重组结核分枝杆菌Mr38000蛋白的表达、纯化和鉴定

重组结核分枝杆菌Mr38000蛋白的达、纯化和鉴定　　摘要从H37Rv基因组中扩增Mr38000蛋白基因并高效表达和纯化。用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Mr38000蛋白序列，将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coliDH5α，构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/Mr38000，测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coliDH5α，IPTG诱导目的蛋白表达。经Western-blot鉴定目的基因与(His)6融合表达，将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化。PCR得到结核分枝杆菌Mr38000蛋白基因，测序结果与GeBank中报道的完全一致。SDS-PAGE显示，在Mr为38.5×103处有相应的蛋白质表达条带，Wesernblot鉴定为(His)6融合表达蛋白。经Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白。成功克隆了铁调节蛋白基因Mr38000蛋白序列，并在E.coliDH5α高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白。　　关键词Mr38000蛋白;表达;纯化;结核分枝杆菌;　　Cloning,ExpressionandPurificationofMr38000protein　　fromMycobacteriumtuberculosis　　ZHANGMing，LIJin-cheng，LINHang　　(Departmentofinternalneurology,2.emergencydepartment,theFuZhougeneralhospital,FuZhou,350025,P.R.China)　　[Abstract]ToobtainMycobacteriumtuberculosisMr38000proteinfromH37Rv-DNA,expressefficientlyinE.coliandpurifytheMr38000proteins.Mr38000proteingenewasamplifiedbyPCRfromthegenomeofH37RvandclonedintopGEM-T-Easyvector.Aftersequenced,Mr38000proteingenewasrecombinatedexpressionvectorpQE-80Lbyrestrictionenzymedigestion,namedpQE-80L-Mr38000.TheplasmidpQE-80L-Mr38000wastransformedintoE.coliDH5αandinducedbyIPTG.Mr38000proteinexpressionwasanalyzedbySDS-PAGEandconfirmedbywesternblotwithmice-specificmAbagainst(His)6.Mr38000proteingenewasidenticalwithGeBankreported.ThepQE-80L-Mr38000vectorexpressedproteinwithrelativemoleculeweightabout38.5kD,whichcouldbecaughtby(His)6mAb.TheexpressedproteincouldbepurifiedbyNi-NTAsystemkitwithdenativecondition.Mr38000proteingenehadbeensuccessfullyclonedandefficientlyexpressedinE.coli,TheresultsestablishedthebasisforfurtherstudyofthefunctionofMr38000protein.　　[Keywords]Mr38000protein;expression;purification;Mycobacteriumtuberculosis(MTB)　　结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是结核病(tuberculosis,TB)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。目前常用的PPD试验，常使BCG疫苗接种者被误检为阳性[1]，且对后期结核患者敏感性较低，存在明显不足。近年来，有研究发现Mr38000蛋白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点[2,3]，可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌Mr38000蛋白并对其进行了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。　　1　材料和方法　　1.1材料　MTB毒株H37Rv、DH5α由本室保存;pGEM-T-Easy及WizardPlusPurificationsystem购自Promega公司;X-gal，限制性内切酶BamHⅠ,EcoRⅠ及T4-DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品;IPTG,DTT,DTE,小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene公司产品。　　1.2方法　　1.2.1引物的与合成根据已发表的MTBH37Rv全基因组Mr38000蛋白基因序列设计引物。上游引物P1:5’-AGGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位点和起始密码子，下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’中加入EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。　　1.2.2Mr38000片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的MTBH37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3wk。取5mL液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液(10╳PCR绶冲液5μL,45g/L吐温，5μL,45g/L,NP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL及水34.5μL)中。于55℃水浴1h，沸水浴10min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μLTE中，作为DNA。PCR反应体系为：10╳buffer5μL,dNTPs5μL(2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL，P1，P2引物各1μL(25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR条件：94℃变性40s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环。　　1.2.3PCR产物的克隆与鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy进行连接反应，转化感受态DH5α，均匀涂布于含有x-gal(33μL)和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG(20μL)的LB培养皿中，37℃培养16h，挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEM-T-Easy-Mr38000，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。　　