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金针菇多糖提取修 金针菇多糖的制备以及性质鉴定 目的要求: 1. 学习真菌多糖类的分离纯化原理。 2. 掌握多糖类物质的一般鉴定方法。 实验原理: 多糖又称为多聚糖，是由单糖以大于10的聚合度而成的极性复杂的大分 之一。金针菇是自然界分布极为广泛的一种子，是构成生命活动的4大基础物质 真菌，是著名的食药两用菌，其中含有丰富的多糖类物质，具有明显提高机体免疫功能、抗炎症和抗放射等作用。 目前真菌多糖的提取技术有:水提醇沉法、碱提取法，酸提取法，微波提取法、酶提取法和超声波法等。水提法包括热水浸提法(适用于水溶性多糖)，稀酸水提法(适用于酸溶性多糖)及稀碱水提法(适用于碱溶性多糖)。 粗多糖的纯化一般包括除蛋白(如Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法和酶解法)，脱色素(离子交换法、活性炭吸附法)及其他杂质的去除(超滤、层析法、半透膜逆向流水透析法)。 对于多糖的一级结构鉴定，已经建立分析的分析的方法有化学法(如酸水解、甲基化、碱降解等)、物理法(高效液相色谱法、气相色谱法、质谱分析法等)和生物法(免疫学法和酶化学法) 苯酚硫酸法测定总糖，苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm处(戊糖及糖醛酸在480nm)有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。 实验材料 A试剂 (1) 金针菇子实体:200g (2) 无水乙醇 (3) 氯仿 (4) 展层液:正丁醇:丙酮:水(4:3:1) (5) 显色剂:苯胺-邻苯二甲酸 (6) 丙酮 (7) 多糖品 (8) 硫酸蒽酮 (9) DEAE52 B器材 (1) 烧杯 (2) 电炉 (3) 分液漏斗 (4) 量筒 (5) 离心机 (6) 层析缸 (7) 薄层板 (8) 喷瓶 实验方法 1. 粗多糖提取 准确称取200g干燥金针菇子实体破碎后和1000ml水加入烧杯中，于沸水浴中加热搅拌1小时，过程中不需补水。 离心去除不溶物，上清液在搅拌下缓缓加入无水乙醇，至终浓度达到40%，4?冰箱静置30min，3000rpm离心10分钟收集沉淀;上清液中继续加入无水乙醇至终浓度为60%，4?冰箱静置30min，3000rpm离心10分钟收集第二组沉淀。 将两组组沉淀置于通风柜中，将乙醇挥发干净，分别用少量蒸馏水溶解沉淀，加入1/4的氯仿正丁醇(4:1)溶液，分液漏斗振摇15min，过程中注意放气，离心收集上清。 两组上清分别加入三倍预冷的无水乙醇，3000rpm离心10分钟收集沉淀。将第一组沉淀真空干燥保存，第二组沉淀置于通风柜中，将乙醇挥发干净后用少量蒸馏水溶解进行下一步纯化。 2.多糖纯化，柱层析 取去离子水预溶胀的10gDEAE52粉末，将层析柱清洗干净垂直固定到层析 架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中的介质轻轻倒入层析柱中，介质自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱。 将第二组多糖样品上样，待样品液面与层析柱面相切时，加入200ml去离子水洗脱，5ml/管收集洗脱液，硫酸蒽酮法显色测定每管的吸光值，绘制洗脱曲线。 合并各收集管样品，加入三倍体积乙醇，离心收集沉淀，真空干燥。 3.介质再生 从层析柱中将离子交换剂倒入烧杯中，添加500ml 0.5M NaOH轻轻搅动，浸泡30min。滤出上清液，用水洗至pH 8.0。再加入500ml 0.5M HCl轻轻搅动，放置30min，滤出上清液，用水洗至pH 4.0。再次向烧杯中添加500ml 0.5M NaOH轻轻搅动，浸泡30min，滤出上清液，用水洗至pH8.0。去离子水冲洗，砂心漏斗抽滤。用20%酒精溶液保存。 4.多糖总糖测定 用蒸馏水溶解适量样品。 取6支洁净试管，编号，按下表配制加入试剂(单位ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 标准葡 萄糖 0.5 0.5 样品 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.5 0.5 水 4 4 4 4 4 4 4 4 硫酸蒽 酮 沸水浴10分钟，冷却至室温，测定620nm处吸光值，以横坐标为葡萄糖含量，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线，通过标准曲线方程计算多糖含量。 样品多糖提取率(%)=样品总糖含量*多糖溶液体积/样品重量*100% 5.样品蛋白含量测定:BCA试剂盒测定多糖产品蛋白含量，方法见试剂盒说明书。 6.多糖薄层层析 混合单糖标准液制备:精密称取葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸各20mg，分别溶于1ml蒸馏水中，从中各吸取0.2ml混合均匀。 称取金针菇多糖10mg溶于2mol/L三氟乙酸2ml，置密封管中于沸水浴中水解3小时，将水解液置于烘箱中烘干抽真空，以去除三氟乙酸，然后用甲醇洗涤，用蒸馏水溶解。在制备好的板上，距离底边1.5cm的直线上选4个点，相互距离2cm，以毛细管点样，样量控制在5-50ug，斑点直径不超过2mm，可分次加样，待样品干燥后(电吹风吹干或自然干燥)，置于层析缸中展层(层析缸最好提前30min用滤纸饱和展层液)。千万勿使点样斑点浸入展层剂中。待展层剂到达距离薄板顶端约1cm时取出，前沿做一记号，60度烘箱烘干30min或电吹风吹干。均匀喷上显色剂，85?烘10分钟，记录各斑点位置，颜色。 思考题 1.多糖类物质按其来源和组分可以分别分为几种,不同材料来源的多糖提取方法是否相同, 2.热水提取多糖是否会破坏多糖结构,