【doc】维库溴铵和阿曲库铵对骨骼肌细胞膜上成人型和胚胎型乙酰胆碱受体的作用

【doc】维库溴铵和阿曲库铵对骨骼肌细胞膜上成人型和胚胎型乙酰胆碱受体的作用 维库溴铵和阿曲库铵对骨骼肌细胞膜上成 人型和胚胎型乙酰胆碱受体的作用 194中华麻醉学杂志2004年3月第24卷第3期ChinJAnesthesiol,March2004,Vol24,No.3 维库溴铵和阿曲库铵对骨骼肌细胞膜上 成人型和胚胎型乙酰胆碱受体的作用 赵雪莲庄心良杨保仲李士通徐国辉 【摘要】目的比较维库溴铵和阿曲库铵对骨骼肌细胞膜上成人型乙酰胆碱受体(,.nACHR)和 胚胎型乙酰胆碱受体(T-nAChR)的作用.方法先在HEK293细胞膜上应用脂质体转染技术达e— nACHR和T-nAChR,再采用全细胞膜片钳技术比较维库溴铵和阿曲库铵与这两种受体作用引起峰电 流的变化.结果维库溴铵和阿曲库铵均能竞争性抑制e.nACHR和T-nAChR.抑制e.nACHR两药的 Ic依次为8.34-2.6和(24,24-10.5)t~mol/L;抑制T-nAChR的Ic?依次为55.04-28.4和(183.24-39.2) t~mol/L.结论维库溴铵对e.nACHR和T-nAChR抑制作用强于阿曲库铵;T-nAChR对维库溴铵和阿曲 库铵的敏感性均低于e.nACHR. 【关键词】阿曲库铵;维库溴铵;肌,骨骼;细胞膜;受体,胆碱能 Actionsofvecuroniumandatracuriumonadultandembryonic—typenicotinicacetylcholinereceptorat skeletalmusclecellmembraneZHAOXue-lian,ZHUANGXin-liang,YANGBao-zhong,et a1.Departmentof Anesthesia,ShanghaiFirstPeople'sHospital,Stmnglmi200080,China 【Abstract】 ObjectiveToinvestigateandcomparetheac6onsofvecuroniumandatracuriumonadldtand embryonic—typenicotinicacetylcholinereceptors(e— andT-nAChR)atskeletalmusclecellmembrane.Methods TheadldtandembryonicnAChRsWereheterologouslyexpressedinHEK293ceUs.Peakcurrentsinducedby actionsofvecuroniumandatracurlumatc-andT-nAChRwererecordedinHEK293ceils,usingwholecellpatch clamptechnique.ResultsVecuroniumandatracuriumcompetitivelyinhibitede— andT-nAChRinHEK293ceils, Theinhibitorconcentrationsforhalf-maximalresponse(IC50)forvecuroniu/nandatracurlumate.nAChRweI? (8.34-2.6)gmol/Land(24.24-10.5)gmol/Lrespectively;TheIC加 vflJuesforvecuroniumandatracuriumatE' nAChRwere(55.04-28.4)vmol/Land(183.24-39.2)ttmol/Lrespectively.ConclusionAccordingtoIC50 valuesforbothadultandembryonictypenAChR,vecuroniumismorepotentthanatracuriumonc-and7一nAChR. EmbryonicnAChRislesssensitivetovecuroniumandatracuriamthanad~t-typonAChR. 【Keywords】 Alracurium;Vecuroniumbromide;Muscle,skeletal;Ceilmembrane;Receptors,cholinergic 骨骼肌细胞膜上乙酰胆碱受体有成人型(,. nAChR)和胚胎型(7一nAChR)两种亚型.