中药及其制剂中丹皮酚的含量测定

中药及其制剂中丹皮酚的含量测定　　摘　要：丹皮酚的含量是衡量牡丹皮、徐长卿等中药材及以其组方的制剂六味地黄丸等质量控制的重要指标。本文综述了近年含丹皮酚的中药材及中药制剂测定时的前处理条件和各种测定方法。　　关键词：丹皮酚;牡丹皮;徐长卿;药物分析　　牡丹皮为毛茛科芍药属牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的干燥根皮，徐长卿为摩萝科植物徐长卿(Cynanchumpaniculatum(Bge.)kitag.)的根及全草。两者均是具有抗菌消炎作用的常用中草药，其主要有效成分均是丹皮酚(patpnol)。在常见的中药制剂六味地黄丸、金匮肾气丸、麦味地黄丸、当归养血丸等十余种中成药处方中均有配伍使用。丹皮酚含量是评价这些中成药质量的重要定量指标。中国药典(一九九五年版)规定六味地黄丸中丹皮酚含量是其定量指标之一[1]。由于中药材及其制剂成分十分复杂，若需要测定其中某一成分，样品的前处理是关键的一步，而处理方法又必须与选定的分析方法相适应。现将含丹皮酚的中药材及其制剂的样品处理和含量测定方法综述如下。　　1、光谱法　　1.1　紫外-可见分光光度法(Ultravioet-VisibleSpectrophotometry，UV)　　紫外-可见分光光度法具有操作简单、费用较低等优点。但由于该法基本上没有分离能力，样品处理要求严格，故常被用于一般要求不很严格的测定以及中药材炮制方法、处理条件的比较、制剂工艺选择等方面。丹皮酚具有一定的挥发性，光谱法中样品处理一般都用水蒸气蒸馏或直接蒸馏法提取，以减少混入杂质，通常蒸馏液稀释后于274nm处测定吸收度。周玉生等[2]用该法测定了牡丹皮中丹皮酚含量，比较了不同加工方法的丹皮酚的含量：取已加工的牡丹皮样品适量，置蒸馏瓶中，加水约120mL，蒸馏后得馏出液约有95mL，稀释后在274nm测定吸收度。结果发现，水洗50℃烘干损失率最高，为34.96%;白酒喷淋晾干，损失率最低，为11.19%。毛黎明等[3]用水蒸汽蒸馏法测定了六味地黄的浓缩丸、口服液、胶囊三类制剂中丹皮酚含量，将试样蒸馏后，收集馏液约450mL，加水稀释，定容后，在270nm处测定吸收度。结果发现不同制剂含量有明显差别。周海梅等[4]将样品置烧瓶中，加水后直接蒸馏，收集蒸馏液，稀释后用UV测定，结果与水蒸气蒸馏提取测定无明显差异。陈文斗[5]利用丹皮酚能与对硝基氯化重氮苯在碳酸钠溶液(pH10.5～11.5)中偶合呈色的原理，测定了制剂中丹皮酚含量。其方法是将牡丹皮样品在P2O5真空干燥器中干燥至恒重，取粉末100mg加0.2%NaOH溶液振摇，静置过滤，取续滤液适量，加入乙酸钠缓冲液和偶合试剂，反应2min，再加入碳酸钠溶液，反应3min，定容，以溶剂加试剂同样处理后为空白，在480nm处测定吸收度，结果丹皮酚在6.02～30.1μmol/L范围成良好线性关系，丹皮酚回收率达(99.97±0.97)%。　　1.2　胶束荧光法(MicellarFluorimetry，MCF)　　胶束荧光法常用十二烷基硫酸钠(SDS)作为胶束试剂，SDS在水溶液中能形成一种亲水基团向外、疏水基团向内的有序排列。当浓度≥该试剂的临界胶束浓度时，在溶液中形成胶束。在胶束的胶核里有一个疏水环境，有利于极性较小的丹皮酚的溶解，提高了微环境里丹皮酚的浓度，特别是由于胶束的稳定作用，能提高荧光量子产率，使该方法的灵敏度得到提高。庞志功等[6]用该法测定了牡丹皮和徐长卿中的丹皮酚含量。样品用1mol/L的HCl-甲醇溶液浸泡1h后，氯仿提取，提取液浓缩至干，用V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1溶解定容，取20μL，硅胶薄板点样，展开，刮取丹皮酚斑点，用φ=95%乙醇浸泡洗脱后，取适量，加2mLSDS溶液(1.5%)和水，快速混匀器上振荡5min，再用水定容，于EX275nm，EM550nm处测定荧光强度，丹皮酚在20pg/mL～800ng/mL浓度范围内成线性，r=0.9934，平均回收率94.2%(n=4)，最低检出限5.7pg。