1.2.4目的蛋白的诱导表达经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与经同样酶切的pQE-80L载体进行连接反应，转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE-80L-Mr38000。在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中过夜培养pQE-80L-Mr38000。按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3h，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmoL/L，37℃继续培养4~5h。取1.5mL细菌培养物，8000g离心30s收集菌体，加入2╳样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃,5min;8000g离心5min;取上清进行SDS-PAGE电泳检测。　　1.2.5目的蛋白的Westernblot分析将经诱导的pQE-80L-Mr38000和E.coliDH5α分别制样，进行12%SDS-PAGE后以0.15mA恒流电转2h至硝酸纤维素膜上，用50g/L脱脂奶封闭2h，PBS洗涤后加抗His的单克隆抗体(1:5000稀释)4℃过夜，PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h。PBS洗涤后DAB显色观察结果。　　1.2.6目的蛋白的可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌。离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。　　1.2.7目的蛋白的纯化根据Ni-NTA试剂盒的说明，将融合蛋白与NI-NTA结合，用不同pH值咪唑溶液进行洗脱，得到纯化产物。　　2结果　　2.1Mr38000蛋白片段的扩增及序列测定经30个循环PCR扩增，可得与预计长度相等的片断(图1)。将DNA回收后插入pGEM-T-Easy载体，经测序证实所扩增的Mr38000序列与GeBank数据库所收录的Mr38000序列完全一致。　　M:DNAmarkerDL2000;1:Mr38000基因PCR产物;　　图1PCR扩增Mr38000蛋白基因产物琼脂糖凝胶电泳(10g/L)结果　　2.2表达载体的构建pQE-80L经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与Mr38000基因目的片断进行连接反应后，转化感受态E.coliDH5α。挑取的克隆子进行酶切鉴定，切出约1151bp大小片段的为阳性克隆子(图2)，命名为pQE-80L-Mr38000。　　M:DNAmarkerDL2000;1,2:pQE-80L–Mr38000;　　图2pQE-80L-Mr38000重组质粒BamHI和EcoRⅠ双酶切鉴定结果　　2.3Mr38000蛋白在pQE-80L表达载体中的诱导表达将pQE-80L-Mr38000经37℃活化过夜，经IPTG诱导表达后做SDS-PAGE分析，从电泳图中可以看出在Mr为38.5╳103一致处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的20%(图3)。　　M：蛋白分子量marker;1:未诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α;　　2-4:诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α;　　图3(His)6-Mr38000融合蛋白的SDS-PAGE分析　　2.4目的蛋白的鉴定所构建的重组质粒表达的Mr38000蛋白以带有6个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗(His)6mAb验证Mr38000蛋白的表达。结果显示在Mr为38.5×103处有一显色带，而对照无相应条带(图4)。　　M：蛋白分子量marker;1:(His)6-Mr38000proteinexpression2.DH5α　　图4(His)6-Mr38000融合蛋白的Westernblot分析结果　　2.5目的蛋白的可溶性分析将上清和沉淀分别所制样品，进行SDS-PAGE分析表明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中则很少(图5)。　　M：蛋白分子量marker;1:未诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α;　　2：诱导菌超声裂解后沉淀;3:诱导菌超声裂解后上清;　　图5(His)6-Mr38000融合蛋白的可溶性分析　　2.6目的蛋白的纯化纯化的产物经SDS-PAGE分析可在Mr为38.5╳103处得到一条清晰的条带(图6)。　　M：蛋白分子量marker;1:未诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α;　　2:诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5α;3,4:(His)6-Mr38000纯化蛋白　　图6(His)6-Mr38000融合蛋白的表达及纯化　　3讨论　　Mr38000蛋白是一种磷酸盐转运蛋白，含有对结核分枝杆菌特异单克隆抗体定位的7个表位，具有较强的抗原性，已经得到了结核病研究学者们的一致认可。1992年，Bothamley[4]等认为Mr38000蛋白是研究菌阴性肺结核最有用的抗原之一。2006年Mark[5]等通过蛋白质基因芯片和病人血清筛选，发现Mr38000蛋白是空洞性肺结核所特有的蛋白抗原。　　本实验中应用的pQE-80L表达载体为4751bp，起始码下游接有6个组氨酸，双链环状，Amp抗性，多克隆位点有17个单一限制性酶切位点。PCR产物共有约1150bp，与Mr38000蛋白基因大小相符合。Mr38000克隆入pQE-80L载体中与6个组氨酸融合，可产生共约390个氨基酸的融合蛋白，Mr为38.5×103左右，实验结果与理论值相符合。融合蛋白有(His)6的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明Mr38000蛋白表达，同时(His)6的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点，它可与Ni+特异性结合，通过Ni-NTA亲和色谱柱可得到纯化的目的蛋白。　　我们在原核表达系统中成功表达结核分枝杆菌的Mr38000蛋白，并进行了初步鉴定和纯化，为下一步深入研究Mr38000蛋白的功能奠定了基础。　　参考文献　　[1]BrittonWJ,Palengira.Improvingvaccinesagainsttuberculosis[J].ImmunalCellBiol,2003:81(1):34—45.　　[2]WorldHealthOrganizationGlobalTuberculosisControl-Surveillance,Planning,Financing,WHORepot2005,WorldHealthOriganization,Gengeva.　　[3]LaalS,SkeikyYA.Immune-basedmethods,inTuberculosisandtheTubercleBacillus[J].AmericanSocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.2005,71—83.　　[4]BothamleyGH,RRudd,FFestenstein.ClinicalvalueofthemeasurementofMycobacteriumtubercuosisspecificantibodyinpulmonarytuberculosis[J].Zthorax,1992,47:270—275.　　[5]MarkJ,Sartain,RlaydenA,etal.DiseaseStateDifferentiationandIdentificationofTuberculosisBiomarkersViaNativeAntigenArrayProfiling[J].Molecular&CellularProteomics,2005,5:2012—2113.　　J359-120716-0030