正常成年人 神经肌肉接头后膜终板的受体主要是,一nAChR;而 胎儿和新生儿及在某些病理情况下,其骨骼肌细胞 膜的终板区和终板区外的肌膜上散在分布着7一 nAChR.由于,一nAChR和7一nAChR在亚基构形上的 差异,使这两种受体具有不同的电生理特性和药理 特性.这可能是临床上引起机体肌松药敏感性不 同,甚至这可能是引起肌松药不良反应的原因.本 研究拟应用脂质体转染技术在HEK293细胞膜上分 别表达,nAChR和7一nAChR,以观察两种不同化学 作者单位."200080上海交通大学附属第一人民医院麻醉科 ? 实验研究? 结构的非去极化肌松药维库溴铵和阿曲库铵对e. nAChR和7-nAChR所引起的峰电流的影响. 材料和方法 细胞培养采用无nAChR表达的HEK293细 胞(中科院细胞所提供)作为重组nAChR的靶细胞. 在37?,含5%CO,的培养箱中用DMEM培养基 (含10%小牛血清,100ml青霉素和100mg/1链霉 素及2mmol/L谷氨酰胺)中培养HEK293细胞J. 实验时,用0.25%胰酶消化传代于35nlln一次性培 养皿(密度为1×105),培养24h. 亚克隆目的基因将含小鼠源性q,B,7,8和, 基因的原核细胞表达质粒Psp65a,Psp65p,Psp65, Psp647和Pbssk(+),(索克生物研究所提供)通过 中华麻醉学杂志2OO4年3月第24卷第3期 ChinJAnesthesiol,March2OO4,Vol24,No.3 亚克隆技术连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1 上.并在亚克隆后用基因测序法鉴定连接是否正 确. HEK293细胞脂质体转染及功能鉴定用PBS 冲洗HEK293细胞,除去血清.将含有a,8,6,了或, 基因的pcDNA3.1质粒,以2:1:1:1的比例与 DMRIE.CReagent(Invitrogen,)脂质体混合于1ml无 血清培养基,孵育45min后,铺于HEK293细胞上. 培养24h后加入含血清的培养基1ml,再培养24h 后即可应用.同时,也用不含目的基因的pcDNA 3.1质粒转染HEK293细胞作为阴性对照,步骤同 上.应用全细胞电压钳观察乙酰胆碱对脂质体转染 的乙酰胆碱受体的作用.不含目的基因质粒转染的 HEK293细胞,乙酰胆碱作用不能激发电流;而含目 的基因的质粒转染的HEK293细胞,乙酰胆碱可激 发电流. 电流记录转录后细胞的电流前,先以细 胞外液(NaC1140retool/L;KC15.4retool/L;CaC121.8 retool/L;MgC121.0retool/L;HEPES10retool/L;葡萄糖 11.1retool/L;阿托品1t~mol/L;以NaOH调pH至7.4) 替换细胞培养基.用Pc.10微电极拉制仪(Narishige 公司,日本)分两步将直径1.6—2.0mill玻璃微电极 毛胚拉制成微电极,再用MF.830微电极抛光仪抛 光.电极内液为(CsC1150retool/L;HEPES10retool/L; EGTA5retool/L;Mg.ATP2mmol/L;以CsOH调pH至 7.3).电极电阻为3—5MI).应用全细胞电压.膜片 钳,记录电流.电刺激脉冲的给出及电信号的采人 均通过计算机程序pClamp7.0及digidatal1200转换 器接口来完成.采样频率1000Hz,低通Bessel滤波 0.5kHz.电极阻抗3—5MQ,封接阻抗大于1?时, 吸破细胞膜成全细胞状态.细胞持续以细胞外液灌 注(1—2ml/min). 给药模式实验膜牵制电压均设为一80mV. 因HEK293为非兴奋性细胞,从一100一一40mV的 钳制电压不影响非去极化肌松药的效应. (1)分别以不同浓度(10nmol/L1mmol/L)乙酰 胆碱(Aeh)刺激转染后的HEK293细胞. (2)预先用不同浓度维库溴铵和阿曲库铵平衡 HEK293细胞30s,再给予100t~mol/LAch激动受体. 给药前后做单用乙酰胆碱的对照.如恢复值小于 80%对照,则弃去.持续给药45s,记录峰电流. 两次用药刺激间隔2—3min,用细胞外液持续冲洗, 以减少细胞脱敏感. 数据分析按Hill公式计算激动剂的浓度 195 . 效应曲线.用改良Hill公式计算拮抗剂的浓度.效 应曲线.采用Clampfit8.0和Origin5.0进行数据分 析.计量数据用均数士标准差(士s)表示.