硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞复制性老化的作用_32105

硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞复制性老化的作用_32105 硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞复制性老化的作用 [标签:来源] 【摘要】 目的:对体外传代培养出现复制性老化的大鼠软骨细胞进行硫酸氨基葡萄糖干预 实验，观察硫酸氨基葡萄糖对软骨细胞复制性老化的影响。方法:将第3代软骨细胞分为空 白对照组、硫酸氨基葡萄糖不同浓度组，传代使细胞进入第4代，同时以第2代软骨细胞为 青年对照组，进行组化检测老化相关β-半乳糖苷酶、流式细胞仪细胞周期和增殖指数、 阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸GAG(glycosaminoglycan)含量和结构、RT-PCR(reverese transcript-polymerase chain reaction)检测?型胶原及Aggrecan蛋白，并对硫酸氨基葡 萄糖抗软骨细胞老化进行分子生物学研究。结果:硫酸氨基葡萄糖显著抑制老化相关β-半乳 糖苷酶的达(P<0.01)，促进鼠软骨细胞增殖，减少G1期细胞含量，促进软骨细胞胞外基质 GAG、?型胶原、Aggrecan蛋白表达(P<0.01)。结论:硫酸氨基葡萄糖具有显著的抗软骨细 胞复制性老化作用。 【关键词】 硫酸氨基葡萄糖;大鼠;软骨细胞;老化 Abstract Objective: To observe the effect of glucosamin sulphate (GS) on replicative senescence of rat chondrocyte subcultivated in vitro by means of GS interfering and controlled experiment. Methods: The 3rd passage chondrocytes were divided into the blank group, different concentration GS groups passaged to 4th generation, the control group of the 2nd passage. The chondrocytes of different groups were detected with the method of histochemistry for S-A-β-gal, for cell life cycle and proliferation index with flow cytometry, for the content and constructure of GAG of ECM with alcian blue test, and for type ?collagen and Aggrecan with RT-PCR. A molecular biology study was also conducted on GS' preventive role against chondrocyte senescence. Results: GS can significantly inhibit chontrocyte's expression of S-A-β-gal, promote chontrocyte's proliferating(P<0.01), reduce cell content in G1 phase, increase content of GAG, and enchance the expression of type ?collagen and Aggrecan of ECM (P<0.01). Conclusion: GS can significantly oppose rat chondrocyte senescence occurred in subcultivation. Key words Glucosamin sulphat(GS); Rat; Chondrocyte; Senenscence 软骨细胞属于终末分化细胞，其在体外的传代培养过程中细胞停滞于细胞周期的G1期， 增殖能力减弱，表型丧失，呈老化状态，这种老化属于复制性老化(replicative senescence)。有实验研究显示，软骨细胞体外传代培养出现复制性老化发生在P4代[1-2]，本研究的细胞传代实验中也发现大鼠软骨细胞在P4代出现老化改变[3]。硫酸氨基葡萄糖(GS)是关节软骨生物合成和刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质，被认为是第一个改变骨关节炎病情的药物。本实验拟考察其对软骨细胞复制性老化的作用，进而为优化组织软骨细胞，为其防治骨性关节炎提供实验支持。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 清洁级SD大鼠(福建医科大学实验动物中心提供，闽验证字20050001，合格证号2005C03)共8只，4周龄，雄性，体重180,200g。 1.1.2 主要试剂 αMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清FBS(HyClone公司);胰蛋白酶Trypsin 1?250(Amersco公司)、?