坐骨神经分支选择性损伤模型及NMDAR、CGRP与疼痛的关系

坐骨神经分支选择性损伤模型及NMDAR、CGRP与疼痛的关系 毕业 慢性疼痛是1种常见的病症，在所有的成年人中它的患病率在2-40%范围[1]，它是由感受伤害和神经源性痛两部分组成[2]。虽然在我国还没有具体统计，但是在美国慢性神经性疼痛患者估计有3千多万，包括如下1些状况：癌症相关的疼痛，脊髓损伤，腰背痛和幻觉痛[3]。反复和持续的疼痛（从背痛到面神经痛）占美国保健协会会员的45%[4，5]，在英国进行疼痛治疗的25%的患者都经历过神经性疼痛症状的困扰[6]。神经病理性疼痛是慢性疼痛中描叙较多的1种病理症状。 神经病理性疼痛是与多种周围神经障碍相关联的1组共同现的症状，包括与糖尿病、甲状腺功能低下、尿毒症等相关的神经障碍。国际疼痛学会（IASP，1994）将这种由于外周或中枢神经系统的直接损伤功能紊乱引起的疼痛称为神经病理性疼痛。神经病理性疼痛是医学领域的挑战性研究课题，目前发病机制不清，尚缺乏有效的治疗措施。对神经病理性疼痛发病机制的研究大多来源于动物模型；尽管模型还存在不少缺陷，但是它为理解和探索人类神经病理性疼痛的发病机制提供了有用的工具。既往采用包括慢性缩窄性损伤模型（CCI模型） [7]、部分坐骨神经结扎模型（PSNL模型） [8]和脊神经结扎模型（SSNL模型）[9]在内的多种动物模型来模拟神经病理性痛的临床特点，研究其机制，以其为治疗临床神经病理性痛提供思路，但这些模型由于自身不同的缺陷（如前两个模型损伤程度复制困难从而导致它们变异性大，后1个模型存在对L4脊神经损伤或暴露时引起感染的风险），不能很好模拟临床上类似的神经损伤后的神经病理痛。 美国哈佛医学院的Woolf及其研究组[10]于2000年建立了大鼠坐骨神经分支选择结扎切断模型（Spared nerve injury model，SNI）并观察了其行为学表现，其后，不同的实验组对该模型的药理学特性以及参与该过程的神经递质开展了研究[]。与其它模型相比，该模型具有神经损伤程度固定，可重复性好，产生的行为学表现持久，可研究损伤的初级神经元与临近未受损伤的初级传入神经元的变化，能够提供接近模拟临床神经性疼痛的许多特征，是1种较理想的疼痛模型。 近年来，对外周神经损伤所致的神经病理性疼痛的分子、细胞机制，特别是在初级感觉神经元和脊髓水平的研究积累了较丰富的资料。最近几年发展起来从分子生物学的角度探讨神经病理性疼痛的机制更是为神经病理性疼痛的机制和治疗带来了新的思路。目前研究证实，在神经性疼痛的形成过程中，脊髓的N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors,NMDAR）的活化以及降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）增加在慢性疼痛的产生和维持具有密切关系。因此本文将对SNI模型的建立、行为学变化等方面对该模型进行阐述，同时对NMDAR和CGRP在神经病理性疼痛的形成机制中的作用进展作1综述。 坐骨神经分支选择结扎切断模型（Spared nerve injury model，SNI） 1 、SNI模型的建立 在2%的氟烷麻醉下从大腿侧边划开皮肤，然后把股2头肌断开，暴露出坐骨神经和它的3个末端分支：腓肠神经，腓总神经和腓神经（见图1）。   图1： 表示的是坐骨神经和隐神经,它们的终末分支和它们的背根来源展现了隐神经（股神经丛，L3 背根神经节）和坐骨神经丛（L4，5和L6 背根神经节）有极小的重叠。图中斜线的地方表示在坐骨神经的胫神经和腓总神经处结扎，保留腓肠神经完整。 