人用H5N1禽流感疫苗毒种检定及毒种库建立

人用H5N1禽流感疫苗毒种检定及毒种库建立 作者：朱智勇，丁晓航，朱函坪，李岩金，陈学奎，沈吉友，张涛，何培江，姚苹苹，徐芳，翁景清，龚华岳，郭志军，苏波，孙淑滨，粱伟峰 【关键词】  禽流感疫苗;毒种;检定;毒种库 　　摘要： 目的   为了研制人用H5N1禽流感疫苗,按照《中国典》三部 “生物制品生产和检定用菌毒种规程” 中的要求,建立用于生产禽流感疫苗的毒种库。方法   从国外引进2株H5N1禽流感疫苗的毒种 (R1194和R1203), 进行全面检定,建立三级种子库，即原代、主代和工作代，用于疫苗生产。结果   引进的R1194和R1203  2个毒株能在胚蛋中大量增殖并稳定传代；与普通流感A1，A3，B作交叉血凝抑制试验和交叉单向免疫扩散试验明,符合H5N1禽流感病毒的特征；经对血凝素序列测定，证实了引进的2毒株为H5N1禽流感病毒；测得的序列与原始株序列比较可知,2毒株均已去除有毒基因,属弱毒株；确定2毒株的P2为原代，P4为主代，P5为工作代。结论   引进的R1194和R1203毒种为H5N1禽流感减毒株,可用于禽流感疫苗的生产。 　　关键词： 禽流感疫苗;毒种;检定;毒种库 　　Study on avian influenza (H5N1) vaccine used in human body and establishment of virus seed bank   　　Abstract： Objective   To develop avian influenza (H5N1) vaccines used in human body.To establish the virus seed bank used to produce avian influenza vaccines according to “Requirements for Bacterial and Viral StrainsSeeds Used for Production and Quality Control of Biologics” from the book called PHARMACOPOEIA OF THE PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA Volume III.Methods   To importe from abroad and checked up entirely the twovirus seeds of R1194 and R1203 for the avian influenza vaccine production.To establish three virus seed lot systems (seed bank) i.e.the primary seed lot, master seed lot and working seed lot.Results   The two seeds of avian influenza vaccines can be multiplied greatly and passaged steadily in egg embryos; The cross hemagglutinininhibiting test and immunodiffusion test with the antigen and antibody of human influenza A1, A3 and B and avian influenza H5N1 indicated that the above two seeds had the character of avian influenza H5N1. The complete HA genes, that were sequenced, approved that the seeds were avian influenza H5N1 viruses.The virulence genes were deleted and the two seeds belonged to feebleness virulence strain by sequence compared with wild types. The two seeds, which were passed 2，4 and 5 times in egg embryos respectively, were confirmed as the primary seed lot, master seed lot and working seed lot.Conclusion   The twovirus strain R1194 and R1203 imported from abroad can be used to produce the avian influenza vaccines. 　　