1, 25 (OH) 2 维生素D3 矿化液对人牙髓干细胞成骨方向诱导作用的

1, 25 (OH) 2 维生素D3 矿化液对人牙髓干细胞成骨方向诱导作用的 ,,夏旦膣医堂垫～～生筮～呈鲞筮,塑壁?,竖鱼坚望迥堕坠磐堕,～旺叁迦垫～～。～照～～，堕些兰 ,，,,(,,),维生素,,矿化液对人牙髓干细胞 成骨方向诱导作用的研究 乔佳张振庭徐骏痰 【摘要】 目的 研究维生素,，矿化液对人牙髓干细胞的成骨方向诱导是否有促进作用。方法 从恒牙牙 髓中分离培养成纤维样细胞并测试其间充质干细胞的特异性标记物,,,,,阳性率，用一定浓度的,，,,(,,):维生 素,，、抗坏血酸、,一甘油磷酸钠的矿化液诱导牙髓干细胞，通过倒置相差显微镜、碱性磷酸酶染色、,佣,?姐染色及 骨钙素、，型胶原基因达观察和检测矿化液诱导后细胞形态变化及矿化基质分泌情况，以未诱导组为对照。 结果 维生素,，矿化液连续诱导,,,后，诱导组的细胞碱性磷酸酶染色阳性、，型胶原和骨钙素的基因表达阳 性，并可见明显钙结节形成。结论 维生素,，矿化液可以诱导人牙髓干细胞向成骨样细胞分化并促进其产生矿 化基质。 【关键词】牙髓干细胞;细胞培养;维生素,， 【中图号】 ,,,,(, 【文献标识码】 ,【文章编号】 ,,,,,,,,,(,,,,),,毋,,,,,, ,厅缸,,,，笛(,,), ,,,,，血,, ,,,,啪蚰,,,,;,，，, ,,,?,吲删娟舳,, ,劬， ,,哪础, 口,,如， ,黝，，,纨,—，打皤，,,几,掘啪聊眦矿胁,,幽肋,，,印缸以胍,,池,踟妇巧妙,;,,,,,,旷融黼咖，呦,，既咖嘈 ,,,, ,优垃如(,矗,，, 【,,,,,;,】 ,,,??,, ,, ,,,,,,,,,,, ,，,,胡,, ,, ,，,,(,,),、，,,,，,,,, ,, ,,,,,,蚰,,,,;,,,删?, ,,珏蕊,,,,,,,, ,, ,朗,,, ,,,, ,,,, ;,,,(,,,,,)(,,岫,, ,,,舭,,,,,, ,,,, ,,,, ;,,,, ,啪,窘,,,,,,矗帅、,,,,，蛐 ;,,,,,鲫, ;,,,,,陀,而,，, ,，,,(,,),、，,,,,,, ,,蛳疝,，，,脂,,?,,,,,,,;,,蚰,,, ,，,,，,, ,,,,，,,,, ;,,,,骶弛,,,,,锄, ,, ,,,,肥, ,,,,,,,, ,,?,,,,,?,,,,,,,,(,,,)衄, ,?,?髓,,,,,,,,耽, ,,,,,,,, ,，, ,，,,,髓;,,,,(,,, ,,, ,,蛆, ;,,,,,, , ,,,, ,,?,,啪,,, ,, ,,,,,,胁,,, 蛐,, ,, ,,,, ,,砌,，,,,，岫州,,,阳,, ,, ,,,瓤， ,吼,懈, ,,,,,,,, ,,“,,,，，,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,鹊,,,,,访;跏,, ,,,，，,, ,,,锄,, ;,,咖, ,,,,,,，曲, ,，,, ,,, ,, ,,帅, ;,,孵, , ,, “,,,,, ,,廿朗,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,(,帆;,,,,,伽 ,，,,(,,),“,,，，,,, ,，啪,,岫,,,,岫出,蚵,, ,，,,,;, ,,,,, ?,?(,,珏,,,,,,,,,帆 【,,,咖,,,】 ,,,,,, ,,,,砒,, ;,，,,;,,,咖,, ,, ,,,,年,,,,,,,,,等…成功分离了人类牙髓干 与方法细胞，并提出牙髓细胞具有与骨髓基质干细胞相类似的干细胞特点，称之为牙髓干细胞(,,,,,, ,,,, ,(材料,,,, ;,,,,，,,,,,),，,〕。