辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化功能的促进作用

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化功能的促进作用 辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化功 能的促进作用 中国骨质疏松杂志2006年8月第l2卷第4期ChinJOsteoporos,August2006,Vol12,No.4 辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化 功能的促进作用 蔡俊张柳余向前 397 ? 药物研究? 摘要:目的观察辛伐他汀对体外培养的人骨髓基质干细胞 (humanBoneMarrowStromalceHs,hMSCs) 成骨分化功能的影响,探讨其刺激成骨的作用机制.方法体外培养来自于股骨颈骨折患者的骨髓 基质干细胞,传代后实验组加入l×l0I7moVL的辛伐他汀,于不同时间点采用Westernblot检测核转 录因子l(CoreBindingFactorl,c.bfa1)的表达,碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,ALP) 试剂盒检测ALP 的比活性,及放射免疫法检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)含量.结果辛伐他汀作用后,实验组与对照 组比较,实验组Cbfal蛋白表达水平增高,ALP比活性增高且骨钙素含量增加.结论l×10一mol/L 辛伐他汀能够促进人骨髓基质细胞成骨分化,此种促进作用可能与辛伐他汀增强其分化过程中相关 蛋白的表达有关. 关键词:人骨髓基质干细胞;辛伐他汀;成骨分化;Cbfal;ALP;OCN Simvastatinpromotesosteoblasticdi_~erentiationofhumanbonenlarrowstromalcellsCAI Jun,ZHANG Li,u.YUXiangqian.DepartmentofOrthopaedicSurgery,theAffdiatedHospitalofNorthChinac0Medical College.TangshanO63000.China Abstract:0bjectiveToinvestigatetheeffectofSimvastatinonfunctionofosteoblasticcelldifferentiationof humanbonemal'rowstromalcells(hMSCs)invitro,andtostudythemechanismsofanaboliceffectofSimvastatin onboBeformation.MethodshMSCsfrompatientsunderwentartificialfemoralheadreplacementafterfemoralneck fracturewasculturedinvitro.Afterbeingaddedwithl×10, mol/LSimvastatin.thechangesofCbfalexpression wereexaminedbyWesternblot,thechangesofalkalinephosphatase(ALP)activitywereexaminedbyALP measurementkit,andthechangesofosteocalcinwereexaminedbyradioimmunologicassay.ResultsAfterthe supplementationofSimvastatin,theexpressionofCbfalinhMSCsincreased,andthelevelofALPandosteocalcin (OCN)alsoincreasedcomparedwiththecontrolgroupwhichdidnotreceiveSimvastatin.Conclusions SimvastatincanstimulateosteoblasticdifferentiationaccompaniedwithincreasedALPactivityandOCNproduction whilehighexpressionofCbfalwereseeninvitro.Theseresultsmaybepartsofthemechanismsofanaboliceffect ofSimvastatinonboBeformation. Keywords:Bonemal'rowstromalcells;Simvastatin;Osteoblasticdifierentiation;Cbfal;ALP;OCN 人骨髓基质干细胞是一种具有多分化潜能的种 子细胞,可以分化为成骨细胞,脂肪细胞,神经细胞 等….