胰岛素样生长因子-1在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义

胰岛素样生长因子-1在中耳胆脂瘤上皮中的达及意义 胰岛素样生长因子-1在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意 义 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 中文摘要 目的: 研究胰岛素样生长因子-1(IGF-I)在中耳胆脂瘤上皮中的组织学表达,探讨 IGF-I 与 胆脂瘤上皮细胞过度增殖的关系及其对骨质破坏的影响。 方法: 收集暨南大学附属第一医院 2005年 1 月~2009 年 6 月经病理确诊的中耳胆脂瘤组织 标本 30例做为实验组,收集同期手术中的 10例耳后正常皮肤组织做为对照组,实验组依 骨质破坏程度分为轻度组和重度组,采用免疫组化二步法检测中耳胆脂瘤上皮及正常皮肤 表皮中 IGF-I 及 Ki-67的表达,以 Ki-67增殖指数作为胆脂瘤上皮细胞增殖状态的标记,运 用统计学方法 IGF-I 和 Ki-67 在中耳胆脂瘤上皮及正常皮肤表皮中的表达及二者在胆 脂瘤上皮中表达的相关性,探讨 IGF-I 与中耳胆脂瘤上皮细胞过度增殖的关系;通过比较 不同骨质破坏程度组胆脂瘤上皮中的 IGF-I 和 Ki-67的表达,探讨 IGF-I 在胆脂瘤骨质破坏 过程中所起的作用。 结果: 30例中耳胆脂瘤标本中,IGF-I 阳性表达位于胆脂瘤上皮全层,Ki-67阳性细胞分布于 胆脂瘤上皮基底层及基底上层且阳性细胞表达率增高;10 例正常皮肤标本中,IGF-I 与 Ki-67 阳性表达主要位于基底细胞层。胆脂瘤组上皮中的 IGF-I 平均光密度MOD及 Ki-67 增殖指数PI显著高于正常皮肤对照组。中耳胆脂瘤上皮中,IGF-I MOD与相应的 Ki-67 PI 呈正的直线相关(r0.51,P0.004)。重度骨质破坏组胆脂瘤上皮中 IGF-I MOD及 Ki-67 PI 均高于轻度组,差别有统计学意义。 结论: 1.中耳胆脂瘤上皮中 IGF-I 的表达较正常皮肤表皮显著增强。 2.IGF-I 与中耳胆脂瘤上皮细胞过度增殖密切相关,可能通过多种途径促进细胞的增 殖。 3.IGF-I 与中耳胆脂瘤的骨质破坏作用关系密切,可能通过多种途径促进骨 质吸收。 关键词:中耳胆脂瘤,胰岛素样生长因子-1(IGF-I),细胞增殖,骨质破坏 I 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 Abstract Aim: To investigate the role of insulin-like growth factor - I IGF-I in the mechanism of proliferation and bone destruction in cholesteatoma Method:30 cases of cholesteatoma specimens were collected during middle ear surgery in the First Affiliated Hospital of Jinan University from January 2005 to June 2009, all specimens were confirmed by pathology and were divided into mild and severe group according to the degree of bone destruction. 10 cases of normal skin specimens were taken from the postauricular area served as controls. An immunohistochemical analysis was carried out to examine the expression of IGF-I and Ki-67 in cholesteatoma epithelium and normal postauricular skin, the correlation between the expressions of the two indexes and the bone destruction were observedResults: In the 30 cases of cholesteatoma specimens, IGF-I were observed to be expressed in all layers of the cholesteatoma epithelium and Ki-67 were observed to be expressed in the basal and suprabasal layers of the epithelium with an increasing frequency of positive cells, while in normal skin specimens, the expressions of these two indexes was observed mostly in the basal layer. The mean optical density MOD of IGF-I and the proliferative index PI of Ki-67 