在体内生理状况下，牙髓 ,,,,年,至,,月于首都医科大学口腔医学院干细胞处于特殊的微环境中，能保持干细胞未分化 口腔颌面外科就诊的,,例智齿阻生患者(共,,颗状态【,)。在体外， 培养条件则成为决定细胞分化方 阻生齿)。在患者知情同意下，收集拔除的智齿，置向的调控器，在一定程度上能诱导细胞定向分化。 于,?预冷的磷酸盐缓冲液(,,,)中备用。,,,,,,,,等,,研究表明，用,，,,(,,),维生素,, ,(主要试剂可以促进人骨髓间充质干细胞(,,,,)成骨向分 ，型胶原酶，中性蛋白酶，,，,,(,,):维生素化。,,,,等口,将,，,,(,,),维生素,,作用于人 ,，(,,,眦，美国)，仅一,,,培养基(北京协和医科大脂肪组织来源的基质干细胞，可诱导其成骨向分化。 学基础研究所，,,,胎牛血清(美国,,;,,,,公本研究探讨维生素,矿化液对,,,,,的成骨向分 司)，, ,,彬,谷氨酰胺(北京协和医科大学基础研化的诱导促进作用。 究所)，青霉素,,, ,,,,(美国,,;,,,,公司)，链 霉素,,, ,,,,(美国,,;,,鹏公司)，小鼠抗,,,,—, (,,,，美国)。 作者单位:,,,,,,北京首都医科大学口腔医学院 通讯作者:张振庭，,(,,,,:忽,,,,,,,,删四，电话,,,? ,(细胞培养,,?,,,,, 万方数据 将拔除的牙齿置于,?无苗,,,中(拔牙后, , 并柱测,型胶原和骨钙素的表达。内进行牙髓细胞的常规消化法提取(将提取的牙髓 , ，型胶原和骨钙索的橙测细胞置于廿,,,培养基，,,,腑牛血清，, ,,出, 采用,,—,;,方法，细胞,,,提取后，采用符氢酰胺，青霉素,,, ,,,,，链,蓐索,,, ,昏,,，,, ,,,玎,,步法反转录聚合酶链反应。各个引物序列?恒温培养箱中培养(用倒置相差显微镜观察细胞 由北京奥科公司设计(见表,)。,;,反应条件为生长情况，当细胞选到,,徭融台状态后按照,:, ,,?进行,, ,,反转录反应，,,?,删口,;,初比例传代培养，常规培养,,,, ,，直至,现细胞集 始变性(,,?,, ,(,,?,, ,退火，,,?, ,,,延藩(挑选细胞觳?,,的细胞集落(转移分离，扩太培 伸，重复,,个循环，虽后,,?,,皿,最终延伸。养。 ,;,产物定性:琼脂糖凝腔电泳厦,,,,凝胶 ,细胞舶生物学特性观察 成像最统紫外光下观察电泳条带,,照相。 用倒置相差显微镜观察细胞的生长状态(绘制 寝,戚骨细胞相关基因,删，的,;,引物序列生长曲线。按照公式计箅群体倍增时间(,):,,【,簖，,,(,,?,,):,:接种至测定的问隔时间;,,:接 ,目,目,?(,？? ，十(,种时的细胞数;,,:测定时的细胞数。计算细胞匏落 ,,,目,,…自,,,，,?;代;从;;，饿，,;，;形成率:细胞集落形戚牢;细胞豢落数,细胞总数 ,,,,，,;;;，;,，，，,?,,,?柙?，;;×,,,,( ,瑚,, ,,…?,，。,，;，;;“,，，? ,,,，,;;，,;;，，,;;，(肛,，;; ,免疫荧光检测 ,,, ,,？自,，“;;;伽，,，蹦四 蒋培养在六孔板巾的第,代细胞终止培养后彝 旦堕塑些堕坚坚坐业型坚～坐培养液，,,多聚甲醛固定,, ,，,，, ,,细胞裂解液 结 果,,,,作用,,叫,，,,,,,常血清封闭,, ,,，拜正常血清，加，小鼠抗,,『,一,一抗，,,?