该方法操作简便，灵敏度高，适用于微量丹皮酚的测定。　　2、色谱法(chromatography)　　用于分析丹皮酚的色谱法有GC法、HPLC法、TLC法等，由于色谱法具有较高的分离能力和灵敏的能力，最适合于中药材及其制剂中有效成分的定性定量测定。　　2.1　气相色谱法(Gaschromatography，GC)　　气相色谱法具有很强的分离能力和很高的灵敏度，只需很少量的样品即可得到满意的结果。因此是分析成分复杂的中药中痕量成分的有效手段。为了增加检测灵敏度和选择性，并出于对色谱柱和检测器的保护，GC以及HPLC对中药样品的处理要求也较严格，除水蒸气蒸馏法外，还有多种其它有效的提取方法。杨昌金等[7]将六味地黄丸粉末1g用V(氯仿)∶V(丙酮)=2∶14mL，室温浸泡1h，超声20min，再加内标溶液(十八烷，2mg/mL丙酮液)1mL，摇匀，静置，取上清液1μL进样。色谱条件:2m长玻璃柱，填充剂用5%E-301涂布chromasorbw担体(80～100目)而成，柱温185℃，检测器及进样口温度220℃，N2为载气。结果，丹皮酚含量在4～200ng内线性良好，r=0.9998，平均回收率99.6%，检测下限浓度20ng/mL。殷霞等[8]用高分辨气相色谱法测定了六味地黄丸中丹皮酚含量，将样品碾碎，置索氏提取器中用乙酸乙酯提取4h，提取液过滤，浓缩至干，残渣用含内标正十六烷的甲醇溶液2mL溶解，离心，取上清液1μL进样。色谱条件：28m×0.28mmFSOT柱，固定液SE-30，柱温180℃，检测室、气化室温度均320℃，N2为载气，分流进样，分流比1∶93，FID检测。结果，在2.5～12.5μg/mL内，线性相关系数r=0.9995，平均回收率100.3%，RSD=1.38%。郭丽冰等[9]用直接蒸馏-大孔树脂-气相色谱法，测定了徐长卿中丹皮酚含量。样品粉末经水蒸气蒸馏后，取蒸馏液上大孔树脂DA-201柱，用乙醇洗脱，定容后吸取0.5mL洗脱液，加0.5mL内标(正十七烷乙醇液)，混匀后，取1μL进样。色谱条件，Hp-1710m×0.53mmI.D.弹性交联石英毛细管柱，程序升温，分离检测，检测器FID，温度220℃，N2为载气，分流进样，分流比1∶5，在3～80ng内，线性相关系数r=0.9997，平均加样回收率99.42%，RSD=2.28%。段玲等[10]用毛细管气相色谱法，以正十五烷为内标，测定了牡丹皮中丹皮酚含量，样品置100mL恒压滴液漏斗中，用无水乙醇回流提取4h，取提取液1mL加内标50μL，混匀，进样0.1μL。色谱条件，石英毛细管柱(10m×0.25mmI.D.)，SE-30键合相，FID检测，用三因素二水平正交设计-单纯形组合优化法对柱温、进样室温度、柱前压进行试验，得出最佳条件：柱温130℃，柱前压0.55kg/cm2。丹皮酚在10～900ng范围内线性相关，r=0.9984，平均回收率99.28%，RSD2.6%，结果与药典法、HPLC法一致。房杏春等[11]用直接蒸发-高分辨气相色谱法测定了牡丹皮和六味地黄丸中丹皮酚含量。取样品粉末(60目)1mg，精密称定，置裂解炉铂舟中，320℃，停留1min，丹皮酚完全蒸出，进入分析柱分析，结果准确稳定，精密度RSD小于4.0%。色谱条件:固定液SE-30，融熔石英毛细管柱(28m×0.28mmI.D.)，柱温185℃，气化室温度250℃，N2为载气，FID检测。在2.5～10μg范围内，线性相关系数r=0.9981。该法操作简便、快速、重现性好、用量少，避免了其它前处理时间长、操作繁琐、成分可能损失、会引进污染等缺点，特别有利于名贵中药分析。但该法需特殊附属设备裂解炉。缪海均等[12]用超临界流体萃取法(SFE)对牡丹皮及其成方制剂进行处理，然后用大孔径毛细管柱分离测定丹皮酚含量。