鸭精液的冷冻保存试验

鸭精液的冷冻保存试验 鸭精液的冷冻保存试验 2004年第1期'浙江畜牧兽医1 .''''', l薹鸭精液的冷冻保存试验..研究. 同T刚?口,,J个.盯 tllll6- 韩管峰,刘福柱,杨长锁. (1.西北农林科技大学动物科技学院,杨凌712100;2.国家家禽技术研究中心) 摘要;以笼养金定鸭为试验材料,对鸭精液冷冻保存稀释液,防冻荆进行筛选,并研究了最佳 平衡时间和解冻温度,同时对公鸭精子在抗冻性方面的差异进行了初步探讨.结果发现:以1O%二 甲基亚砜作防冻剂,精子冻后活力最高,达0.7以上,经小群输精,孵化测定,受精率达65.平衡 时间lOmin,解冻温度4O?时,鸭精子冻后活力最好.公鸭在精子抗冻性方面存在极显着差异(P< 0.01).因此,应在抗冻性方面对公鸭加强选择. 关键词:精液;稀释液;防冻剂;平衡时间;解冻温度;抗冻性;鸭 中图分类号:$834.3文献标识码:A文章编号:1005—7307(2004)01—0001--03 畜禽精液通过冷冻可长期保存,这使精 液的使用,选种,杂交改良,地区和国际间的 精液交换更为方便,打破了精液使用的时空 限制,使优秀基因迅速传播;另一方面精液冷 冻保存对畜禽品种资源保护具有重要意义, 可明显降低保种费用. 国内外对家禽精液冷冻保存研究主要集 中于鸡,鸭的研究较少.本实验通过对稀释 液,防冻剂筛选和最佳平衡时间,解冻温度的 确定,为鸭精液冷冻保存最优提供依据, 同时试验还研究了公鸭在精液抗冻性方面的 差异性. I材料和方法 I.1实验材料供试鸭为300日龄父母代金 定种公鸭40羽,选出20羽精液品质优良,体质 健壮的公鸭供采精用.母鸭为300日龄健康无 病,产蛋率高的金定父母代种鸭,供输精用. 1.2饲养管理公母鸭以笼养方式饲养,饲 料中代谢能11.1OMJ/kg,粗蛋白18,钙 3.5,有效磷0.4. 1.3精液采集采用背部按摩法采集公鸭精 液,采集过程中要求精液无粪便,血液等污染. 1.4精液检查,冷冻和输精测定精子密 收祷日期t2OO3—1O一18 度,活力,在保温箱38~4o'c下镜检,活力达 o.75级,密度中等以上用于冷冻. 取o.1ml稀释液和0.1ml精液于1.5ml 离心管中,作同温稀释,稀释后放入2,5? 冰箱中平衡2h,在2"--'5?环境中用lOOul移 液器移取0.Iml冷冻液于装有精液稀释液 的离心管中,平衡lO,'--,15min后冷冻. 将用于冻精输精的母鸭随机分组,输精 深度为5"--'8cm,输精量为0.3ml,连输2d,隔 日后开始收集种蛋,连收5d,做好标记入孵, 入孵7d后照蛋,计算受精率. 1.s稀释液筛选试验根据精液生理特性 6种稀释液配方,将各配方成分用 天平称量后,加双蒸水,过滤,经消毒后放入 冰箱备用.采集好的同源混合精液在生物显 微镜下检查冻前活力,然后与稀释液,防冻液 按1.1.1混合,冷冻,解冻后检查冻后精子 活力,以冻后精子活力与冻前活力比值作为 筛选稀释液标准. 1.6防冻液筛选试验以甘油,二甲基亚砜 (DMS0),二甲基甲酰胺(DMF),二甲基乙 酰胺(DMA)作防冻剂,分别配制成最终浓度 分别为4,6,8,1O的16种防冻液, 以筛选出最优稀释液作为本试验精液稀释 液.检查同源混合精液冻前活力,然后与稀释 2浙江畜牧兽医2004年第1期 液,防冻液1:1:1混合,冷冻,解冻后检查 精子活力,以冻后活力与冻前活力比值作为 防冻液筛选指标.以筛选出最优防冻液作为 冷冻保护液,解冻后进行小群输精试验,观察 各防冻液在受精率上的差异. I.7平衡时间和解冻温度的确度以1.5, 1.6试验为基础,确定最佳平衡时间和解冻 温度.检查同源精液冻前活力,加防冻液后放 入2,5?冰箱中平衡0min,10min,30min, 60min,90min,120min,冷冻,解冻后观察精 子活力,以冻前冻后活力比值作为确定平衡 时间的指标.解冻温度从2o?到9o?,每 10?为一个梯度,确定最佳解冻温度. I.8公鸭精子抗冻性比较以20羽种公鸭 个体精液为样品,检查每个精液样品的冻前 活力及解冻后活力.进行小群母鸭输精,观察 公鸭个体冻精在受精率上的差异. 2结果与分析 2.I稀释液筛选详见表1. 表1精液冷冻稀释液筛选试验 由表1可见,6种稀释液中,6号液冻后 精子活力最好,平均达0.70,其次为1号液, 2号液最差,经方差分析F值为154.48,差 异极显着(P<0.01),用SSR法进行多重分 析,6号液与其他稀释液之间差异极显着(P <0.01),其冻后冻前活力比值达89.74.1 号液与4号液差异不显着.经分析,1号液和 4号液配方中分别含N一三(羟甲基)甲基一 2一氨基乙烷磺酸(TES)和三(羟甲基)胺基 甲烷,稀释液成本较高.6号液对精子稀释和 保护效果最好,且配方成本低廉,主要为谷氨 酸钠,葡萄糖,柠檬酸钾等. 2.2防冻液筛选结果详见表2. 