全唾液中变异链球菌受体的检测

全唾液中变异链球菌受体的检测 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 全唾液中变异链球菌受体的检测 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】 目的 通过变异链球菌黏结素蛋白和唾液蛋白的相互作用,筛选全唾液中变异链球菌黏结素蛋白的受体成分。方法 变异链球菌国际标准菌株经活化、液体培养,采用冷冻乙醇法提取在液体培养时细菌分泌至培养液中的黏结素,并对黏结素的成分进行电泳分析、含量测定和抗原性检测。选取15名高龋者和15名无龋者,分别于进食后2h采集其无刺激性全唾液,经冷冻干燥后制备电泳样品,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)将其分开,用变异链球菌黏结素蛋白和变异链球菌的抗体成分进行 Westernblotting免疫印迹检测。结果 在细菌培养液中提取到了变异链球菌面分泌的黏结素成分。免疫印迹检测结果显示,唾液中变异链球菌的受体成分至少有6种,不只局限于目前认识的富脯蛋白等3种。结论 变异链球菌表面黏结素可与全唾液中的多种蛋白结合,这有可能是变链菌黏附于牙齿表面的物质基础。 【关键词】 龋病,变异链球菌,唾液蛋白,黏附,黏结素 ABSTRACT: Objective To select the acceptor ingredients of DOC格式论文,方便您的复制修改删减 Streptococcus mutans protein in the whole saliva through the interaction between adhesion and saliva protein of Streptococcus mutans. Methods After activation and liquid culture of Streptococcus mutans strains of international standards, we took Subonding from liquid culture of bacteria secretion in the process of liquid culture by using chilled ethanol extraction. Then subonded components underwent electrophoresis analysis, content determination and antigen detection. We collected 15 with high carries and 15 with no carries. Two hours after eating, the whole nonirritating saliva was collected, electrophoresis samples were prepared after freezedrying, and then stains were separated with SDSPAGE. Western blot detection was used for adhesive protein and Streptococcus mutans antibody composition. Results The ingredients of Subonding secreted on the surface of Streptococcus mutans were obtained in the cultured saliva. There were at least six kinds of components in the extraction of Western blot detection, not limited to the three known kinds of prolinerich protein. Conclusion The adhesion of Streptococcus mutants can be bound with the proteins of saliva. It may be the material basis in Streptococcus mutants adhered to tooth surface. KEY WORDS: caries; Streptococcus mutans; salivary protein; adherence; adhesion DOC格式论文,方便您的复制修改删减 变异链球菌(以下简称变链)表面黏结素与唾液中受体的相互作用,影响着唾液中变链的数量和变链与牙面的黏附。了解这种作用的特性,可为调节唾液中变链的水平和变链与牙面的黏附提供理论基础。本实验提取了变链表面黏结素,通过黏结素与唾液蛋白的Western blotting蛋白印迹,检测高龋组和无龋组全唾液中变链黏结素的受体成分,以探讨唾液中影响变链黏附的相关因素。 1 材料与方法 1.1 变异链球菌黏结素的提取 变链的活化和培养,-80?保存的变链国际标准菌株GS5接种于BHI琼脂平皿,37?厌氧培养48h活化,将活化的菌株接种于BHI培养液的试管中,37?、180r/min摇床培养过夜,培养液3000r/min离心30min,室温,收集上清液。无水乙醇法提取黏结素,培养上清液加等体积无水乙醇,4?放置过夜,过夜后的样品-10?,3000r/min冷冻离心30min,沉淀加0.01mol/L(pH 6.8)TrisHCl缓冲液溶解。 1.2 蛋白含量的测定 用BCA法进行蛋白含量测定。 1.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) 配制质量浓度分别为0.375g/L和0.75g/L的浓缩胶和分离胶,按蛋白电泳系统说明书灌制凝胶。凝胶厚度1.5mm,胶面12cm×10cm,点样量为每孔10μg,标准蛋白1支,加0.1mL蛋白处理液100?、3min,取10μL上样,120V约0.5h,至溴酚兰到达分离胶底部,100V恒压电泳4h左右。电泳结束后,凝胶右下角做切角标 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 记,然后将凝胶放入表面皿,加入5倍体积的考马斯亮蓝染色液,35?