型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司);二甲基亚砜DMSO(Amersco公司);盐酸胍(GnCl)、Alcian blue和TritonX,l00(上海生工公司);β-半乳糖苷(X-Gal)(厦门泰京公司);TRIZOL、RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司);PCR引物(上海生物工程有限公司):type?collagen:上游5'- TGGTGCTGCTGACGCTGCTCATCGCCACGGTCCTA-3'，下游 5'-GCCTTCTGATCAAATCCTCCAGCCATCTGGGCCGC-3'(340bp);Aggrecan:上游5'-CTGCTACACAGGTGAAGACTTTGTAGACATCC-3'，下游 5'-TGCTGTGCCTCCTCAAATGTCAGAGAGTATCT-3'(475bp);内参照β-actin:上游5'-GAGGCATCCTGACCCTGAAG-3'，下游5'-CATCACAATGCCAGTGGTACG-3'(274bp);TaqDNA聚合酶(上海申能博采有限公司);dNTPs(上海申能博采有限公司);DNA分子量标准:pUC Mix Marker(Fermentas公司);GS(浙江海正药业公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 大鼠软骨细胞的取材、培养、分组 取4周龄体重185,200g的SD大鼠，断颈处死，参考Hu等[4]软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37?恒温箱内单层培养，隔3天首次换液，8,10天达85%融合后进行传代培养。前期实验表明从第4代(P4,the 4th passage)软骨细胞开始出现老化[3]，因此，对其进行药物干预的时机为对P3(the 3rd passage)软骨细胞进行传代时(传代后进入P4代)。P2(青年对照组)、P4(老化对照组)培养基中不加任何药物。GS分组参考剂量源于Largo R等[5]、Mattei M等[6]及Dodge GR等[7]实验研究结果。GS 5mg/mL组:加含5mg/mL GS培养基;GS 10mg/mL组:加含10mg/mL GS培养基;GS 15mg/mL组:加含15mg/mL GS培养基。 1.2.2 组化法检测各组软骨细胞β-半乳糖苷酶表达 采用Dimri[8]方法配制缓冲液，A液含0(2mol/L Na2HPO4?12H2O，B液含0.1mol/L柠檬酸溶液。A、B液混合后每1 000mL中的化学成分含量为:5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal) 1g，MgCl2 0.046 6g，NaCl 0.876 6g，铁氰化钾0.164 5g，亚铁氰化钾0.211g，调pH值为6.0。于6孔培养板先置入多聚赖氨酸处理过的玻片，按700个/cm2密度接种各组细胞，温箱培养24小时，取出玻片，在37?预温D-Hank氏液或其它平衡液中漂洗玻片2次，4?预冷的PBS冲洗玻片2次，2%甲 醛室温下固定3,5分钟，PBS冲洗，用新鲜配制的β-gal染色液反应，37?孵育4小时，用ddH2O充分冲洗玻片，固定液(70%乙醇?福尔马林?冰醋酸=20?2?1)固定4分钟，自来水冲洗，核快红复染8分钟，自来水冲洗，烤箱60?脱水1小时，二甲苯透明，阿拉伯树胶封片，细胞周围蓝绿色染色为阳性染色。 采用HPIAS21000高清晰度图像处理系统进行图像分析，计算出各代细胞?型胶原阳性信号面积密度(Sv=?型胶原阳性信号面积和/窗口面积×窗口数);光镜下每个标本随机选5个高倍视野记数细胞，求出阳性表达率(%)。 1.2.3 流式细胞术检测各组软骨细胞的细胞周期及增殖指数 将培养的待测软骨细胞置5mL试管中，用PBS或生理盐水洗2次，制成单细胞悬液，无水乙醇固定细胞，加入PBS调整细胞浓度为5×105,5×106个细胞，加入1mL DNA荧光染料(PI)，室温下避光染色15分钟，以流式细胞仪分析软骨细胞周期及检测增殖指数。 1.2.4 阿立新蓝染色法检测各组软骨细胞糖胺多糖(GAG)含量及分子结构 配制阿力新蓝贮液，将各组软骨细胞用0(25%胰酶消化、收集、裂解，按照Sven[9]的方法进行反应，以溶解液重溶阿力新蓝，将蛋白聚糖沉淀复合物，移入96孔板中，酶标仪600nm波长处测定吸光度A值。检测过程中以ddH2O作为空白对照，裂解液作为阴性对照，进行GAG分子结构的检测，将各组软骨细胞取样裂解，各组均分2子组，通过调节不同的盐酸胍(GnCl)浓度，分阶段对链长及硫酸化程度不同的GAG进行定量检测。 1.2.5 RT,PCR法检测各组软骨细胞?型胶原mRNA表达 RT,PCR法检测:采用TRIZOL提取各代软骨细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，-80?冻存备用。取100ng总RNA，按一步法RT-PCR试剂盒说明操作，扩增条件如下:94?变性40秒，退火40秒，72?延伸1分钟，25次循环，最后72?延伸2分钟后，增产物片段长度为340bp;β-actin:94? 30秒，50?退火30秒，72?延伸30秒，扩增产物片段长度为274bp。取5μL PCR产物在含有1%琼脂糖的0(5×TBE缓冲液中电泳，电压控制在100V，时间控制在30,40分钟。