表2精液冷冻保护剂筛选试验 抗冻剂最度冻前活力冻后活力活值 甘油40.760.I90.25 60.760.370.49 80.770.450.58 100.750.680.87 二甲基亚砜40.780.220.28 (DMSO)6O .760.240.32 二甲基乙酰 胺(DMA) 二甲基甲酰 胺(DMF) 0.76 O.77 0.75 O.75 0.77 O.78 O.75 O.77 O.77 O.76 0.52 0.70 O.16 0.22 0.52 D.67 0.18 O.23 O.36 0.64 O.68 0.90 0.22 0.30 0.67 0.86 0.24 0.30 0.47 0.84 由表2可见,对4种抗冻剂共16种浓度 的冷冻试验,结果以8,10浓度甘油和 1O%浓度二甲基亚砜,1O二甲基乙酰胺和 10二甲基甲酰胺精子冻后活力较高.10 浓度的4种防冻液与4防冻液差异极显着 (P<0.01),与6防冻液差异显着(P<0. 05).其中10浓度二甲基亚砜对精子的保 护效果最好,解冻精子活力可达0.7.以8 甘油和10的4种防冻剂做冷冻保护剂,解 冻后对小群母鸭输精,以10二甲基亚砜受 精率最高,与甘油组差异极显着(P<0.oi), 与二甲基乙酰胺,二甲基甲酰胺组差异显着 (P<O.05). 2.3平衡时间和解冻温度的确定检 8468加468 2004年第1期浙江畜牧兽医3 查同源精子活力,加入冷冻保护液后,分别在 2,5?平衡0rain,10rain,30rain,60rain, 90rain,120rain后冷冻,解冻后观察冻后精子 活力.经6O批次试验,结果平衡10rain的精 子冻后活力最好,平均达0.69,与30rain组 差异不显着(P>O.05),与其他平衡时间组 差异显着(P<0.05).解冻温度从2O?到 90"C,每1O?为一个梯度,进行解冻试验,确 定最佳解冻温度,结果在4O?,50"C解冻温 度时,精子活力最好,冻后活力分别为0.72, 0.70,与其他组差异显着(PdO.05),90"C解 冻温度组精子冻后活力最低,只有0.20. 2.4公鸭精子耐冻性差异测定以2O羽种 公鸭个体精液为样品,每羽公鸭样品进行编 号,分别检查精子活力,然后进行冷冻保存, 解冻后检查冻后精子活力,并进行小群母鸭 输精试验.结果发现公鸭个体间在精子耐冻 性方面存在极显着差异(P<0.01),解冻后 公鸭精子活力最高0.73,受精率达65.冻 后活力最低的仅为0.25. 3讨论 3.1稀释液是影响精液冷冻的重要因素,试 验结果以6号液冻后活力最高,且其配方不 需要价格昂贵的试剂,成本低廉.1,4和6号 液冻后活力较好,这三种稀释液中都有柠檬 酸钾成分,说明柠檬酸钾对鸭精子有良好的 保护功效. 3.2对冷冻保护液的筛选试验表明1O DMSO对鸭精子的冷冻保护最好,而且受精 率最高,其次为1O甘油冷冻保护剂,但受 精率较低,可能与甘油的抗受精作用有关 (Clark1960).平衡时间和解冻温度以lOmin 和4O?时精子冻后活力最高. 3.3公鸭在精子耐冻性方面存在差异,国外 (Sexton,1978)用经过耐冻性选择的公鸭与 一 般公鸭进行对比试验,结果耐冻性强的公 鸭精液受精率(35.9)显着高于耐冻性弱的 公鸭组(18.5).试验结果表明,进行鸭精液 冷冻保存时,不仅应选择体质健壮,精液质量 好的公鸭,还要对选择的公鸭用精液冷冻试 验进行进一步挑选,以选出精液常规指标优 良而且耐冻性好的公鸭,以保证精液的冷冻 保存效果. CryopreservationofDuckSemen HanXuefeng,LiuFuzhu,YangChangsuo. ((~)CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestSci—TechUniversityof AgricultureandForestry,Yangling,712100~(~NationalPoultryEngineeringTech— nologyResearchCenter) Abstract:Experimentswereconductedto determinesuitablesemendiluents,cryopro— tectants,equilibrationtimeandthawing temperature,inaddition,differencein freezabilityofmaleducksemenwasstud— ied.Theresultsshowed:Using10 dimethylsulphoxide(DMSO)ascryoprotec— tant,spermmotilityafterthawingwas above0.7;thefertilizationoffemaleducks was65.A10minuteequilibrationand 4O?thawingtemperaturegavehighest averagefertility.Differenceinfreezability ofmaleducksemenwassignificant(P< 0.01). Keyword:duck;semen;diluent;cryopro. tectant;equilibrationtime;thawingtern— peraturefreezability