不同 浓度间采用单因素方差分析,其他资料采用团体t 检验,P<0.05为差异有显着性. 结果 10nmol/L100t~mol/LAch刺激转染后的HEK 293细胞的,.nAChR或了.nAChR,可产生内向电流. 记录电流峰值并做浓度.效应曲线得Ach激动,. nAChR和了.nAChR的EC50值分别为(0.21士0.15) t~mol/L和(0.43?0.17)t~mol/L.二者无统计学差 异,见图1,2.以下实验均用100t~mol/LAch,因其可 使受体饱和. 维库溴铵和阿曲库铵可抑制Ach刺激转染后的 HEK293细胞的,.nAChR或了.nAChR的内向电流, 并呈浓度依赖性,见图3,4,5,6. 维库溴铵和阿曲库铵对,.nAChR作用的Ic明 显低于对了.nAChR的作用(P<0.05).维库溴铵抑 制,.nAChR的Ic卯小于阿曲库铵对,.nAChR的Ic (P<0.O1).维库溴铵抑制了.nAChR的Ic明显小 于阿曲库铵抑制了.nAChR的Ic(P<0.05),因此相 对于了.nAChR,,nAChR对两药更敏感,无论是,. nAChR或了.nAChR维库溴铵的效能均强于阿曲库 铵.见表1. 表1维库溴铵和阿曲库铵对E-和y.nAChR 作用的IC50(n=5,一X?s) 与维库溴铵比较,'P<0.05一P<0.Ol 与,.nAChR比较,.P<0.05 一 冰 一 需 求 1皿 雹 堪 脚 誊 lE一3O.Ol0.11lOl0o P,ehl0g(tool/L) 圈1Aeh对.nAChR的作用 ?舳?鲫柏?mO 196 一 术 一 静 1? :窨 堪 锄 誊 一 术 一 静 瑶 霉 中华麻醉学杂志2OO4年3月第24卷第3期 ChinJAneatheaiol,March2OO4,Vol24.No.3 圈2Aeh对EonAChR的作用 0.0l0.11l0l0ol00O 阿曲库铵log(mol/L) 圈3阿曲库铵对7-nAChR的作用(ate:阿曲库铵) l0o 90 80 70 60 50 瑶40 30 2o l0 0 0.0l0.1ll0l0ol00O 阿曲库铵log(mol/L) 圈4阿曲库铵对,.nAChR的作用(ate:阿曲库铵) 讨论 肌松药主要作用于神经肌肉接头后膜终板部的 nAChR.在机体的发育过程中,肌细胞膜上的 nAChR随着神经肌肉接头的发育而发生变化.肌细 胞在尚未受神经支配前,肌细胞膜上主要由肌细胞 核合成的7一nAChR,受体先是散在分布于细胞膜上 ,随着神经发育 而后集中于终板处.到幼儿2岁后 完善,7一nAChR合成减少并消失,而由,一nACHR替 代.肌细胞膜上的,一nACHR聚集在终板区.这个 一 术 一 静 瑶 霉 一 术 一 静 瑶 霉 维库滇饺log(tool/L) 图5维库溴铵对~-nAChR的作用(Yt~r;维库溴铵) IE-30.0l0.1ll0l0o1000 维库滇馁lraol/L) 圈6维库溴铵对7?nAChR的作用(Yt~r;维库溴铵) 过程主要受一些由肌细胞和运动神经末梢分泌的各 种因子调控.当机体受到损害时,如上下运动神经 元受损,肢体制动,肌肉缺乏电刺激和一些严重疾病 如败血症,肿瘤和烧伤,调控因子发生改变,致,一 nACHR合成减少,而重新合成7.nAChR.重新合成 的7一nAChR分布在包括终板区在内的整个肌细胞 膜上. ,一nACHR和7.nAChR均由5个亚基组成.各含 有2个a,1个8和1个6亚基,而另一个亚基,一 nACHR为,亚基,7一nAChR为7亚基组成….7亚基 与,亚基在基因表达有60%差异,而这种结构差异 导致两种受体在生理和药理特性及代谢上的不 同….,.nAChR代谢半衰期为2周,通道电导率高, 通道开放时间短,电流幅度大;而7一nAChR代谢半 衰期小于24h,通道电导率低,通道开放时间长,但 电流幅度小.两类受体的这些特性可能影响其对 肌松药的敏感性,如新生儿对肌松药的敏感性是否 与成人相同至今仍有争论.这除了新生儿的生理特 点影响,使肌松药在体内的分布容积,蛋白结合和清 除率等因素与成人有差异外,其神经肌肉接头后膜 上受体特性也可能是影响肌松药敏感性的另一个重 ???????{专m0 中华麻醉学杂志20O4年3月第24卷第3期 ChinJAnesthesiol,March2OO4,Vol24,No.3 要因素.本研究结果显示,7.nAChR对维库溴铵和 阿曲库铵的Ic均明显高于,一nAChR的Ic.这至 少在受体水平说明新生儿对上述两类化学结构的非 去极化肌松药的敏感性均相对较差.