用Gel Doc 2000型凝胶图像分析系统拍照，用Gelworks 1D Intermidiate软件定量分析。 1.2.6 RT,PCR法检测各组软骨细胞Aggrecan mRNA表达 按不同分组进行实验，分别对各组软骨细胞用RT-PCR法检测Aggrecan mRNA表达。方法同?型胶原mRNA检测，其中退火温度为56?。 1.2.7 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件进行分析。进行单因素方差分析，组间比较采用t检验，定量资料实验结果以均数?标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 各组软骨细胞β-半乳糖苷酶检测结果 组化实验表明，GS各组软骨细胞β-半乳糖苷酶表达显著低于P4的表达(P<0.01)，GS各组软骨细胞β-半乳糖苷酶表达显著高于P2的表达(P<0.01)。其中，尤以GS 10mg/mL对β-半乳糖苷酶表达的抑制作用最显著(P<0.01)，见图1。 图1 各组软骨细胞β-半乳糖苷酶表达结果 1.P2×200，2.P4×200，3.GS 10mg/mL×200 2.2 各组软骨细胞G0/G1百分含量和增殖指数(PI) 流式细胞术实验表明，GS各组软骨细胞G0/G1百分含量(80.3%、78.6%、80.6%)均低于P4(84.4%)，其中含量最低的是GS 10mg/mL(78.6%)，其值仍高于P2(79.1%);GS各组软骨细胞增殖指数(19.7%、21.4%、19.4%)高于P4(12.6%)，其中最高的是GS 10mg/mL(21.4%)，见图2。 图2 各组软骨细胞细胞周期G0/G1含量及PI值 2.3 各组软骨细胞GAG含量、分子结构 结果表明，GS各组对软骨细胞分泌GAG均有促进作用，与P4相比，GS各组GAG含量及长链量显著增加(P<0.01)，其中尤以10mg/mL浓度剂量促进GAG表达作用最显著(P<0.05)，其GAG表达量仍低于P2(P<0.01)，见表1。表1 各组软骨细胞GAG含量、分子结构结果(OD值) 2.4 各组软骨细胞?型胶原mRNA检测结果 GS各组对软骨细胞?型胶原mRNA的表达均有促进作用，与P4相比，各组?型胶原mRNA表达量显著增加(P<0.01)，其中尤以10mg/mL浓度剂量促进?型胶原mRNA表达的作用最显著(P<0.01)，但其A值仍明显低于P2(P<0.01)，见图3。 2.5 各组软骨细胞Aggrecan mRNA检测结果 GS各组对软骨细胞Aggrecan mRNA的表达均有促进作用，与P4相比，各组Aggrecan mRNA表达量显著增加(P<0.01)，其中尤以10mg/mL浓度剂量促进Aggrecan mRNA表达的作用最显著(P<0.01)，但其A值明显低于P2(P<0.01)，见图4。 3 讨论 GS是关节软骨生物合成和刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质，该药既能抗炎止痛，又能延缓骨关节炎发展的作用，被认为是第一个改变骨关节炎病情的药物，又因体外实验证实其对软骨代谢有良好作用，也称之为软骨保护剂。GS用于治疗关节软骨退变已得到广泛的认同，从GS对软骨细胞老化的作用这一角度来考察GS治疗作用是一个可行的方法。 组化法检测β-半乳糖苷酶是由Dimri等[8]于1995年发现的细胞老化的一个特征，本实验按照经典的方法对软骨细胞SA-β-Gal的表达进行组化检测，前期实验结果显示，β-半乳糖苷酶染色随着传代培养其阳性表达增多，P4软骨细胞出现大量阳性染色，说明软骨细胞传代培养与其复制性老化的发生直接相关[3]。本实验按照经典的方法对软骨细胞SA-β-Gal的表达进行组化检测，实验结果可以看到，不同浓度的GS均可抑制软骨细胞β-半乳糖苷酶的表达，而GS组中，又以10mg/mL组抑制β-半乳糖苷酶表达的作用最强(P<0.01)，但是增加GS浓度后其抑制β-半乳糖苷酶表达作用未见明显增加，说明在一定GS剂量范围内，GS有抑制软骨细胞老化的作用，但并不能完全阻止软骨细胞老化的进程。 流式细胞术观察细胞周期，细胞周期与细胞中DNA含量密切相关，DNA含量随着细胞周期各期而发生变化。当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变。实验结果表明，GS各组软骨细胞G0/G1期含量均低于P4，其中含量最低的是 GS 10mg/mL，但其值仍高于P2;GS各组软骨细胞增殖指数高于P4，其中最高的是GS 10mg/mL，说明GS对软骨细胞具有一定的调控细胞周期的作用，但其作用不能使软骨细胞达到青年细胞的生长状态。 GAG是软骨细胞外基质中的重要成分之一，其含量直接代表了软骨基质中特异性大分子聚糖体的含量。细胞外基质是细胞附着的基本框架和代谢场所，是维持细胞正常生存、分化和运动的外环境，其中GAG是软骨的主要胞外基质，是关节软骨的主要成分之一。用阿立新蓝法检测硫酸GAG含量及其分子结构，实验结果显示，GS对软骨细胞分泌GAG的功能有显著促进作用，其最佳浓度剂量为10mg/mL，对于分子结构也具有显著改善。这说明，在一定浓度剂量GS作用下，软骨细胞分泌GAG的能力有所提高，其分子组成更加优化，随着剂量的提高，其促进GAG分泌的作用下降。 正常软骨细胞的表型表达，是关节软骨基质保持稳定和保证其正常生理、生化及力学特性的基本条件。?型胶原在关节软骨中是主要的胶原成分，是软骨保持结构的紧密性和生物力学特性的基础。