研究发现,用于治疗高脂血症的他汀类药物 还可以刺激骨的形成,有成骨作用.1999年,Mundy 等首次发现3一羟基一3一甲基戊二酰辅酶A,即他汀 类药物能够促进骨组织的形成.但是,Maritz等 却发现他汀类药物,包括辛伐他汀(Simvastatin, 基金项目:河北省自然科学基金资助项目(C2006000580) 作者单位:063000唐山,华北煤炭医学院附属医院骨科 通讯作者:张柳,Email:zhliul30@sohu.com SIM)并无成骨作用.研究还发现不同浓度的辛伐他 汀对骨形成的作用亦有差异. 不同于成纤维细胞,成骨细胞有两个特异性的 转录本(Transcript),一个编码Cbfal,它是成骨细胞 分化的中心因子;另一个编码OCN.此外,AIJP是成 骨细胞分化的早期标志物.先前的实验多采用动物 的骨髓基质干细胞,这与人之间存在较大的种属差 异.因此,本实验通过hMSCs体外向成骨细胞诱导 培养,观察SIM对Cbfal蛋白的作用,探讨SIM对 hMSCs成骨分化的影响及其促进骨形成,治疗骨质 疏松的可能机制. 398 1材料和方法 中国骨质疏松杂志2006年8月第l2卷第4期 ChinJOsteoporos,August2006,Vol12,No.4 1.1材料 在征得患者同意的前提下,于华北煤炭医学院 附属医院取6例成人股骨颈骨折患者行股骨头置换 时收集的骨髓和松质骨,患者术前无代谢性骨病和 他汀类药物服用史,其中男,女各3例,平均年龄 49.8岁.辛伐他汀(美国Merck公司),DMEM高糖 培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(天津血研所), I3.甘油磷酸钠,维生素c(美国Sigma公司),预染蛋 白mark(美国NewEngland公司),Cbfal兔抗人抗体, 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔Ig抗体及ECL试剂 盒(美国SantaCruz公司),碱性磷酸酶试剂盒,考马 斯亮兰蛋白试剂盒(南京建成公司),骨钙素放免试 剂盒(北方生物技术研究所). 1.2方法 1.2.1hMSCs的体外培养:于股骨颈骨折患者行股 骨头置换术扩髓时抽取骨髓,收集松质骨.用 DMEM反复冲洗松质骨,把收集到的细胞与骨髓经 离心去除脂肪层后,加入适量完全培养液(含青,链 霉素各100u/m1,10%的胎牛血清,10mmol/L的I3一甘 油磷酸钠,50mg/L的维生素c,普通高糖DMEM), 采用全骨髓培养法以1×10./cm种植于培养瓶中, 置37cC,5%CO,的湿化气孵箱中行原代培养,每例 患者所得细胞单独分开培养,48h后半量换液,以后 每3d全量换液.原代培养12,14d细胞汇合成单 层后按1:3的比例传代,细胞计数后接种于培养瓶 或培养皿中,分两组:实验组[Sim(+)]采用含1× 10.mol/LSIM的条件培养液(SIM溶于75%乙醇, 乙醇的终浓度为0.05%),对照组采用不含辛伐他 汀的完全培养液(含有与实验组所加入SIM等量的 乙醇).持续培养,常规换液,观察细胞的生长情况, 拍照记录. 1.2.2Westernblot检测Cbfal的表达:于传代后 SIM作用的第3,6,9天收集细胞,用细胞核蛋白提 取A,B液(10mmol/L及20mmol/L的HEPES, PH7.9,1.5mmol/L和1mmol/L的MgC12,15mmol/L 的KC1,0.5mol/L的NaC1,0.5mmol/L和1mmol/L的 PMSF临用前加入,0.5mmol/L和1mmol/L的DTY临 用前加入,25%甘油,0.1mmol/L和0.2mmol/L的 EDTA,1/~g/ml的pepstatin,2/~g/ml的leupeptin,2g/ m1的aprotinin)在冰上条件下提取核蛋白,用考马斯 亮兰蛋白定量试剂盒定量总蛋白含量.