in cholesteatoma was significantly higher than that in normal postauricular skin. There is a correlation between the expression of the IGF-I and Ki-67 in the epithelium of cholesteatoma (r0.51, P0.004)The MOD of IGF-I and the proliferative index PI of Ki-67 in group with severe bone destruction was significantly higher than that in mild ones Conclusions: Based on our results, we assume that IGF-I might play an important role during invasion of the adjacent bony structures of cholesteatoma, as well as associate withincreased cell proliferation activityKey words: middle ear cholesteatoma,insulin-like growth factor-I(IGF-I),cell proliferation, bone destruction II 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 目 录 中文摘要I Abstract. II 目 录III 前 言 - 1 - 1. 中耳胆脂瘤发病机制研究现状: - 1 - 2. 胰岛素样生长因子-1 IGF-I与细胞增殖及骨代谢- 3 - 3. IGF-I 与中耳胆脂瘤- 4 - 材料与方法- 6 - 结 果. - 10 - 1. IGF-I 及 Ki-67在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的表达- 10 - 2. IGF-I 与 Ki-67在不同骨质破坏程度组胆脂瘤上皮中的表达- 13 - 讨论 - 14 - 1.IGF-I 在中耳胆脂瘤上皮中的表达. - 14 - 2.IGF-I 在中耳胆脂瘤上皮细胞异常增殖中的作用. - 16 - 3.IGF-I 在中耳胆脂瘤骨质破坏过程中的作用 - 22 - 4.IGF-I 在中耳胆脂瘤病理机制中进一步的研究方向 - 24 - 结 论. - 26 - 参考文献. - 27 - 英文缩略词 - 35 - 附图及说明 - 37 - 在校期间发表论文 - 41 - 致 谢. - 42 - III 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 前 言 中耳胆脂瘤是耳鼻喉科常见病,轻者引起患者听力损伤,重者引起严重的颅内、外并 发症。迄今为止,中耳胆脂瘤的发病机制仍不清楚,早期诊治存在困难,病人就诊时往往 有不同程度的并发症。手术治疗仍然是治疗中耳胆脂瘤的唯一手段,但手术效果并不完全 尽如人意,存在一定的复发率及后遗症。因此,深入研究胆脂瘤的病理机制对于该疾病的 预防、早期诊断及有效治疗具有十分重要的意义。胰岛素样生长因子-1 insulin-like growth factor-I,IGF-I是一多功能细胞调控因子,在细胞增殖、分化、迁移、凋亡及骨代谢等过 程中均发挥重要作用,本研究将 IGF-I 引入到中耳胆脂瘤的病理机制研究中来,就 IGF-I 在中耳胆脂瘤上皮中的表达情况及其可能在中耳胆脂瘤上皮细胞过度增殖及骨质破坏过 程中所起的作用进行探讨,可望为中耳胆脂瘤病理机制的研究及该疾病的相关预防、诊断 及治疗提供新的思路与方法。 1. 中耳胆脂瘤发病机制研究现状: 中耳胆脂瘤的确切发病机制至今仍未阐明, 自 1838年 Miller 提出中耳胆脂瘤的概念 [1] 以来,国内外学者主要提出四种假说 :鳞状上皮化生学说、上皮移行学说、基底细胞增 生学说和袋状内陷学说。上述学说均只能部分解释在后天性胆脂瘤所见到的某些临床现 象,没有一种学说能得到直接、完整的组织学和试验证据。随着分子生物学技术的发展, 对中耳胆脂瘤病理机制的探索深入到一个新的水平,相关研究主要围绕细胞增殖、骨质破 坏等方面展开。 1.1 中耳胆脂瘤上皮细胞增殖相关研究: 各种增殖标记物如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞 核相关抗原(nuclear-associated antigen,Ki-67)等的相关研究证明胆脂瘤上皮细胞具有高 [2] 度的增殖活性 。研究发现,多种生长因子、信号转导通路参与胆脂瘤上皮细胞的异常增 殖过程: 生长因子是指具有调控细胞生长、发育的一类生物活性物质,它们通过自分泌或旁分 泌的方式调节各种细胞的增殖和分化。在中耳胆脂瘤组织中,多种生长因子及其受体存在 [3] 异常表达,已有研究发现表皮生长因子受体epidermal growth factor receptor,EGFR 、角 [4] 质形成细胞生长因子(Keratinocyte growth factor,KGF) 、血管内皮生长因子 vascular - 1 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 [5] endothelial growth factor, VEGF 及转化生长因子-transforming growth factor- ?, TGF- ? [6] 等均参与调节胆脂瘤上皮细胞的过度增殖过程。? 