SNI的操作程序包括：把胫神经和腓总神经结扎离断而使腓肠神经保持完整。用5.0丝线把胫神经和腓总神经紧紧结扎，在靠近结扎的远侧端切断，保留大约2-4mm的远侧残端。需要特别小心尽量避免对腓肠神经任何的接触或扭曲。肌肉和皮肤分两层缝合。 压榨对照（分支神经压榨组）也象前面1样执行，除开用1双钳上有光滑的护垫的小动脉钳在胫神经和腓总神经上夹注30s，夹完后仔细观察神经并且看到有明显的压痕。假手术对照组为暴露坐骨神经和它的3个分支没有任何处理。 2、SNI模型的行为学特征 以上的操作程序能引起SNI模型术后24h大鼠同侧腓肠神经感受野（即后爪跖外侧）对正常机械性刺激产生伤害性缩足反射（机械性痛超敏），伤害性机械性刺激所引起的伤害性反射显著增强（机械性痛过敏），非伤害性冷刺激引起的伤害性缩足反应（冷痛超敏），伤害性热刺激引起的缩足时间显著延长（热痛过敏），这些异常反应1般会在2周后达到高峰，并可以持续达6个月以上时间[10]。 在SNI模型有几个比较典型的特征，首先最重要的特征就是对正常无伤害性的机械性刺激表现出非常显著超敏反应，并且持续时间比较长（达6个月之久）。其次隐神经和腓肠神经感受野出现不同程度的病理性痛行为（见图2），在腓肠神经区域灵敏度的改变（只是部分的坐骨神经丛）大大超过隐神经区域。尽管组成隐神经的轴突主要来自L3节段的背根神经元，而组成坐骨神经的轴突来源于L4，L5和L6节段的背根神经元。在模型中，由于胫神经和腓总神经被切断，发出轴突组成胫神经和腓总神经的背根神经节神经元势必发生变化，从而以旁分泌   图2 被坐骨神经终末分支和隐神经支配的大鼠后爪背面和跖面皮肤的不同区域。在皮肤区域的交界之间可能发生1些轴索末端的重叠。 等方式引起周围未受损的腓肠神经的神经元，提高它的兴奋性。虽然L3节段背根神经节内受损神经元正常神经元之间的相互作用相对较弱，隐神经的兴奋性改变不大，但隐神经可能与胫神经和腓总神经感受野有部分重叠，而损伤后局部释放的多种因子[11]，从而引起隐神经来源的伤害性感受器敏感性提高。 还有SNI模型不同于其它模型的是，大鼠对热刺激的缩足时间并未延长，而对热刺激的伤害性缩足时间延长，说明此模型不存在外周敏化，但是存在中枢敏化，因而更接近临床病理性神经痛。 3、SNI模型的应用 因SNI模型具有以上所述的特征，使它更接近临床病理性神经痛的特点，所以有许多研究利用传统的镇痛药物以及新近出现的针对神经病理性痛的药物在SNI模型上进行了测试，使其成为研究临床病理性痛机制的有用工具。 阿片类药物 临床中遇到的神经病理性疼痛虽然缺乏有效的治疗措施，但阿片类药物依然是目前临床上在治疗慢性疼痛方面较为有效的镇痛剂，阿片类药物在发挥镇痛作用时，通过激活细胞膜表面的阿片受体，干扰复杂的内源性神经递质系统，主要在中枢神经系统水平发挥作用。吗啡对神经病理痛的疗效在临床上尚存在争议，但有研究[12]在SNI模型中应用非镇静剂量的吗啡（皮下注射），观察到它可以有效地减弱SNI术后的机械性痛超敏、冷痛超敏和机械性痛过敏，该作用较为持久。目前尚无其它阿片类药物对SNI模型神经病理性痛行为反应影响的结果。 离子型谷氨酸受体拮抗剂 NMDA受体拮抗剂MK801在SNI模型中腹腔注射后，发现对神经病理痛行为反应几乎没有影响，提示C纤维介导的中枢敏化过程并不参与SNI诱导的神经病理性痛[13]。AMPA受体拮抗剂NS1209在腹腔注射后，对SNI诱导的机械性痛超敏、冷痛超敏几乎没有任何作用，但可以轻度减弱机械性痛超敏。 钠离子通道阻滞剂 已有研究发现多种钠离子通道阻滞剂：抗痉挛剂、局部麻醉剂、抗心律失常剂等都能缓解神经病理性痛[14，15]。