又如临床上已 证明烧伤病人和上下运动神经元损伤病人对非去极 化肌松药敏感性较差.这也佐证这些病人的7. nAChR增加,,.nAChR减少致使其对维库溴铵或阿 曲库铵这两类化学结构的非去极化肌松药的敏感性 均较差. 本实验重组的两类受体均可为乙酰胆碱激动, 乙酰胆碱激动两类受体的EC?值无统计学差异,而 这两类受体对维库溴铵和阿曲库铵的抑制作用均有 较大差异.对,.nAChR的抑制作用要强于对7. nAChR的抑制作用.这种差异可能与两类受体的结 合位点分子结构不同有关.nAChR与拮抗剂有两个 结合位点,一个位于a.8间组成,另一个位于a.,或 a.7间.因,亚基与7亚基结构不同,致a.,或a.7 的结合位点与肌松药亲和力不同.上述结果说 明其实验表明肌松药只影响两类受体的失活过程, 对他们的激活过程无作用.Jahn等用单通道膜片 钳研究转染后的HEK293细胞上的,一nAChR和7一 nAChR发现,两类受体只在受体失活存在差异,而对 受体的激活并无差别.这与本研究实验结果相似. 本研究在受体水平比较维库溴铵和阿曲库铵对 两类受体的抑制作用,结果显示维库溴铵抑制7. nAChR和,一nAChR的Ic?值明显小于阿曲库铵,在 受体水平说明维库溴铵对受体的抑制作用大于阿曲 库铵.这可能是维库溴铵的E较阿曲库铵的 ED小的一个重要原因. 参考文献 lFletcherGH.SteinbachJH.Ability0fnondepolarizingnelL,-'omus%'Rlar blockingdrugstoactaBpa而a1a~nistsatfetalandadultInotlflemuscle nicotinicreceptors.MolPharmacol,1996.49:938-947. 2JahnK,MohammadiB,KrampflKeta1.Deactlv~onanddesensitization ofmougeembryonic-andaduh-typenicotinicreceptorchannelcurrents. NeuroociLet.2ool,3o7:89-92. 3KimL.HiroseM,ManynJA.d-Tubocurarineaccentuatestheburn- inducedupregulationofnicotinicacetylcholinereceptorsatthemuscle membrane.Anesthesiology,1995,83,309-315. 4leeC.Intensivecareunitneuromuscularsyndrome?Anesthesiology, 1995,83:237-2,10. 5PaulM,KindlerCH,FoktRM,eta1.Isobolo@raphic~lysisofnoll- depolarisingmusclerelaxantinteractionsattheirreceptorsite.EurJ Pharmacol.2O02,438:35-43. 6DenmzumderD.Dilgerjr,.Thekinetics0fcompetitiveantagonismby cisatracuriumofembryonicandadultnicotinicacetylchollnereceptors. MolPharmacol,200l,60:797-80r7. (收稿日期:2003.11.20) (本文编辑:彭云水) 中华医学会系列杂志参考文献文内着录要求 ? 读者?作者?编者? 文内标注按引用文献出现的先后顺序连续编码,并将序号置于方括号中. 正文中引用参考文献根据具体情况分别按下述3种格式之一标注. 1.薛杜普等…指出棉酚从体内排泄缓慢. 2.麦胶敏感性肠病的发病有三种机制参与 3.间质细胞cAMP含量测定方法见文献[7] 正文指明原始文献作者姓名时,序号标注于作者姓名之后(如例1);正文未指明作 者或非原始文献作者时,序号标注于旬 末(如例2);正文直接述及文献序号时,不用角码标注(如例3). 标注尽可能靠近有关引文.标注写在标点符号之前. 图中引用参考文献,按其在中出现的次序编号,序号标注写在图的说明或注释 中,图中不应出现引文序号标注. 表中引用参考文献,按其在全文中出现的顺序编号,在表注中依次标注;若必须在 表身中标注,可另列一栏并将引文序码 置于方括号之中,以避免与表中其它数字相混淆. 中华医学会杂志社