孵胄,小时， ,牙髓十细胞诱导前加，异硫氰酸荧光索(,四,,, ,,,,,,州,,,,,， 牙髓干细胞的生长情况:细胞约,,,贴壁，,,,,,)标记的山羊抗鼠二抗，室温避光半小时后在 左右克隆形成，细胞形态太体呈棱形，长多角形，体暗室中用荧光显墩镜观察，,,代在,,,—,,,岫激 积小(胞体丰满，胞质均匀，细胞核圆居中，核仁清晰发(在,,,,,,,呻发射荧光，呈黄绿色。 可见。观察传代后细胞形态，与传代前无明显差别 ,牙髓干细胞体外诱导分化 (图,、,)。细胞生长增殖呈,形(符台逻辑斯特生 取第,代牙舒干细胞，分威二组进行培养,,，用 长曲线(，锯咖删一;)(嘲,)。擞据公式，计算得出组使用常规培养基(,,,,,，,,,胎牛血清(, 群体倍增时间为, , ,。肉眼井结台显微镜下记录,,出,谷氨酰胺(, ,,,, ,,，(青葛素拉链霉素); 细胞的克隆效即细胞集落形成率约为,,,,,,,。诱导组为含有,,…?, ,(,,(,,):维生翥,，， 牙髓千细胞表面标志的表达:免疫荧光检测结 果显不，牙髓干细胞,,,,表达阳性，表达在细胞浆, , ,,彬,抗坏血酸，,,一?,,,甘油磷酸钠的常规培养基…，每,,换液。在诱导培养开始后第 内(绿色荧光)(圈,)。,、,,、,,,对诱导组及对照组的贴壁细胞陆续分别 ,牙髓干细胞诱导后进行常规,,染色、碱性磷酸酶染色(,,,吐,, 诱导后细胞形态:对照组细胞形态无明显改变，,,?,,,,,靶,,,,“,，，,,)、冯库萨(,帆,,哪)染色， 诱导组细胞培养第,, ,时可见部分细胞呈立方形， 豢 ?，,,,?日,(,,?)目, 一?嚣 ,,, ,镜,,?日,,,(,蚰)目,日,,,?‰目目,,,‰,,《(,，,十,),,(,啪 鱼 万方数据 韭立幽堡芏,幽上噩堕噩蔓,,堡岫,?鱼塑型蠼—血韭型,型坐(,正核嘲(圜,)。 髓,纳胞儿有比倒赫基质干细胞更强的增殖能力。 碱性磷酸酶染色:体外薛导,周后(诱导组细胞 鞋其它成体干细胞,面言，牙髓干细胞不仪易于获取、碱性磷酸酶染色旱淡绿色，而积达,,,;对照组细 无免牲排斥而且取材对机体无损伤(可取自人类废胞仅有少量着色(图,、,)。 用的智齿，或止畸拔除的牙齿。 ,,,,…钙结节染色:体外薛导,周后，诱导组 乳,?,在来成熟的,,,;中的表达水平较高，而肇乜可见钙结节形成，袭现为大面积棕褐色的用块( 在其蚝期培养立,程中表达水平明显降低。郎,,,,(,对照组,,见少量点状矿化着色(网,)。 ,,能为,,,;分化的早期标志物”】。,,,等”，利用 ,,,,;,检测结粜:体外诱导到第,，,时(骨组 ,，,—,能识别骨髓和牙髓组织血管周细胞抗原的特织的典型标志骨钙求和，型腔原的,,,，在诱导 性分离出,,,;和,,,;。,帅,等…,认为(,,,,(,组表达(对照组无表达(州,(表,)。 ,』作为各种问兜座干细胞群落早期的标志物。本研 究从成人牙髓组织中获得的克隆化生长、轴心，阳 ,号,, ,,哿,,,,, 性表谜的细胞(在此基础上对此细胞体外诱导分化。 ,，,,(,,),维生索,，是维生幕,，甾体类澈 索的活性形式(埘种内分泌激素，可以调节成骨细 目, ,, ,，“,目镕, 胞的,,,、钙结台蛋由、,;等与骨形成密切相关的 囊, ,纽,型脞辣和什钙索的表达 摹质蛋白的活性”…。王景杰等”“的研究表明(,( ,,(,,),维生素,，有促进，牙乳头细胞矿化的作 ,,警甲”:～挚 用(表现在不仅能促进，,,、,;的活性，而且可稿澈 具有分化表型的牙乳头细胞巾钙结合噩白的合成(堕型业垫,,二—,—,—二, 增加摹质对;,“的摄取。,,,,印,等”?