其最佳提取条件是：超临界流体为CO2，温度90℃，压力28mPa，改性剂氯仿0.5mL，动态萃取体积3mL，静态萃取时间5min，在超临界萃取器中萃取。萃取物以十六烷醇为内标，氯仿定容，取0.5μL进样分析。气相色谱条件，大孔径交联石英毛细管柱(40m×0.53mmI.D.)，固定液SE-30，程序升温分离分析，100～210℃，20℃/min，气化室温度240℃，FID检测，温度280℃，载气N2。分析结果，在0.05～0.8μg内，r=0.9999，药材和制剂的平均加样回收率分别是97.8%，100.3%，RSD分别是2.35%和1.89%。该法利用超临界流体提取中药成分具有一定的选择性，提取效率高、混入杂质较少、可直接进样。并且大孔径毛细管气相色谱法有较高的总柱效、理想的表面惰性、接近填充柱的负荷量、较长的柱寿命及较快的分析速度等突出优点，非常适用于含复杂组分的中药分析。　　2.2　高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidchromatography，HPLC)　　高效液相色谱法具有高分离能力、高灵敏度、应用广泛的特点。特别是反相高效液相色谱法对于含有多组分混合物的中药及其制剂的分析测定更具特色。汪海孙等[14]用外标法测定了桅柏地黄丸等九种含有牡丹皮的中成药中丹皮酚的含量。将样品干燥粉末1g用甲醇浸渍24h，离心，取上清液5μL进样分析。色谱条件:日立胶3010柱(50cm×2.1mmI.D.)，甲醇为流动相，流速1.5mL/min，UV检测波长274nm。结果平均加样回收率100.08%，RSD=0.36%，在0.2～1.0μg内，线性相关，r=0.99992。丁安伟等[14]测定了丹皮炭中丹皮酚的含量。取干燥样品粉末15mL，用甲醇10mL浸泡，超声波超声30min，离心，取上清液10μL进样。色谱条件：PE-PackC18柱(150mm×4.6mmI.D.)，流速0.5mL/min，274nmUV检测。结果在0.025～0.38μg范围内成良好线性，r=0.9999，平均加样回收率103.4%，RSD=1.31%。刘放等[15]用外标法测定了牡丹皮中丹皮酚含量。取过60目筛的样品粉末0.1g用30mL甲醇浸泡超声处理30min，甲醇定容，静置，取上清液微孔滤膜滤过，取10μL进样。色谱条件：ResolveODS柱(150×4.6mmI.D.)，V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(水)=58∶2∶40，流速1mL/min，274nmUV检测。结果在0.025～0.25μg内线性良好，r=0.9997;平均加样回收率97.07%，RSD=1.12%。并用乙醚萃取作对照，结果无显著性差异，但后者要求室温下挥去乙醚，再用甲醇定容，才能保证丹皮酚不会挥发损失。郭戎等[16]用外标两点法测定了加味逍遥颗粒中丹皮酚含量。将颗粒碾细，取0.2g用流动相10mL浸泡，超声处理30min，提取2次，离心，上清液稀释定容，微孔滤膜过滤，取5μL进样。色谱条件：YWG-C18柱(150×4.6mmI.D.)，流动相:V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)=80∶20∶1，流速0.5mL/min，柱温30℃，274nmUV检测。结果0.02～0.30μg内，线性良好，r=0.9999，RSD=1.33%(n=8)。　　2.3　反相薄层色谱法(ReversedPhaseThinLayerchromatography，RPTLC)　　高效薄层具有很高的分离能力，配备微机控制扫描设备，因而具有高灵敏度、样品用量少、处理较简单、薄层板可用强氧化性显色剂显色、并可多次重复扫描等优点。但反相薄层色谱法用于分析丹皮酚含量很少报导。高鲁霞等[17]用该法同时测定了牡丹皮中丹皮酚和芍药苷含量。