Key words： avian influenza vaccine;virus seed;check up;virus seed bank       　　自2003年12月～2006年10月16日，世界各地共发生由禽传人的H5N1禽流感病例256人，死亡151人，病死率高达59 %〔1〕。由于流感病毒极易变异，一旦获得在人间的能力，数亿人的生命将受到威胁，其潜在危害性远超过严重急性呼吸道综合征(SARS)，已引起WHO和世界各国政府的重视〔2〕，并把人用禽流感疫苗的研究提到重要位置〔3〕。2005年我们从国外引进2株H5N1亚型禽流感病毒，用于疫苗的研究，由于内容较多，现把研究结果分3部分：（1）疫苗毒种的检定及毒种库的建立；（2）疫苗检定；（3）疫苗免疫动物的效果观察。本文第一部分。 　　1   与方法 　　11   材料   （1）毒种: NIBRG-14株(简称R1194)(英国国家生物制品检定所)。该毒株是1194株(A/Viet Nam/1194/2004 H5N1)和PR8株（H1N1）2病毒,通过反相遗传的方法改造而成；VNH5N1-PR8/CDC-RG株(简称R1203)(美国疾病控制中心)，该毒株是用1203株(A/VietNam/1203/2004H5N1)和PR8株（H1N1）病毒,通过反相遗传的方法改造而成。2种病毒均在胚蛋中传二代（P2）。（2）血清:禽流感病毒H5血凝素及抗血清(英国国家生物制品检定所);A1、A3、B型人流感病毒血凝素及抗血清(英国国家生物制品检定所);R1203抗血清(本实验室用R1203疫苗免疫家兔获得)。（3）无致病菌(SPF)鸡蛋(北京实验动物中心SPF鸡群)。 　　12   方法   （1）血凝抑制试验和单向免疫扩散试验:按常规法。（2）病毒滴度测定:按常规鸡胚感染法，每稀释度接种4只胚蛋。（3）无菌试验和外源因子检查:按现行版《中国药典》的要求测定〔4〕。（4）毒种免疫源性测定:病毒经灭活、浓缩、纯化后，用不同剂量的血凝素经大腿肌肉接种20～25kg家兔4只，14d后加强1针,首针后28d采血,测定血凝抑制抗体和中种抗体。（5）血凝素序列测定:根据H5的核酸序列,一对特异性引物，经RT-PCR扩增H5基因,通过T-A克隆,将其插入载体,转导大肠埃希菌,筛选阳克隆,提取质粒,由上海生物工程研究所进行测序。（6）R1194和R1203的原始株序列:来源于美国国家生物信息中心基因库(NCBI GenBank)〔5，6〕。（7）显微镜图片:由浙江科学院电镜室协助拍摄。 　　2   结果 　　21   病毒滴度测定   毒种接种胚蛋20只，经培养后，将血凝阳性的尿囊液混合测得的血凝滴度和病毒滴度见表1。       　　从表1可见，2个毒种适应在胚蛋中增殖，均有较高的血凝滴度和病毒滴度，并能稳定传代。 　　22   血凝抑制试验   用R1194，R1203，A1，A3，B型的抗原与它们的抗血清作交叉血凝抑制试验，见表2。 　　表1   传代的病毒滴度（略） 　　注：P4～P10为传代代次；*为50%鸡胚感染剂量EID50/ml 　　表2   各型流感病毒交叉血凝抑制试验(倒数)（略） 　　注：A1为甲型流感病毒H1N1;A3为甲型流感病毒H3N2;B为乙型流感病毒;A5为禽流感病毒R1194       　　从表2可见，抗血清对同型的抗原有较高的血凝抑制滴度，对其他型别也有一定的交叉，交叉滴度大都在1∶40。 　　23   单向免疫扩散试验   用R1194，R1203，A1，A3，B型流感病毒的抗原(含量约60μg HA/ml左右)与它们的抗血清作交叉单扩试验结果见表3。 　　表3   各型流感病毒交叉单向免疫扩散试验（略） 　　从表3可见，各型抗血清仅对同型抗原起反应，对其他型别无交叉。 　　24   2毒株H5血凝素(HA)序列测定与原始株的比较 　　241   R1194（P5）HA测得的核苷酸序列(图1) 　　图1   R1194（P5）HA核苷酸序列（略） 　　242   R1194株与原始毒株不同核苷酸序列部位(图2)   从图可知:R1194株（P5）的核苷酸序列与原始毒株比较,去了1022～1033的12个碱基(4个氨基酸),在1015，1034和1036位置上的A由C取代。 　　图2   R1194株与原始毒株不同核苷酸序列（略） 　　243   R1194株与原始毒株不同氨基酸序列部位(图3)   从图3可知，R1194株（P5）的氨基酸序列与原始毒株比较,去了RRRK 4个氨基酸,下一个K由T取代，现已知含有R-R-R-K-K-R氨基酸序列的禽流感毒株属高致病力毒株〔7〕。 　　244   R1203（P5）HA测得的核苷酸序列(图4) 　　图3   R1194株与原始毒株不同氨基酸序列（略） 　　图4   R1203（P5）HA核苷酸序列（略） 　　245   R1203株核苷酸序列与原始株比较后的不同部位(图5)   从图5可知，R1203株（P5）的核苷酸序列与原始毒株比较,与R1194（P5）株完全一样。 　　图5   R1203株与原始株不同核苷酸序列（略） 　　246   R1203株与原始毒株不同氨基酸序列部位(图6)   从图可知：R1203株