在SNI模型中腹腔注射抗心律失常药Mexiletine，观察到可以同时缓解痛超敏和痛过敏，这些提示有些钠离子通道阻滞剂可以用来治疗神经病理性疼痛。 PKC抑制剂 大量的研究证明PKC与脊髓水平的伤害性感受的传递和调剂有关。在鞘内注射PKC抑制剂神经节苷后，Mao等[16]发现可明显减轻神经损伤大鼠的疼痛行为，并且在测定损伤组大鼠脊髓的PKC时，也观察到比对照组明显减少。在结扎1侧坐骨神经后，鞘内内注射PKC抑制剂（GF1092303X）可以减轻大鼠引起的后爪痛觉过敏[17]。在辣椒素所致的疼痛行为中，发现PKC抑制剂能逆转其所致的触诱发痛。形态学研究证实PKC阳性神经元主要集中于脊髓背角 [18]。但是对于PKC抑制剂在SNI模型中的研究还未见报道。 针对神经病理性痛的镇痛新药 Gabapentin是1种新药，腹腔注射后发现其可以完全缓解SNI诱导的机械性痛超敏，持续时间至少3h，但对冷痛超敏和机械性痛过敏作用不大，其机制可能是通过抑制背根神经节内的α2δ亚单位的表达上调所致[19]。当然随着科研水平以及科技开发的提高，将会有更多的新药用于神经病理痛模型，以便阐明神经病理痛的机制，更好的为临床服务，解决神经病理痛带给患者的痛苦。 4、 结语 SNI模型是1种新的外周神经损伤所致的长时程神经病理痛动物模型，能够提供接近模拟临床神经性疼痛的许多特征，是1种较理想的疼痛模型。虽然其机制尚不清楚，但已有许多研究提示SNI模型是1种较为理想研究神经病理痛机制的新型工具。 NMDAR、CGRP与疼痛的关系 1、NMDAR与疼痛的关系 1、 NMDAR的生物学特性 NMDAR是中枢神经系统主要的兴奋性递质谷氨酸受体的1个类型，属于离子型受体，在中枢神经系统许多重要的生理和病理过程中，如神经网络的发育、突触的可塑性、LTP的产生、学习和记忆、缺血性神经元坏死、神经退行性变、癫痫和疼痛等，起着关键作用[20]。NMDAR显示有许多与其它配体门控离子通道不同的特性：(1)受体控制单价离子和对钙有高度渗透性的阳离子通道；(2)同时结合谷氨酸和甘氨酸需要辅激动剂(coaponist)以有效激活NMDAR；(3)在静息膜电位，NMDAR通道被细胞外镁所阻断，而只有同时去极化和结合激动剂下开放。 Moriyoshi等（1991年）首次报道从大鼠脑组织中成功克隆出1种功能性NMDAR亚基的cDNA（NMDAR1）。随后Nakanishi等（1991年）又从大鼠脑组织中克隆了4个新的NMDAR亚基的cDNA（NMDAR2A～2D）。所以目前研究的NMDAR基本分为5种亚型，即NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D，它们的基因各自定位于5条不同的染色体上。NMDAR1是含有938个氨基酸残端的跨膜蛋白，其分子量是105，000，NMDAR1家族只有1个独立基因，但有8个不同的剪接变体（NMDAR1A～1H），其氨基酸序列在不同种系之间有98%以上的同源性。NMDAR2家族共有4个独立的基因（NMDAR2A～2D），于NMDAR1之间仅有18～20%的同源性，NMDAR2亚单位的分子量要比NMDAR1大，由1220～1456个氨基酸组成。NMDAR是由NMDAR1与不同的NMDAR2亚基组成的异聚体，其中NMDAR1是必需的组分，而NMDAR2的介入则修饰了整个受体的功能特性[21]。 NMDAR1 及NMDAR2 各亚基细胞外N-末端含有潜在的糖苷化位点,而细胞内存在有钙激活的蛋白激酶(PKC) 和Ca2+/CaM PKII 磷酸化位点。NMDAR1 的C-末端还可与钙调素结合。