磷脂酰肌醇 3 激酶-蛋白激酶 B phosphatidylinositol 3-kinase-Akt/protein kinase B, [7] PI3K-Akt/PKB 通路是调节细胞的增殖和存活的重要信号传导通路 ,胆脂瘤组织中该通 路的多个位点存在异常激活或抑制:昀新研究表明,胆脂瘤上皮中 PI3K-Akt(PKB)信号 通路的负性调节因子 10 号染色体缺失张力蛋白磷酸酶phosphatase and tensin homologue deleted on chromosometen,PTEN表达显著降低,而活化的 Akt 则显著升高,二者共同参 [8] 与调节胆脂瘤上皮细胞的增生过程 。核因子- ?BNuclear factor kappa B,NF- ?B 是多种信 号转导途径的汇聚点,它可以结合细胞周期蛋白 D1cyclin D1的启动子激活其转录,有利 [9] [10] 于细胞由 G1 期进入 S 期, 促进细胞增殖 ,马玉坤等 发现 NF- ?B 在中耳胆脂瘤组织 中存在异常表达,推测其在胆脂瘤的发生和持续发展过程中起重要作用。丝裂原活化蛋白 激酶mitogen activated protein kinase,MAPK信号途径在细胞增殖过程中发挥重要调节作 [11] 用 ,细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases ,ERK)-1/2、p38等是 MAPK的亚型,研究发现胆脂瘤上皮中磷酸化的 ERK-1/2及 p38表达较耳后正常皮肤显著 [12] 增强,它们共同促进胆脂瘤上皮细胞的增殖、分化 。磷脂酶 C- γ1 phospholipase C, PLC- γ1 是磷脂酶 C-磷酸磷脂酰肌醇信号转导途径中的一个关键酶,研究发现 PLC- γ1 在胆脂瘤上 皮中的表达明显增强,其可能是一有丝分裂信号,在导致胆脂瘤上皮细胞高度增殖的信号 [13] 通路中发挥重要作用 。 1.2 中耳胆脂瘤骨质破坏相关研究进展: 胆脂瘤引起骨质破坏的确切机理同样尚未完全明了, 近年来的研究表明其与破骨细 胞性骨吸收;机械压迫作用;各种酶、细胞因子等参与的骨质吸收与降解等因素有关,这 些因素彼此联系,相互作用。 破骨细胞是唯一能够实现骨质吸收的细胞,在胆脂瘤引起的骨质破坏过程中起关键作 [14] 用,有学者提出破骨细胞可能是引起胆脂瘤骨质破坏的昀终作用细胞 ,骨组 织微环境中 破骨细胞分化因子receptor activator of NF- ?B ligand , RANKL和骨保护素 [15] [16] (osteoprotegerin,OPG)的含量对破骨细胞的生成和活化起重要调节作用 。Jeong 等 研究发现:胆脂瘤组织中 RANKL 阳性细胞的数量和比例显著高于正常耳后皮肤;正常耳 后皮肤 OPG 阳性细胞的数量和比例显著高于胆脂瘤组织;胆脂瘤组织中 RANKL/OPG 阳 性表达率的比值显著高于正常耳后皮肤, 推测 RANKL/OPG 比值可能成为胆脂瘤骨质破 - 2 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 坏程度的可靠预测指标。 [17] [18] 中耳内持续正压可导致破骨细胞的大小、面积、密度显著增加 。Hu 等 发现压力作 用下 RANKL/OPG 表达增加,植入假体后产生的压力能够抑制成骨作用,促进破骨细胞生 成。胆脂瘤上皮细胞的过度增殖和凋亡引发角化上皮脱落加速,使胆脂瘤体积不断增大, 对其周围骨质产生逐渐增加的机械压迫作用,组织局部受压后连续释放各种 破骨细胞活化 因子(osteoclast activating factor,OAF)激活受压部位的破骨细胞侵蚀骨质,导致骨质破 坏作用持续存在。 基质金属蛋白酶matrix metalloprteinasea,MMPs家族成员中的明胶酶 MMP-2 和 MMP-9 不仅可以水解细胞间的基质成分,还能有效地分解基底膜的主要成分???型胶 [19] 原蛋白,两者的过度表达在骨代谢异常及炎症性骨溶解疾病的发病中起关键作用 。研究 发现,MMP-2 及 MMP-9 在胆脂瘤组织中的表达显著高于正常外耳道皮肤,二者在胆脂 [20, 21] 瘤侵袭与骨质破坏过程中可能起关键的调节作用 。 总之,中耳胆脂瘤的发生发展是一个极其复杂的病理生理过程,上述各种因素在这一 过程中并非相互独立,而是彼此间存在协同作用。目前,对中耳胆脂瘤病理机制的研究已 深入到分子生物学水平,但它的确切机理至今还未完全阐明,各个研究往往孤立的局限于 某种因子或某一个病理过程,各种因子间的相互作用及哪种因子在胆脂瘤病 理过程中发挥 关键枢纽作用则缺乏研究讨论,没有将各个研究结果总结、联系,得出一个系统的完整的 结论。未来研究的重点是进一步从宏观和微观的角度探讨与中耳胆脂瘤病理过程有关的各 种因素及它们之间相互关系,形成一网络化的理论体系,为中耳胆脂瘤的预防、诊断和治 疗提供重要理论依据。 2. 胰岛素样生长因子-1 IGF-I与细胞增殖及骨代谢胰岛素样生长因子由 Salman和 Daughaday 于 1956年发现,由于其具有胰岛素样生物 功能,结构上又与胰岛素具有同源性而得名。