RT-PCR实验发现:GS具有明显促进软骨细胞合成?型胶原功能的作用，其最佳浓度剂量为10mg/mL，?型胶原mRNA相对表达量均高于P4软骨细胞，组间差异具有显著性(P<0.01)。实验证实，GS对软骨细胞合成?型胶原能力具有明显的促进作用，但是GS不能使软骨细胞?型胶原的表达超过P2，说明药物的干预只能在一定范围内上调?型胶原表达，并不能完全组织其传代过程中的去分化表现。 聚集蛋白聚糖(Aggrecan)是以核心蛋白为核心，结合糖胺多糖链构成的糖蛋白。蛋白聚糖广泛存在于胞间和胞外基质中，是一种结构复杂的生物大分子，一条核心蛋白主链上连接有上百条GAG侧链，核心蛋白又通过连接蛋白与透明质酸连接，形成一个庞大的网络[10]。研究显示，体外培养软骨细胞Aggrecan光密度比值在P4开始显著减少， 与P4软骨细胞回植体内较难形成完整的软骨组织相对应[10]。本实验证明，不同浓度剂量的GS对软骨细胞合成核心聚糖蛋白的功能有显著促进作用，浓度剂量从5mg/mL升至10mg/mL时其促进作用尤为明显，而升至15mg/mL时其促进作用反而明显下降，且高于P2软骨细胞，说明其最佳浓度剂量为10mg/mL，GS不能使蛋白聚糖的表达量超过P2软骨细胞，说明其不能完全逆转软骨细胞老化。 综上所述，GS可以抑制软骨细胞老化相关β-半乳糖苷酶的表达、促进软骨细胞增殖、减少软骨细胞G1期细胞含量、促进软骨细胞表型等，可以抑制软骨细胞复制性老化，其抗软骨细胞老化作用的强弱尚需作进一步对照实验研究，其抗老化的机制也需要进一步探讨。 【参考文献】 [1] Loeser RF, Shanker C. Autocrine stimulation by insulin-like growth factor1 and inslin-like growth factor2 mediates chondrocytes survival in vitro[J]. Anhritis Rheum, 2000, 43(7): 1552-1559. [2] Vincenti MP, Brinckerhoff CE. Early response genes induced in chondrocytcs stimulated with the inflammatory cytokine interleukin-1beta[J]. Arthritis Res, 2001, 3(6): 381-388. [3] 林建华,陈晓东,邓凌霄,等. 大鼠软骨细胞复制性老化的体外观察[J]. 中国修复重建外 科杂志, 2007, 21(11): 1155-1160. [4] Hu DN, Yang PY, Ku MC, et al. Iso1ation and cultivation of human articularchondrocytes[J]. Kaohsiung J Med Sci, 2002, 18 (3): 113-120. [5] Largo R, Alvarez-Soria MA, Diez-Ortego I, et al. Glucosamine inhibits IL-1beta-induced NFkappaB activation in human osteoarthritic chondrocytes[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2003, 11(4): 290-298. [6] Mattei M, Pellati A, Pasello M, et al. High doses of glucosamine-HCl have detrimental effects on bovine articular cartilage explants cultured in vitro[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2002, 10(10): 816-825. [7] Dodge GR, Jimenez SA. Glucosamine sulfate modulates the levels of Aggrecan and matrix metalloproteinase-3 synthesized by cultured human osteoarthritis articular chondrocytes[J]. Osteoarthritis Cartilage,2003, 11(6): 424-432. [8] Dimri GP, Lee XH, Basile G, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(3): 9363-9367. [9] Cargiulo BJ, Cragg P, Richardson JB, et al. Phenotypjc modulation of human articular chondrocytes bistratenea[J]. Eur Cell Mater, 2002, 3: 9-18. [10] Loeser RF, Shanker C. Autocrine stimulation by insulin-like growth factor1 and inslin-like growth factor2 mediates chondrocytes survival in vitro[J]. Anhritis Rheum, 2000, 43(7): 1552-1559.