分别取相同 蛋白量的样品,以排除细胞量的差别,准备好SDS. PAGE电泳分离的蛋白凝胶,转膜(在低温条件下进 行),封闭液封闭,1:100体积比稀释的1抗第一次 杂交,封闭液洗膜,1:5000稀释的辣根过氧化物酶 标记的2抗第2次杂交,洗膜后用ECL试剂盒检测, 显影,定影.所得图片在密度分析仪(Bio.Red)中分 析后,得出其光密度值. 1.2.3ALP比活性的测定:传代细胞以5×104/cfn2 接种于6孑L板中,在传代后SIM作用的第3,6,9天 分别收集培养上清液和细胞,在细胞中加入细胞裂 解缓冲液(riffs.HclPH7.5,含0.1%TritonX一100)100 l,超声细胞粉碎仪破碎细胞,离心,取上清.用 ALP检测试剂盒检测培养液上清和裂解细胞的上清 液,并用考马斯亮兰蛋白定量试剂盒分别定量总蛋 白.计算出胞外,胞内ALP比活性及其胞外/胞内 ALP比活性比值. 1.2.4OCN含量的检测:传代细胞SIM作用后的第 6,10,14天取上清液,采用OCN放免试剂盒检测,7 计数器测定沉淀物每分钟计数值(countsperminute, cpm),根据品曲线得到样品OCN含量,单位为 ng/ml. 1.3统计学处理 采用SPSS10.0统计软件对数据进行t检验,对 结果用?s表示,P<0.05表明差异有统计学 意义. 2结果 2.1倒置显微镜下细胞形态的观测 人骨髓基质干细胞刚接种时,有较多的血细胞 悬浮.8,10h后开始贴壁,2天后少数贴壁细胞呈 梭形,以后细胞呈克隆样生长.并且随着换液次数 的增多,悬浮的血细胞逐渐被清除(图1A),培养12 , 14d长满瓶底.传代后的细胞3,4h贴壁,并向 三角形,多边形转化,有数个突起(图1B). 2.2辛伐他汀对Cbfal蛋白表达的影响 Westernblot分析显示hMSCs传代细胞在辛伐 他汀作用后的第3天,无论是实验组还是对照组均 未检测到Cbfal的存在.在第6,9天检测到实验组 Cbfal蛋白的表达,其光密度值分别为85.159? 3.105,102.830?6.400,对照组贝0为64.579?1.184, 79.832?4.341.实验组Cbfal蛋白的表达量均明显 强于对照组(P<0.05). 2.3辛伐他汀对ALP的比活性的影响 不同组别的胞外,胞内ALP比活性及胞外,胞内 ALP比值见表1,2,3.实验组传代细胞在SIM作用 巾堕盟堕琉超蔓12彗旦?塑Lt-0??Vu?,l}l :原代蛔胞多,幢形.jI咀缩胞悬浮r倒置丰同茎显暾链x41(1j;B:传代舞fi推导多 角形.可IE蹙起ii倒冒州莘傲髋xI(x' 图lhMs问成甘细胞瞒导仆忆情况 后的第3天ALP比活性与对照?之问无差异性(P >0.05),往帮6天干?第9天实验组无论胞外,胞内 ALP的比活性是:背的比值均较对照蛆增高(P <0.05或P<O0?备组内随培养时间的延长. AIP比活-功:有增高,苹异无统学意义 表I不同日?l弛外^_ll比恬rj:的化iiUgI) :'对旦c{蚍较P(nII1 表2细胞l,^LP比活陛的变化(L?-【' 埘组扰螋'(_}ll 表3时川匏讣,"fill咆^lI比 沣:'j埘转'r(f_?I,t<0n5 2.4辛他他汀对I)I:的影响 实验组在SIMn用呐第6天cP<0.t】5.第 10【4天IiP<00I1【】(:的含量部叫{1曼高对照 组.儿随时n_l】们延I乇仃逐渐增强呐趋蒋(P<c】'05) (表4) 表4i-clI圯醴的变ftcnt4/nl 挂:与对照组比较'P(0惦..P(0IH::+,组不同时蚓点比较 P(005 399 3讨论 本实骢研究表明:?利用廿殳侣'预骨折患菏行殴 骨头置换术扩髓时抽取骨髓.片社得松质骨,这样 所得的骨髓摹质1二细胞较多.便于同一个人同,批 圳胞进行多项指标的{盘f914,尤其是对细眶早期表达 因蛋白的检测.有利于获得更加稳定的数据撤 据成骨细胞贴姥生长的特性.采FH骨髓培养方法 涛译hMSCs向成骨细胞丹化,简单而迅速.所获的 细胞较多.生长良好;-l×10mul/I辛伐池汀能l: 嗣LI)faI蛋白旧表达;?I×10l『1?,J儿辛伐他汀能 增强^LP的比活性I×10'-.ol/L辛代他汀能增 加0c的含量 目前.骨髓苯质f细_拖成骨诱培斧方法主要 有骨髓培养法和梯度离心浊与梯度离心法比 较.