进入 20 世纪 90年代后 IGFs 成为研究热点, 新的家族成员及相关生理功能不断被发现和认识,逐渐形成一家族体系:1)胰岛素样生长 因子insulin-like growth factors,IGFs ; 2)胰岛素样生长因子受体 insulin-like growth factor receptors,IGFRs ; 3)胰岛素样生长因子结合蛋白 insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs。其中,IGF-I 是研究较早、较充分的一个,成熟的 IGF-I 是由 70 个氨 基酸残基组成的单链蛋白质,分子量为 7649Da,其编码基因位于 12q, IGF-I 的一级结构 由 4 个结构域构成,而胰岛素原只包含三个区域。昀初 IGF-I 被认为只是一种由肝脏合成 - 3 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 的内分泌循环因子,只有调节生长激素的作用,很快人们便发现人体多种组织中均有 IGF-I [22] 的表达,IGF-I 通过自分泌、旁分泌的形式介导了细胞的增殖、分化与生存 。 IGF-I 是一强烈的促有丝分裂原,它可直接作用于细胞刺激其 RNA、DNA 的合成和 [23, 24] 细胞增殖,促使细胞由 G G 期进入 S 期 。组织中细胞的过度增殖将大大增加肿瘤的 0/ 1 [25] 发生几率,IGFs 与肿瘤的发生、发展关系密切 。胰腺癌的研究表明 IGF-I 可通过 PI3K/PTEN/Akt/NF- ?B信号通路的交互作用及抑制 PTEN磷酸化来促进细胞的增殖和侵袭 [26] 。IGF 家族在皮肤表皮的内环境稳态中起重要作用,其信号途径紊乱涉及多种皮肤疾病 的病理生理过程,尤其是在那些表现为表皮超常增生的疾病(如银屑病、皮肤 癌)中地位 更加重要。角质细胞本身即可生成 IGF-I 并在该类细胞增殖过程中发挥重要作用,IGF-IR mRNA 及 IGF-IR 表达减少可显著抑制角质细胞生长;高糖状态下,IGF 的这一促角质细 [27] 胞增殖作用将被削弱,这也是糖尿病患者伤口不易愈合的主要原因 。 IGF-I 在骨代谢过程中同样起重要的调节作用:IGF-I 在促进成骨细胞增殖、分化的同 时与 IGFBPs一起刺激破骨细胞的分化及活化,进而调节破骨细胞性骨吸收作用;另一方面, IGFs 可增加骨胶原的合成并与 IGFBP-5 结合后储存于骨基质中,在骨吸收过程中又被释放 [28] 出来再次调节成骨细胞、破骨细胞的功能,从而偶联了骨吸收与骨形成过程 。除了对破 骨细胞的直接作用,IGF-I 可通过调节某些因子的旁分泌作用间接的调节破骨细胞性骨吸 [29] 收作用:Rubin 等 研究发现 IGF-I 可提高 RANKL 的合成,抑制 OPG 的表达,从而促进 破骨细胞的聚集和分化、激活成熟的破骨细胞、抑制破骨细胞凋亡,昀终导 致骨吸收的增 [30] 加。 Yongmei Wang等 研究发现 IGF-I 敲除小鼠表现骨小梁容积升高的同时伴有破骨细胞 数量及大小的下调,IGF-I 缺陷对骨吸收的影响比对骨形成的影响还要大。另外,兔骨细 胞的体外实验表明 IGF-I 可通过增强破骨细胞分泌的 MMP-2 和 MMP-9 的活性促进骨吸 [31] 收作用 。 3. IGF-I与中耳胆脂瘤 中耳胆脂瘤以中耳腔内鳞状上皮细胞过度增殖与凋亡而导致的角化碎屑持续堆积和 [32] 骨质破坏为主要病理特征,曾有学者将其视为一种高分化鳞癌 ,由于其具有侵袭性、破 坏性、迁移性、非正常调控下的增殖性、分化变异性、复发性等恶性肿瘤样生物行为,故 胆脂瘤的研究发展与肿瘤的研究发展息息相关,存在借鉴和延伸的关系,国内外研究多从 [33] 肿瘤的研究领域寻找有意义的因素,探讨其在中耳胆脂瘤发病机理中的作 用 。如前所述, IGF-I 是一种强烈的促有丝分裂剂,可通过多种途径促进细胞的存活、增殖与分化,它在 - 4 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 [34] 肿瘤发病机制中所起的重要作用已被广泛认同 。同时,IGF-I 在骨代谢性疾病中的研究 [28] 亦相当广泛,其在成骨及破骨过程中所起的重要作用已得到充分的论证 ;IGF-I 是否在 中耳胆脂瘤细胞增殖及骨质破坏等病理过程中起作用这一论题却鲜有文献报道。 [6] 有学者认为胆脂瘤的病理过程是一慢性的创伤愈合过程 ,IGF-I 在创伤愈合过程中的 [35] [36] [37, 38] [39] 关键作用已成为不争的事实 。机械应力 及炎症修复过程中升高的 TGF-等均可 使局部组织中 IGF-I 表达增强,另一方面,骨质吸收过程本身就会使 IGF-I 的合成与释放 [15, 28] 增多 。中耳胆脂瘤的主要病理特征即为中耳腔内长期的慢性炎症状态;由于 角质碎屑 持续堆积产生的机械压力增高;鼓室壁骨质不断被溶解吸收。这些因素均可以使局部 IGF-I 表达增多。因此,我们推测 IGF-I可能存在并异常表达于中耳胆脂瘤中,在该疾病的发生、 发展过程中起重要作用。 胆脂瘤组织中 EGFR、KGF、VEGF 等生长因子及其受体存在异常表达并与胆脂瘤细 [3-5] [40, 41] 胞的增殖活性密切相关 ,而 IGF-I 又分别对 EGFR、VEGF 等有激活或促进作用 。 PI3K-AktPKB信号通路是细胞增殖与存活的重要通路,该通路中的多个信号位点在胆脂 [8, 10] 瘤组织中均表达增强 ,IGF-I 是 PI3K 通路强有力的激活物,可在数分钟内将 PI3K 活 [42] 性升高 60倍并可持续达 6小时 。