抑癌基因P15的丢失。D9S171的LOH在诸如头颈癌、肺癌、宫颈癌、食管癌等人类肿瘤中都被检测到,但LOH率高低不一,因此推测,15的失活可能在各肿瘤中发挥的作用不尽相同。Xing et al.,2,通过对中国食管癌高发区林县的60例ESCC的研究认为P15附近的D9S171的LOH率很常见(47%)。王全红等,6,等研究发现无论在食管癌高级别不典型增生组织还是癌组织中,该位 7 点都存在较高的丢失率(33%,33%)。本实验检测到该位点在高级不典型增生和癌组织中的LOH率分别为29%和36%,结论与前者相一致,提示P15基因可能与ESCC的发生发展相关。 D9S162(9p22,p23)距P16编码区6cM,是距P16较远的端粒侧的微卫星位点。有关D9S162的LOH报到较少,早期报道9p22,p23区域存在着很高的LOH(41.9%),提示该位点附近可能存在着食管癌抑癌基因。Lichun 等,7,对食管癌9号染色上的17个多态性标记的LOH情况进行了检测,其中9p22,p23区域观察到缺失(>42.9%),我们检测的结果为36%,结果与前者一致,提示该区域可能存在有与食管癌发展有关的抑癌基因。 食管癌是一系列组织病理改变的结果,典型的病理改变包括食管炎、单纯增生、轻度到重度的不典型增生、原位癌,直至最终形成浸润癌,每一步骤包含着许多分子水平的改变。本实验显示正常组织中未发生LOH,高级别不典型增生总LOH率为16.5%,食管鳞癌总LOH率为29.7%,并且各位点随着病变的加重LOH都有不同程度的增加,说明在从正常鳞状上皮到不典型增生再到癌变的过程中存在基因的异常累积。 总之,LOH的检测对筛选、定位和克隆食管癌相关的抑癌基因提供了一个很好的手段,食管癌的发生可能是众多失活抑癌基因协 8 同作用的结果。 参考文献 ,,,Tavassoli F.A., Devilee P. World Health Organization Classification of Tumors.IARC Press,Lyon,2003, 261. ,2,Xing EP, Nie Y, Wang LD,et al. Aberrant methylation of P16INK4a and deletion of P15 INK4b are frequent events in human esophageal cancer in Linxian, China. Carcinogenesis,1999, 20:77,84. ,3,Tokugawa T, Sugihara H, Tani T,et al.Modes of silencing of P16 in development of esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res.2002,62:4 938,4 944. ,4,Muzeau F, Flejou JF, Thomas G,et al.Loss of heterozygosity on chromosome 9 and P16(MST1, CDKN2) gene mutations in esophageal cancer.Int J Cancer.1997,72:27,30. ,5,Hu N, Wang C, Su H,et al.High frequency of CDKN2A 9 alterations in esophageal squamous cell carcinoma from a high-risk Chinese population. Genes Chromosomes Cancer,2004, 39(3):205,216. ,6,王全红,张培红,李 光,等.食管鳞癌及其前驱病变基 因杂合子缺失的研究,J,.中华病理学杂志,2004,33(4):346,349. ,7,Lichun Y, Ching Tang CM, Wai Lau K,et al.Frequent loss of heterozygosity on chromosome 9 in Chinese esophageal squamous cell carcinomas. 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