令骨髓培养法撵f1易f枷范.r缩短细接种时 问,污染机会小,重复性好并?在拒得咕壁细胞的 II-f_『是传代时问上-q梯瘦离心法尢:芷锌,通台 用于建立成骨细胞的研究平台. Mae等研究SIM药物埘MI:3.【3一I作用 时发现I×10'『1ll?l时SIM能叫促进ALP和 OCN的基冈表达,其他删:究亦l×l0Ill~l/I的 SIM对不同动物成'胃细胞系的矿化技AI1',【)(:的 表达更有刺激作州『口足.SIM对hMSCs成骨 舒化过程中Chfa【篷lI旧表达,段lECbfaI蛋白丧达 世与AIP,OCN达量之Ih]'Z-柯{口关fl-尚未 报道以往研究发现CI,fal是hMS(:成骨分化 过程中必可少f}{】.在hMSCs成骨舒化早期起促进 作用,但在晚期则起抑制作用,l町CIj{二于其 他成?目特异性篷因表达,井对成骨特性基因如 ALP,OCN等具有瞒节作用.(:IffaI突变小鼠胚胎 期表达ALP.但不表达骨桥蛋白和骨钙蛋白,出生 中国骨质疏松杂志2006年8月第l2卷第4期 ChinJOsteoporos,August2006,Vol12,No.4 后很快死于呼吸衰竭,外观上呈现侏儒症和短肢等 改变,且cbfa1的缺失也与锁颅骨发育不全或骨肉 瘤有关.本研究表明,SIM作用后的第3天未见 cbfa1表达,这可以解释辛伐他汀作用后第3天实验 组与对照组的ALP比活性无差异性.在辛伐他汀 作用后的第6天和第9天,两组均可以检测到cbfa1 蛋白的表达,经过密度分析显示实验组Cbfal表达 量均明显高于对照组,与ALP和OCN的检测结果相 一 致,这不仅说明我们培养的hMSCs经诱导分化后 已经具有成骨细胞的生物学特性,而且表明1× 10.mol/LSIM主要是通过上调Cbfal蛋白的表达而 增加ALP比活性和OCN的含量,从而发挥促进 hMSCs成骨分化的作用. ALP作为成骨细胞的一种特异表型,其活性越 高说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显. ALP活性与收获的细胞有关,而ALP活性与蛋白浓 度的比值,即比活性,更能准确反映成骨分化.同 时,ALP是一种分泌型蛋白,主要作用是在细胞外基 质中通过水解磷酸酯,提供骨盐,有利于成骨.OCN 是成骨细胞分化成熟的标志,被认为在维持正常骨 钙化率和抑制软骨钙化中起重要作用.我们的研究 结果显示:实验组在SIM作用后,其细胞内外ALP 的比活性,OCN的含量都要强于对照组,这一方面 表明hMSCs在体外可以诱导分化为成骨样细胞,另 一 方面表明SIM的加入使ALP的比活性,OCN的含 量都明显增强,并且能够增强ALP,OCN向细胞外的 分泌,使其发挥作用,从而促进hMSCs的成骨分化. 一 甘油磷酸钠,维生素c不仅可以为合成骨基质提 供胶原和有机磷,还可以促进骨髓基质干细胞的成 骨分化,但是本实验中实验组与对照组所用培养液 中都含有口一甘油磷酸钠,维生素c,因此可以排除两 者的影响. 在I临床的回顾性研究中也发现,服用SIM可以 增加血清中OCN的水平,而且可以有效降低股骨颈 骨折的发病率?.我们在体外培养的hMSCs成骨 分化过程中发现,SIM通过上调cbfa1蛋白的表达增 加ALP比活性和OCN含量从而刺激成骨分化.对 于Cbfal作用途径和信号如何传导,及其体内辛伐 他汀最佳作用浓度及选择最佳体内成骨能力的合适 时机等问题,仍有待于进一步的研究. 【参考文献】 [1]PittengerMF,MackayAM,BeckSC,eta1.Multilineagepotentialof adulthumanmesenchymalstemcells.Science,1999,284:143-147. 12JMundyG,GarretR,HarrisR,eta1.Stimulationofboneformation invitroandinrodentsbystatins.Science,1999,286:1946-1949. [3]MaritzFJ,ConradieMM.Effectofstatinsonbonemineraldensity andbonehistomorphometryinrodents.ArteriosclerThrombVase Biol,2001,21:1636-1641. 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