PLC- γ1 在胆脂瘤组织中表达异常增高,在细胞的异常 [13] 增生和分化过程中起重要作用 。鼠心肌细胞的研究表明,较低浓度的 IGF-I 即可将 PLC- [43] γ1 昀大程度的活化 。如果 IGF-I 确实存在并异常表达于胆脂瘤组织中,则可充分解释上 述的研究结果并且说明 IGF-I 可以通过多种途径促进胆脂瘤细胞的增殖、分化。 胆脂瘤引起骨质破坏的确切机理同样尚未明确,但破骨细胞在骨吸收过程中的溶脱矿 物质作用已被广泛认同,骨组织微环境中 RANKL 和 OPG表达量的相对多少决定破骨细胞 是被激活还是被抑制,研究表明 RANKL 和 RANKL/ OPG 比值在胆脂瘤中的表达明显高 [16] 于正常皮肤组织 ,而 IGF-I在直接诱导破骨细胞生成和活化的同时可增强 RANKL mRNA [29] 的表达,降低 OPG分泌,促进破骨细胞性骨吸收作用 。MMP-2 和 MMP-9 在胆脂瘤组 [20, 21] 织中表达阳性率明显高于正常外耳道皮肤,在骨质破坏过程中发挥重要作用 ,而 IGF-I [31] 可直接增强破骨细胞分泌的 MMP-2 和 MMP-9 的活性 。 IGF-I是否通过对 RANKL/ OPG 的调节及增强基质金属蛋白酶的活性在中耳胆脂瘤骨质破坏过程中发挥作用值得深入探 讨。 - 5 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 材料与方法 1.标本采集与处理 30例中耳胆脂瘤标本采集于暨南大学附属第一医院 2005年 1月~2009 年 6月住院患 者手术中,所有胆脂瘤标本均经病理诊断证实,其中男 21 例,女 9例;年龄 16~70 岁, [16] 平均年龄 36.37?14.56 岁。结合 Jeong 等 骨质破坏程度的分类依据,根据引起迷路炎、 颅内感染及周围性面神经瘫痪等并发症的骨质破坏基础,制定分类为:1.轻度:盾板 及听小骨的细微破坏,或听小骨部分破坏,鼓窦入口扩大;2.重度:听小骨完全破坏或天 盖、骨迷路破坏、外耳道后壁、面神经管、乙状窦任一处有骨壁破坏。根据术前 CT 及术 中所见的骨质破坏情况将 30例中耳胆脂瘤标本分为轻度组与重度组各 15例。 10例耳后皮 肤标本取自同期手术中的正常皮肤组织,其中男 6 例,女 4例;年龄 12~ 68岁,平均年 龄 38.6?19.07 岁。所有标本均经 4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,作 4μm 厚的连续切片 并载于涂有多聚赖氨酸的玻片上。 2.主要仪器 ZEISS-88手术显微镜德国卡尔蔡司公司 数显鼓风干燥机 GZX-9240MBE 微波炉 美的 MP23C-BF 显微镜 LEICADMRA2 图像采集系统 LEICA Qwin Plus 3.主要试剂及来源 1 兔多克隆 IGF-I 抗体(BA0939) 武汉博士德生物有限公司 2 鼠抗人 Ki-67 单克隆抗体(ZM-0166 98042403) 北京中杉金桥生物技术有限公司 3 通用型 PV-6000 二步法免疫组化检测试剂盒(498106A)北京中杉金桥生物技术有限 公司,试剂盒内容: A:30%过氧化氢去离子水 B:二抗工作液 4 DAB显色试剂盒(ZLI-9017 K96712H)北京中杉金桥生物技术有限公司 5 PBS 磷酸盐缓冲液(0.01M PH7.2-7.4)北京中杉金桥生物技术有限公司 6 其它试剂:二甲苯、无水乙醇、蒸馏水、苏木素、柠檬酸、柠檬酸三钠、中性树胶均由 - 6 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 暨南大学物资处提供。 4.实验方法 4.1 HE 染色 1 将制备好的切片置烤箱 58-60?过夜,使切片上组织与玻片紧密贴附,防止脱片。 2 切片脱腊:待已烘烤过夜的切片降至室温后浸入二甲苯?溶液?二甲苯?溶液各 10 分 钟。 3 梯度酒精脱蜡至水:100%酒精 5 分钟?95%酒精 5 分钟?90%酒精 5 分钟?80%酒精 5 分钟?70%酒精 5分钟?蒸馏水冲洗 1分钟。 4 苏木素染液染色 2~3分钟,水洗玻片上多余染液。 5 1%盐酸酒精70%酒精配制分色片刻,镜检控制直至细胞核及核内染色质清晰为止, 约数十秒钟,自来水冲洗。 6 蒸馏水短洗后入伊红染液染色 2分钟,自来水冲洗。 7 梯度酒精脱水:切片入 70%酒精 3分钟?80%酒精 3分钟 ?90%酒精 5分钟?95%酒精 3 分钟?100%酒精 3分钟。 8 二甲苯I、二甲苯II中透明各 1分钟。 9 擦去切片周围多余二甲苯,滴加适量中性树胶,再加盖玻片封固。 4.2免疫组化染色(PV-6000二步法) 工作原理:应用免疫学基本原理??抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理, 通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原多肽和蛋白质,并对其进 行定位、定性及定量研究。 1 将制备好的切片置烤箱 58-60?过夜,使切片上组织与玻片紧密贴附,防止脱片。 2 切片脱腊:待已烘烤过夜的切片降至室温后浸入二甲苯?溶液?二甲苯?溶液各 10 分 钟。 3 梯度酒精脱蜡至水:100%酒精 5 分钟?95%酒精 5 分钟?90%酒精 5 分钟?80%酒精 5 分钟?70%酒精 5分钟?蒸馏水冲洗 1分钟。 