将样品粉碎过60目筛，用70%甲醇水溶液浸泡8h，超声处理30min，离心4000r/min，15min，取上清液点样。薄层和扫描条件：Rp-18F254高效薄层板，70%四氢呋喃溶液(含0.1%四丁基溴化铵)浸渍，干燥，用四氢呋喃-水(含0.1%四丁基溴化铵)=42∶58展开，展距4.5cm，取出，挥干，用同一展开剂进行二次同向展开，展距2.5cm，UV254nm定位，由色谱图可见，丹皮酚和芍药苷分离良好。对丹皮酚用单波长299nm锯齿扫描，结果平均回收率89.4%，此法简便、准确、重现性好。　　3、小结　　丹皮酚是中药材牡丹皮和徐长卿及其制剂所含主要成分之一。其含量测定方法还有溴量法[18]、库仑滴定法[19]等，但这些方法已不多用。综上所述，从含丹皮酚中药及其制剂分析前处理方法和测定方法来看，样品处理主要有两类，一是蒸馏法:直接蒸馏法和水蒸气蒸馏法，提取液较单纯，适用于紫外法等无分离能力的仪器分析;另一类是有机溶剂浸出法，效率较高，若配以超声处理，可大大缩短分析测定时间，但混入杂质较多，适用于具有高分离能力的色谱分析法。鉴于丹皮酚本身具有一定的挥发性，在中药材及其制剂中含量均不高，加之中药成分的复杂性，在条件许可的情况下，毛细管气相色谱法应是中药材及其制剂中丹皮酚首选的分离分析方法。　　　　[1]中国药典(一九九五年二部)[S].1995.147，254，447.　　[2]周玉生，吴泽丰，陈顺烈.不同加工方法对牡丹皮中牡丹酚含量的影响[J].中国医院药学杂志，1992，12(2)：72.　　[3]毛黎明.六味地黄制剂丹皮酚含量测定[J].江苏中医，1997，18(9):32.　　[4]周海梅，李克君，郭巧霞等.紫外分光光度法测定丹皮中牡丹酚的含量[J].中草药，1995，26(6):325.　　[5]陈文斗.丹皮酚偶合比色法测定的研究[J].药学通报，1980，15(11):4.　　[6]庞志功，汪宝琪，杨云等.用胶束荧光法测定丹皮酚的含量研究[J].沈阳药学院学报，1993，10(3):218.　　[7]杨昌金，朱启敏，梁有军.气相色谱法测定中成药中丹皮酚含量[J].中成药，1990，12(10):16.　　[8]殷霞，吴虹，安登魁.高分辨气相色谱法测定六味地黄丸中丹皮酚的含量[J].现代应用药学，1993，10(1):24.　　[9]郭丽冰，梁锦基，杨其蕴.气相色谱法测定徐长卿中丹皮酚含量[J].中国中药杂志，1996，21(8):484.　　[10]段玲，汪丽霞，相秉仁.毛细管气相色谱法测定牡丹皮中丹皮酚的含量[J].中国药科大学学报，1989，20(5):271.　　[11]房杏春，殷霞，相秉仁.直接蒸发-高分辨气相色谱分析牡丹皮和六味地黄丸中丹皮酚的含量[J].中国药科大学学报，1989，20(6):370.　　[12]缪海均，柳正良，李云华.超临界流体萃取法-毛细管气相色谱法分析牡丹皮及制剂中丹皮酚的含量[J].药学学报，1997，32(12):928.　　[13]汪海孙，刘信顺.高压液相色谱法测定中成药中丹皮酚含量[J].中成药研究，1986(1):12.　　[14]丁安伟，郭戎，徐菊如，等.丹皮炭中丹皮酚含量的高效液相色谱测定[J].中国中药杂志，1996，21(1):23.　　[15]刘放，黄伟平.HPLC法测定牡丹皮及其制剂中丹皮酚含量[J].基层中药杂志，1997，11(1):34.　　[16]郭戎，狄留庆，谢辉，等.HPLC法测定加味逍遥颗粒中丹皮酚的含量[J].中国中药杂志，1998，23(3):156.　　[17]高鲁霞，梁素谦，王苓，等.牡丹皮中丹皮酚和芍药苷的反相薄层色谱反相[J].山东中医学院学报，1995，19(4):266.　　[18]吴波.中药牡丹皮的研究-牡丹皮中丹皮酚的含量测定[J].药学学报，1966，13(2):145.　　[19]徐礼莘，刘爱茹.中草药有效成分测定1-牡丹皮和徐长卿中丹皮酚的库仑滴定法[J].药学学报，1980，15(3):184.