研究表明( 讨 论 用,,,,出,,(,,(,,):维生索,，可以促进人骨 干细胞町分为胚胎干细胞和成体干细胞(日前 髓同咒质干细胞(,,,;)向成骨细胞分化。刁,帅学追认为干细胞具备两个基本性质:?自我更新能 等”,用,,—,,,,，，”(,,),维生索,，作用于人力，能通过分裂维持,身群体的稳定;?分化能力( 脂肪组织来源的基质千细胞，可诱导其向成骨细胞柱一定条件下能分化产生具有特定功能 的细胞。由 分化(证实丁维生隶,可以取代地塞米松(组成成于伦理学及排斥反应等问题(使,,胚雕干细胞的牯 丹诱导培养基，同时能够避免地窘米橙对细胞和机床应坩受到了限制(而成体千细胞由于其来源广泛( 体的副作用。本实验在上述研究的基础,探讨维生上免疫排斥反鹰等优点更加受到南视。,,?年 索,矿化液对,,,;,的戚骨向诱导是否有促进作;咖,,啪等”,发现成人牙髓中,右可以形成克隆的 用。细胞，井命名为牙髓干细胞(使其成为继骨髓同党度 本宴验所用矿化液主要成分是含一定维度的干细胞、神经千细胞、表皮十细胞等多种成体干细胞 ,(,,(,,),维生隶,，、抗坏血醣、,,甘油礴醴钠的之后发现的又一种具有多向分化能力的干细胞。同 混合液，在诱导分化实验中(诱导后细胞的碱性磷酸时，(,,山,,“?等将消化所得的牙髓细胞体外培养 酶染色显示诱导组，肿话性较对照组明显增强。的生物学特性与骨髓摹质干细胞进行比较，发现牙 ，,,是成熟成骨细胞的标志性酶之一，其主要作用 目„,,自自身《?(,, ,,?,?，,,,?,,,,?,?女,(,,,)?,,,?，,,,,?,醴?,(×,,】 ?? 女,自,,,,瞄?,,,,?万方数据,,壅旦膣匿堂垫～～生箜～～鲞筮,翅曼业,婴地坚遒垡塾删啮:叁晒～垫～～:?, ,,:塑垒至为水解有机磷酸盐，使局部磷酸根浓度升高，结合 ,,,，劬,,,,,?,,吕鲫,(,,,,,,, ,仃哪,, ;,,,, ,,, ,,,?,,,,,, ,,, ,，,,,, (,,,):,,,,(,,,,(钙，同时破坏钙化抑制剂，从而启动钙化【, ,,，有学者 , ,(,,纽(,薯曲,?,,，,,,日,。,(,脚,耐,。,,,, ,,瑚, ,?,,,,，认为,,,的活性是体外牙髓细胞分化的一个标志【, ,，。,,,,,,,,染色阳性即钙化结节形成。本研 ,,,,,,咖,,,，岬,,, 砷瑚?,, ,,,,( ;,，,,唧嗍,,,,明, ,,,,(,飘, ,也,,,曲,, ,哪,,,，,,。,,,,，,(,,):,,,,? ,, ,,?究表明，牙髓干细胞在维生素,矿化液诱导下分化 , ,,, ,，‰,,?, ,,,,,,?，，，,, ，,,;,, ,, ,,,,,,一嘣鲫;,,,,,出锄 ,,,, ,, ,,蚴,眦地,,,，,觚, ,,,,,, ,，，，,(, ,饵僻,,,，,, ,?，为具有成骨能力的细胞。在诱导后细胞检测到,, ,,,,。,,(,):,,,(,,,(和,,,的存在，,;和;,, ，是成骨细胞的标志，说 ,，啪,雠,,,,盱,，,,,)唧哪】【,，,, 删,, , ,柚, ,,?,,,, ,,叫,,,,,,; ,,““,山,,,, ,,,,,,,,鲫,,,, ,,, ;,,,,,, ,,,,仉, ,,哪,明诱导后的牙髓干细胞具备有似成骨细胞的功能。 ,，,, ,,,,, ,,,，,,,,，,(,):,,(,,( 综上所述，维生素,，矿化液对人牙髓干细胞的 , ,,,, ,，咖,日,,?,,，,?,?,【，,,口,，, ,, ,,,,—,鸵,?,,, 嘏, ,,,,,, ,,,,, ,胁,,?, ,捌髓是捌嫡出幽丽,,,吨,,,,,,,, ,,,趿成骨方向诱导有促进作用，并可以诱导人牙髓干细 .