4 根据抗体的要求,对组织抗原进行相应修复,使抗原的位点暴露出来:将切片置于微 波炉专用塑料切片盒内,将配好的 500ml 柠檬酸缓冲液加入塑料切片盒(柠檬酸缓冲 液的量足够浸没切片) ,盖上盒盖并将切片盒盖子上的小孔打开,将塑料盒置于微波炉 中央调节功率至中高档,持续加热 15分钟(IGF-I)或 25分钟Ki-67后取出,冷却至 - 7 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 室温。 5 蒸馏水洗 1分钟×2次。 6 PBS冲洗 5 分钟×3次。 7 3%过氧化氢室温孵育 5min灭活内源性过氧化物酶,PBS溶液冲洗 3次各 2分钟。 8 滴加一抗兔多克隆 IGF-I 抗体/鼠抗人 Ki-67 单克隆抗体或 PBS 液代替一抗作空白对 照,置湿盒内 4?冰箱过夜。 9 取出湿盒,待切片温度上升至室温后, PBS 冲洗 2分钟×3次。 10 加通用型 IgG抗体,室温孵育 30分钟。 11 PBS冲洗 2 分钟×3次。 12 DAB显色,显微镜下观察,待阳性部位着色较强且背景清晰时,用蒸馏水终止反应。 (IGF-I 显色时间为 30秒,Ki-67显色时间为 10分钟) 13 苏木素复染 30秒,自来水冲洗 3分钟。 14 梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。 15 自然干燥后显微镜下观察并在固定的拍摄参数下拍照。 4.3对照 按试剂说明选择阳性对照,IGF-I 选用乳腺癌组织(附图 3)作为阳性对照, ki-67 选用扁桃体(附图 4)作为阳性对照。以 PBS代替一抗作为空白对照(附图 5,附图 6)。 5. 结果判定 一方面采用双盲法观察评估确定,如结果不一致,经两名医师商讨或请示高年资病理 科医生确定:IGF-I 着色部位为细胞膜和(或)细胞质,根据染色细胞的百分组成和染色 强度综合判定其表达结果:0分为无色, 1分为淡黄色, 2分为棕黄色,3分为棕褐色染 色深浅需与背景着色相对比;再将阳性细胞所占总上皮细胞的百分比打分,0分为阴性, 1分为阳性细胞?10%, 2分为 11%~50%, 3分 51%~75%, 4分为75%。染色强度 [44] 与阳性细胞百分比的乘积3分才算免疫反应阳性(+) 。 另一方面,利用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统,对 IGF-I 抗体处理组切片的免疫组 织化学染色结果进行定量分析,每张切片均选取不相重叠的 5个代表性部位,在 200倍视 野下,测量中耳胆脂瘤上皮及耳后皮肤表皮的 IGF-I 平均光密度值(mean optical density, [45] MOD), 取其均值为测量结果 ,代表该标本上皮中的 IGF-I 浓度。 MOD IOD SUM(积分光密度) / area SUM(区域总面积) - 8 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 Ki-67 为细胞核着色,表现为棕黄色、棕褐色、黑色颗粒,染色结果以阳性细胞标记 指数LI来判定,每份标本各取一张切片,选择细胞分布均匀,组织结构有代表性的 5 个 不重复区域,利用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统,计数(至少 200个细胞)每个视野内 的所有上皮细胞数N及阳性细胞数n,计算出单位切片的上皮细胞总数 ?N及 Ki-67 阳 [46] 性细胞总数 ?n,将 LI 值作为该标本的增殖指数(proliferative index,PI) 。 LI ?n / ?N × 100% 6. 统计学处理 应用 SPSS16.0 统计软件包进行分析。中耳胆脂瘤上皮及耳后皮肤表皮中的 IGF-I 平均 光密度及 Ki-67 增殖指数比较用两样本 t 检验,中耳胆脂瘤上皮 IGF-I 平均光密度与 Ki-67 增殖指数之间的相互关系用 Pearson 相关分析,并计算其相关系数,骨质破 坏轻度组与重 度组的胆脂瘤上皮 IGF-I 平均光密度及 Ki-67增殖指数的比较用两样本 t 检验, IGF-I 免疫 组化染色评分与其相应的平均光密度值结果的一致性用 Pearson 相关分析,检验水准 ?0.05。 - 9 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 结 果 1. IGF-I及 Ki-67 在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的表达 1.1IGF-I 在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的表达: 1.1.1IGF-I在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的染色程度比较 30 例中耳胆脂瘤标本中有 27 例存在 IGF-I 阳性表达,阳性表现为胆脂瘤上皮全层细 胞均呈胞膜和胞浆的不同程度棕黄色染色(附图 7,附图 8),阳性率为 90%。在 10例正 常皮肤标本中,IGF-I 表达主要位于表皮基底细胞层且染色较浅(附图 11),仅有 1例达 2 2 阳性评分标准,阳性率为 10%,经检验, 19.21,P 0.000。按 ? 0.05 水准,两者 差别有统计学意义,可认为胆脂瘤组上皮 IGF-I 表达较正常皮肤组表皮强烈,见表 1。 