酪氨酸磷酸化也可调节NMDAR 通道的开放,1种非受体的酪氨酸激酶Src 可能生理性地与NMDAR 的胞浆侧相联系,该激酶的活化促进通道的开放[22] 。进1步的研究发现,NMDAR 的胞内侧(其亚基的C-末端) 与各种细胞骨架成分如含有“突触组织者(synaptic organizers) ”PDZ 区的PSD-95 和PSD-93 蛋白相结合,这不仅对受体在突触后膜的聚集具有重要作用,而且特异性地将受体与其他下游信号分子相联结[23] 。 2、 NMDAR在痛觉传递和调制中的作用 兴奋性氨基酸是中枢神经系统重要的神经递质，直至80年代，由于受体类型和特异性拮抗剂的使用，才促使开始研究兴奋性氨基酸与痛觉信息的传递的关系。兴奋性氨基酸介导的伤害性初级传入向脊髓传递，而谷氨酸的不同受体类型在脊髓背角神经元的信息传递过程中发挥不同的作用。当外周神经损伤时可引起兴奋性氨基酸在脊髓背角释放增多，兴奋性氨基酸能与NMDAR和其它非NMDAR结合。非NMDAR被兴奋后，使细胞膜对Na+-K+通透性增加，产生快兴奋性突触后电位（EPSP），引起突触后膜去极化，从而导致神经元的快速兴奋效应。当去极化达到1定程度后，可使位于NMDAR通道内静息状态时阻塞Ca2+通道的Mg2+移开，Ca2+通道开放，Ca2+得以内流，使细胞内的Ca2+浓度增加，后者激活PKC，使PKC移位到细胞膜上，引起NMDAR磷酸化，进1步使受体功能上调，从而提高受体神经元的兴奋性。外周组织损伤或炎症可激活Aδ、C纤维，在脊髓背角大量释放谷氨酸和P物质，谷氨酸可直接激活突触后膜的NMDAR；NMDAR 去阻滞和激活,最终导致大量Ca2 + 涌入细胞内,引发1系列细胞内过程。首先是激活磷脂酶（PLC） ,使磷脂酰肌醇水解，产生细胞内第2信使3磷酸肌醇（IP3） 和甘油3酯（DG）。IP3 促使内质网Ca2 + 库的释放,进1步使胞内Ca2 + 升高,引起细胞兴奋性改变。随着细胞内Ca2 +升高，引发产生DG进1步激活促使PKC 转位和激活，使细胞膜磷酸化NMDAR，使NMDAR兴奋性升高和Ca2 +内流增加。NMDAR激活后又可进1步活化PKC，细胞内的Ca2 +浓度升高也可影响PKC的活性，从而形成1种正反馈效应[24]。 1氧化氮( nitricoxide ,NO) 参与脊髓伤害性信息的传递和痛敏的形成是近年来研究比较多的。存在于具有痛觉传递作用的脊髓区域的催化游离L-精氨酸产生NO 的NO 生成酶(NOS) 的1个构型硫辛酰胺脱氢酶(NADPH) 已在后角和背根神经元中得到证明。这1NOS 构型具有1需Ca2 + 激活的钙调蛋白敏感位点,而激活该位点的Ca2 + 通常通过NMDA受体的激活获得。在大鼠髓腔内注入NMDA 后,对热刺激形成过敏状态,如同时给予NOS 抑制药后,大鼠对热刺激逃避潜伏期延长,表明有镇痛作用[25]。但有趣的是,在髓腔内直接注入NOS抑制药,不能延长大鼠对热刺激逃避潜伏期,这表明通过NMDA受体形成的热刺激过敏状态是由NO 完成的,但NO 本身对脊髓的热侵害刺激传导并不重要。 在外周神经损伤引起的神经病理性疼痛中，中枢敏化影响着痛觉超敏的形成。中枢敏化的特点是存在上扬现象（Wind-up）和长时程增强效应（LTP）。在脊髓背角用细胞外记录技术观察到,角叉菜胶1侧足底注射致炎后,电刺激该侧足底内外侧神经,激动其中A、C 纤维时,脊髓背角神经元的诱发放电数均显著增加;静脉注射NMDA 受体拮抗剂氯胺酮后,A、C 纤维刺激诱发的放电反应均显著下降甚至消失。静脉注射氯胺酮,致炎后脊髓背角深层单位出现Wind up 现象也减轻或消失[26]提示NMDAR在炎症痛的产生和Wind up 形成中起重要作用[27] 。