摇床上染色3h。染色完成后,加入脱色液,35?摇床上脱色至背景清晰,进行条带分析。 1.4 抗原性鉴定 包被抗体,0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将鸭抗变链抗体稀释至1mg/L,在待定的聚苯乙烯反应孔中各加0.1mL,4?过夜,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。加样,实验组加变链表面黏结素、0.01mol/L TrisHCl(pH 7.2)500μL,震荡溶解,对照组加0.01mol/L TrisHCl(pH 7.2)500μL,加入聚苯乙烯96孔反应板各5孔,37?水浴1h。用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。加酶标二抗,加入HRP标记的鼠抗鸭二抗,用封闭液按1?1000稀释,100μL/孔,37?孵育1h,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。加底物液显色,各孔加入临时配制的TMB底物液100μL,37?孵育0.5h。终止反应,各孔加入加入2mol/L硫酸0.05mL。反应结束,观察颜色变化。 1.5 唾液的采集 所有受试者进食后2h,用Lashley杯采集无刺激腮腺液1,2mL,用隔离法收集无刺激颌下腺和舌下腺液4,8mL,两者采集同时置于冰块上的容器内混合。高龋组和无龋组各取15份。高龋组,龋失补牙数DMFT?6,选取本院口腔内科门诊患者15例,男7例,女8例,年龄18,23岁。无龋组,龋失补牙数DMFT=0 , 选取本院口腔内科门诊非龋患者及本校学生15例,男7例,女8例,年龄18,23岁。两组均无牙周疾病、口腔黏膜病和全身系统性疾病。获 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 取唾液后立即在4?,1000r/min离心10min,取上清液,在冷冻干燥机上-50?冷冻干燥,-80?保存。 1.6 Westernblot检测唾液中的变链受体 取冰冻保存的唾液白色粉状样品,加2×SDS缓冲液稀释,在分光光度仪上调整唾液蛋白浓度为1g/L。将处理好的样品加入等量2×Loading buffer,煮沸10min,4?、12000r/min离心5min,取上清进行1g/L SDSPAGE。标准蛋白1支,加0.1mL蛋白处理液100?、3min,取10μL上样,处理同样品。浓缩胶120V约1.5h,分离胶100V恒压电泳4h左右。电泳结束,切取所需凝胶条带后进行Western blotting。用转膜缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜(NC膜)30min,铺NC膜,并用移液管赶走气泡,铺凝胶,并用移液管赶走气泡,应用BioRad电转仪,于60mA稳流湿转90min,小心取出NC膜,用丽春红染色观察电转效果,印度墨汁标出Marker位置,双蒸馏水漂洗,换水数次,将染色洗干净,封闭同时包被实验一中提取的变异链球菌表面黏结素蛋白,将硝酸纤维素膜放入杂交袋中,加入适量用封闭液(含0.5g/L脱脂奶的PBST,其中含0.005g/L Tween 20)稀释的1?1000变异链球菌表面黏结素蛋白,除尽气泡,封口,4?,12h,取出硝酸纤维素膜,用PBST漂洗3次,每次10min,将硝酸纤维素膜放入杂交袋中,加入适量用封闭液(0.5g/L脱脂奶的PBST,其中含0.005g/L Tween 20)稀释的1?1000鸭抗变异链球菌抗体,除尽气泡,封口,4?过夜,取出硝酸纤维素膜,用PBST漂洗3次,每次10min,将硝酸纤维素膜放入杂交袋中,加入用封闭液稀释的辣 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 根过氧化物酶标记的鼠抗鸭二抗(1?1000),除气泡后封口,置于室温1h,取出硝酸纤维素膜,用PBST漂洗3次,每次10min,用ECL的方法显色,曝光时间1,5min。 2 结 果 2.1 蛋白含量 根据吸光度值,计算出无水乙醇冷冻法提取的蛋白含量为2.78g/L。 2.2 SDSPAGE分析电泳 细菌培养液中可提取的蛋白是一组分子质量在36,185ku的混合粗蛋白(图1)。根据一致的唾液蛋白的特性和分子量推测,这些蛋白应该包括表面蛋白(185ku)等变链的黏结素成分。 2.3 抗原性检测结果 提取的黏结素蛋白与变链抗体产生阳性反应。 2.4 Westernblot结果 高龋组和无龋组唾液蛋白的受体成分几乎没有差别,在全唾液中变链表面黏结素的受体成分有多种。 3 讨 论 变链的黏结素成分位于细菌菌体表面,是以蛋白质为主的一组成分,是变链与唾液蛋白黏附的物质基础。一方面变链表面的黏结素成分可以特异性地与牙面获得性膜中部分唾液蛋白吸附[1],促进细菌黏附,并大量繁殖,形成牙菌斑这一特殊的微生态环境后产酸致龋,另一方面变链的黏结素能与有些浮游于唾液中的蛋白成分结合,使细菌 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 聚集成团,便于清除。因此,研究变链的黏结素成分与唾液蛋白成分相互作用的关系,可以为龋病预防提供一些理论基础。 在细菌增殖活跃阶段,变链的部分黏结素能分泌到培养上清液中。从培养液中提取的方法有多种,乙醇冷冻法应用最多,被认为是最可靠、对所提取蛋白的抗原性改变最小的方法[5]。本研究的酶联免疫吸附试验结果显示,从上清液中提取的黏结素与变链的抗体有结合,具有一定的抗原性。SDSPAGE分析电泳显示,提取的蛋白成分包括了多种蛋白成分,根据分子量推测含有已知的参与黏附的蛋白,如表面蛋白等[2]。 唾液中存在变链表面黏结素的受体成分,通过与变链的相互作用调节唾液中变链的数量,同时也影响菌斑中细菌的组成。已经阐明的变链受体有300ku的黏蛋白、淀粉酶和富脯蛋白,但仍有一些受体蛋白还不是很清楚[34]。本实验结果根据一致的唾液蛋白的特性和分子量推测,变链表面黏结素蛋白受体成分可以肯定的有酸性富脯蛋白、糖性富脯蛋白、α淀粉酶,有可能是变链表面结素受体成分的有乳铁蛋白、碱性富脯蛋白、MG2等。 【参考文献】 [1]SVENSATER G, BERGENHOLTZ G. 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