表 1. IGF-I在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的表达 IGF-I 的表达 * 组别 例数 阳性率 (%) 阳性 阴性 胆脂瘤组 30 273 90 皮肤组 10 1 9 10 2 注:* 19.21, P 0.000 1.1.2 IGF-I在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的平均光密度比较 利用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统,对 IGF-I 抗体处理组切片的免疫组织化学染色 结果进行定量分析,经两样本 t 检验,按 ?0.05 水准,胆脂瘤组上皮 IGF-I 平均光密度值 (0.24?0.075)与正常皮肤组表皮 IGF-I 平均光密度值(0.062?0.041)之间的差别有统计学 意义(t 7.26,P 0.000),可认为胆脂瘤组上皮的 IGF-I 表达强度高于正常皮肤对照组, 见表 2、图 1。 - 10 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 表 2. IGF-I在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的平均光密度(MOD) * 组别 例数 MOD昀小值 MOD昀大值 MOD平均值( xs) 胆脂瘤组 30 0.064 0.38 0.24 ? 0.075 皮肤组 10 0.022 0.13 0.062?0.041 注:* t 7.26,P 0.000 1.1.3 IGF-I染色程度评分与其平均光密度的关系 30例中耳胆脂瘤上皮及 10例正常皮肤表皮中, IGF-I的表达强度评分高时其对应的平 均光密度值较大;评分低时平均光密度值亦小,经 Pearson 相关分析,r 0.92,P 0.000。 按? 0.05水准,染色评分与平均光密度值之间存在正的直线关系,见图 2。 图 1.IGF-I在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮 图 2. IGF-I 染色程度评分与其平均 中的平均光密度 光密度的关系 1.2 Ki-67在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的表达: 在 30例胆脂瘤标本的上皮中,Ki-67阳性细胞分布于胆脂瘤上皮基底层,并延伸到基 底上层,数量较多(附图 9,附图 10),增殖指数(PI)平均值为 19.64%?8.82%。10 例 正常耳后皮肤表皮中,Ki-67 阳性细胞仅位于表皮基底层,数量较少(附图 12),增殖指 数(PI)平均值为 5.62%?2.12%。经两样本 t 检验,按? 0.05水准,两者差别有统计学意 - 11 -暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 义(t ′ 8.04,P 0.000),可认为胆脂瘤组上皮 Ki-67阳性表达高于正常皮肤组,见表 3、 图 3。 表 3.Ki-67 在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组表皮中的增殖指数(PI) * 组别 例数 PI昀小值 (%) PI 昀大值( %) PI 平均值 ( xs)% 胆脂瘤组 30 2.04 34.48 19.64?8.82 皮肤组 10 2.11 8.39 5.62?2.12 注:* t ′ 8.04, P 0.000 1.3 IGF-I 与 Ki-67在胆脂瘤组上皮中表达的相关性: 在胆脂瘤组上皮中, Ki-67 表达强度与同一标本相邻切片的 IGF-I 平均光密度值密切相 关,平均光密度值高则增殖指数大;反之,平均光密度值低则增殖指数小,由散点图(图 4) 可见,Ki-67增殖指数随 IGF-I 平均光密度值增加而增大呈线性趋势。Pearson相关系数 r 0.51,P 0.004。按 ? 0.05 水准,认为胆脂瘤组上皮中 IGF-I 的浓度与其细胞的增殖活性 呈正的直线相关;经直线回归分析,认为二者之间有直线关系(t 3.16,P 0.004), 2 直线回归方程为:Y 0.05+0.603X,决定系数(R Square ,R )0.263,图 4、IGF-I 平 均光密度值为自变量,Ki-67增殖指数为因变量。 。 图 3.Ki-67 在胆脂瘤组上皮和正常皮肤组图 4.IGF-I 与 Ki-67 在胆脂瘤组上皮中 表皮中的表达 表达散点图及直线回归 - 12 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 2. IGF-I与 Ki-67 在不同骨质破坏程度组胆脂瘤上皮中的表达 2.1 IGF-I 在不同骨质破坏程度分组的胆脂瘤上皮中的表达 15例轻度骨质破坏胆脂瘤上皮 IGF-I 表达较弱(附图 7),MOD 平均值为 0.19?0.064, 15例重度骨质破坏胆脂瘤上皮 IGF-I 表达较强(附图 8),MOD平均值为 0.29?0.048,经 两样本 t 检验,按? 0.05水准,两组总体均数的差别有统计学意义(t 4.80,P 0.000)。 可认为重度骨质破坏组胆脂瘤上皮的 IGF-I 平均光密度值较轻度组高,见表 4。 