1973 年,Bliss 和Lomo 首先通过麻醉家兔发现单突触重复刺激或两组突触以协同方式共同活化可产生兴奋性突触后反应增强的现象,并将其称为LTP ;随后发现NMDAR对于LTP 的诱导是必要的。1定强度和频率的刺激使突触后膜的兴奋性突触后电位(excitatory post synaptic potential , EPSP) 产生叠加效应,使位于NMDAR通道内的Mg2 + 移开,胞内Ca2 + 浓度升高,导致钙/ 钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ) 自身磷酸化,发生自身激活。激活后的CaMKⅡ主要通过磷酸化突触前后的靶蛋白α-氨基羟甲基恶唑丙酸( alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid ,AMPA) 、突触素Ⅰ( synapsinⅠ) 和微管相关蛋白2 (microtubule associated protein 2 ,MAP2)参与L TP 的诱导和维持[28] 。 2、CGRP与疼痛的关系 1、CGRP分子生物学特性及分布 20世纪50年代，发现在背根神经节的神经元中存在P物质、CGRP和生长抑素，且所有含P物质的神经元都可以合成CGRP。随着Amara等在1982年发现生物活性肽-CGRP以来，对这种物质的了解逐渐清楚。CGRP家族包括5个成员：CGRPα、CGRPβ、CT ﹑胰淀粉样酶(Amylin)和肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM)。CGRP是迄今已知最强的内源性扩血管肽；CT主要参与钙代谢；Amylin位于胰腺β细胞， 与Ⅱ型糖尿病有关；ADM 与CGRP具有相似的生物学作用，亦具有较强的扩血管作用[29]。Katafuchi T等最近又发现了降钙素基因相关肽家族的新成员： 降钙素受体刺激肽（Calcitonin receptor stimulating peptide，CRSP）；CRSP的生物学特性提示它不是通过CGRP相似的途径发挥其生物学效应，很可能是通过降钙素受体途径发挥作用[30]。 CGRP与CT同源，两者来自同1个单拷贝基因，定位于第11号染色体上（11P 15.4），由2800个碱基对组成，其中含有6个外显子和5个内含子，基因全长7.6kb。该基因转录后经过不同的剪接产生CGRPmRNA和CTmRNA。由CT转录的RNA，最先在神经组织翻录成128个氨基酸组成的CGRP而发挥其生物效应。人和鼠的CGRP均含有α和β两种基因，分别表达两种分子异构肽，两者具有相近的生物活性，，但其氨基酸组成仅在第3、22和25位有所不同。 CGRP阳性纤维在研究中发现在消化道、心血管和内分泌等系统中也可见到。并且有研究应用免疫组化观察到含有CGRP样免疫反应性的神经细胞和纤维几乎见于神经中枢的各部[31]，尤其是感觉神经元的胞体和传入神经纤维的末梢。CGRP高度多样的生物活性是通过G蛋白藕联受体的调节。在体内的CGRP是通过与其受体结合而发挥其生物活性。目前认为CGRP受体在体内具有以下1些亚型：①CGRP1A受体：对CGRP 8-37敏感，对鼠CGRPα和人CGRPα的亲和力相等。②CGRP1B受体：对CGRP 8-37敏感，对鼠CGRPα比人CGRPα的亲和力大10倍。③CGRP2受体：对[cys(ACM)2，7 ]敏感。④CGRP3受体：对CGRP与CT的亲和力相同。⑤对人CGRPβ敏感的受体亚型：在兔子皮肤上，CGRP 8—37对抗人CGRPβ的舒张血管效应比对抗人CGRP&alph [1]