表 4.IGF-I在不同骨质破坏程度分组的胆脂瘤上皮中的表达 * 组别 例数 MOD昀小值 MOD昀大值 MOD平均值 ( xs) 重度组 15 0.21 0.38 0.29?0.048 轻度组 15 0.064 0.31 0.19?0.064 注:* t 4.80,P 0.000 2.2 Ki-67在不同骨质破坏程度分组的胆脂瘤上皮中的表达 15 例轻度骨质破坏胆脂瘤上皮中 Ki-67 阳性细胞的分布较稀疏(附图 9),Ki-67 增 殖指数(PI)平均值为 15.91%?9.40%;15例重度骨质破坏胆脂瘤上皮中 Ki-67阳性细胞的 分布较密集(附图 10),Ki-67 增殖指数(PI)平均值为 23.37%?6.58%。经两样本 t 检验, 按? 0.05水准,两组总体均数的差别有统计学意义(t 2.52 ,P 0.018)。可认为重度 骨质破坏组胆脂瘤上皮的 Ki-67增殖指数较轻度组高,见表 5。 表 5. Ki-67 在不同骨质破坏程度分组的胆脂瘤上皮中的表达 * 组别 例数 PI 昀小值 % PI 昀大值 % PI 平均值 ( xs)% 重度组 15 12.76 34.48 23.37?6.58 轻度组 15 2.04 29.83 15.91?9.40 注:* t 2.52,P 0.018 - 13 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 讨 论 中耳胆脂瘤分为先天性和后天性两大类,后天性胆脂瘤又根据其病史和病因分为后天 原发性胆脂瘤及后天继发性胆脂瘤。但无论是哪种类型的胆脂瘤均以上皮细胞的过度增殖 及持续不断的骨质破坏为主要病理特征,由此入手对胆脂瘤的病理机制进行深入研究,对 于该疾病的预防、早期诊断及充分治疗都具有十分重要的意义。本研究发现胰岛素样生长 因子-1(IGF-I)和 Ki-67 在中耳胆脂瘤上皮中的表达较正常皮肤表皮显著增强;IGF-I 的表 达与中耳胆脂瘤上皮细胞过度增殖及骨质破坏作用密切相关。以下将从三个方面对所得实 验结果进行讨论,并对后续研究方向提出展望。 1.IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达 肉眼观察,中耳胆脂瘤呈球囊状,大小及形状不等、易碎、分层、界限清楚、囊壁色 白或略黄,具有珍珠样光泽(附图 1)。组织学观察发现,中耳胆脂瘤呈一个良性的角化 鳞状细胞囊,由囊内容物、胆脂瘤上皮、胆脂瘤基质三部分组成。囊内容物由大量脱落角 化上皮及胆固醇结晶组成;胆脂瘤基质是胆脂瘤外周部分,由肉芽组织、炎症侵犯的上皮 下结缔组织组成,含有淋巴细胞、血细胞以及少量的中性粒细胞等,有时在胆脂瘤基质和 邻近的骨质之间可见到破骨细胞存在;中耳胆脂瘤上皮为复层鳞状上皮,与正常皮肤表皮 类似,由下至上分为基底层、棘层、颗粒层和角质层(附图 2),其中,基底层以上的各 层又被统称为基底上层,从基底层到角质层是角质细胞增殖、分化、移动和脱落的过程。 基底层是柱状上皮,由表现为扩大的、浓染的、嗜碱性核的小立方细胞组成,棘层细胞比 较大,形状上相对呈圆柱形,在接近表皮时变为多面体状,颗粒层逐渐呈扁平状,胞浆中 包含浓染的透明角蛋白颗粒,角质层呈明显的高度角化及脱鳞屑,这些层状角化物是构成 胆脂瘤囊内容物的主要成分。 由于组织学类型相同,中耳胆脂瘤的研究中常将耳道或耳后等处的正常皮肤做为对照 [2, 4, 47] 来与之进行比较 。本实验目的在于研究 IGF-I 在中耳胆脂瘤上皮及正常皮肤表皮中的 表达情况;比较二者间的增殖状态是否存在差异。而临床所见的中耳胆脂瘤患者常伴有中 耳慢性化脓性炎症,长期的脓液及炎症刺激势必改变外耳道皮肤的增殖状态,促进其病理 [2] 性增生,Raynov等 的实验结果也证实了这一结论。因此,我们选择表现正常皮肤状态的 耳后皮肤作为对照,一方面取材方便,另一方面不会对患者术后的伤口愈合产生任何影响。 对于免疫组织化学染色结果的判断,过去常常依赖于病理学专家的主观评阅,根据染 - 14 - 暨南大学硕士学位论文 IGF-I在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义 色深浅分为:无阳性染色-,可疑阳性(?),弱阳性(+),中等阳性(++),强阳性(+++) [44] 几个等级。本研究中组织学观察采用了徐良中等 建议的评分方法,兼顾了阳性染色的强 度和比例,反映染色结果更加全面,但这样的评价仍然属于半定量描述,不可避免的受到 主观因素的影响。形态计量技术是近年发展起来的一种新的定量检测技术,运用全自动图 像分析仪对组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、长度及表面积等的图像数据进行数 学处理,以便对生物组织细胞的形态及其结构成分进行定量分析。平均光密度定量分析的 理论基础是朗伯- 比耳Lambert - Beer 吸收定律,其物理含义是一束单色 平行光透过某种 分布均匀的物质,光能被吸收,光能吸收量等于该物质的克分子量。平均光密度(MOD 是 [48] 被测个体的截面内各象素光密度的算术平均,代表染色的深浅,反应物质的相对浓度 , 因此我们选择它做为代表中耳胆脂瘤上皮及正常皮肤表皮中 IGF-I 浓度的指标。通过对组 织病理评分与 IGF-I MOD的相关性分析,我们发现二者之间存在明显的直线相关(r 0.92, P 0.000),说明二者的评价效能一致。但是,用定量数值表示染色程度,具有准确性高、 客观性强、重复性好以及减少或弥补观察者的主观性差异等优势,使统计学分析的结果更 加精确、可信,相信利用显微图像分析系统对免疫组化结果进行定量分析将是医学生物学 研究由定性发展到定量的必然趋势。 本研究运用免疫组化实验方法,发现了 IGF-I 在中耳胆脂瘤上皮中的存在,并且通过 定量及半定量分析发现其表达与正常皮肤相比