雷帕霉素抑制大鼠移植肝胆管上皮细胞增殖作用的研究

雷帕霉素抑制大鼠移植肝胆管上皮细胞增殖作用的研究 毕业           作者：陈莉萍 戴睿武 郭毅斌 王曙光 董家鸿' 【摘要】  目的 探讨雷帕霉素对大鼠移植肝胆管上皮细胞增殖及其周围成纤维细胞活化的抑制作用。方法 “2袖套法”建立大鼠原位肝移植模型，并随机分为供肝冷保存1 h组、12 h组、雷帕霉素组(冷保存12 h组术后给予雷帕霉素)、对照组。分别于术后1、3、7、14 d检测血清ALT、TB、ALP，免疫组化法检测各组胆管上皮细胞增殖率及肌纤维母细胞分布，并统计各组生存率。结果 冷保存12 h组术后生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017 4)，血清ALT>200 IU/L、ALP>160 IU/L、TB>3.6 μmol/L，持续高于冷保存1 h组(ALT<160 IU/L、ALP<200 IU/L、TB<3.6 μmol/L)，各时相点胆管上皮细胞增殖率(7%,27.8%,23.1%,17.8%)显著高于冷保存1 h组(2%,6%,2.6%,2.3%)和对照组(1.3%)。冷保存12 h组术后7、14 d可见胆管周围较多肌纤维母细胞聚集；雷帕霉素组术后2周生存率与冷保存12 h组接近(P=0.89)，胆管上皮细胞增殖率(5.9%,15.8%,13.6%,11.4%)明显降低，胆管周围肌纤维母细胞分布较少。结论 冷保存?再灌注直接损伤肝脏，诱导胆管上皮细胞增殖及肌纤维母细胞聚集，雷帕霉素明显抑制胆管上皮细胞增殖及肌纤维母细胞活化并对移植肝具有保护作用。 【关键词】  雷帕霉素； 肝移植； 冷保存； 再灌注； 胆管上皮细胞； 增殖        【Abstract】  Objective  To investigate the inhibitive effect of rapamycin on proliferation of biliary epithelial cells and activation of peribiliary fibroblast after rat liver transplantation. Methods  After rat liver transplantation model was made based on “two cuff” method, SD rats were randomly divided into cold preservation (CP)  for 1 hour group (CP 1 hour group), CP 12 hours group, rapamycin group (CP 12 hours group treated with rapamycin) and control group. Alanine aminotransferase (ALT), total bilirubin (TB) and alkaline phosphatase (ALP) were determined at days 1, 3, 7 and 14 after liver transplantation. Immunohistochemical method was used to detect proliferation rate of biliary epithelial cells and distribution of myofibroblasts, and survival rate of each group was also analyzed. Results  The survival rate in CP 12 hours group was significantly lower than that in CP 1 hour group (P=0.0174). In CP 12 hours group, serum ALT was >200 IU/L, ALP >160 IU/L and TB>3.6 μmol/L, which were significantly higher than those in CP 1 hour group respectively (ALT<160 IU/L, ALP<200 IU/L, TB<3.6 μmol/L).  At different time points, proliferation rates of biliary epithelial cells were 7%, 27.8%, 23.1% and 17.8% in CP 12 hours group, but were 2%, 6%, 2.6% and 2.3% in CP 1 hour group and 1.3% in control group, with statistical difference. Myofibroblasts were determined markedly surrounding the bile ducts at days 7 and 14 while survival rate significantly decreased in CP 12 hours group. In rapamycin group, proliferation rate of biliary epithelial cells was significantly decreased to 5.9%, 15.8%, 13.6% and 11.4%, with marked decrease of myofibroblasts accumulation surrounding the bile duct in comparison with CP 12 hours group, while survival rate showed no statistical difference compared with CP 12 hours group (P=0.89). Conclusions  CP and reperfusion directly bring about damage to the liver and subsequently induce proliferation of biliary epithelial cells and accumulation of peribiliary fibroblast. The proliferation of biliary epithelial cells and activation of peribiliary fibroblast can be inhibited by rapamycin that may exert protective effect on the liver.     【Key words】  Rapamycin;  Liver transplantation;  Cold preservation;  Reperfusion;  Biliary epithelial cells;  Proliferation    肝移植术后常见的胆道并发症为非吻合口狭窄，占所有胆道并发症的20%［1］，而冷保存?再灌注对胆管树的直接损伤是此类并发症重要的因素。作为肝移植过程中不可避免的病理生理过程，冷保存?再灌注直接损伤胆管上皮细胞，诱导正常情况下处于细胞周期静止状态的胆管上皮细胞发生增殖。这种对损伤做出的修复过程极有可能并发其他胆道疾病［2］。因此研究影响胆管上皮细胞增殖的因素对于临床防治胆道疾病具有重要意义。本研究是在大鼠原位肝移植模型基础上，探讨雷帕霉素对肝移植术后胆管上皮细胞增殖及其周围肌纤维母细胞聚集的影响，旨在为临床防治移植肝胆道并发症提供新的策略。     1  材料与方法     1.1  主要试剂与仪器     兔抗增殖细胞核抗原多克隆抗体、鼠抗p?STAT3?tyr705单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒为丹麦Dako公司产品；RPM为美国惠氏百宫制药公司惠赠。     1.2  动物模型与分组     清洁级SD大鼠，体重220～250 g，雄性，由第3军医大学大坪医院动物中心提供。按随机数字法分为4组：(1)对照组；(2)冷保存1 h组：供肝冷保存1 h后行原位肝移植；(3)冷保存12 h组：供肝冷保存12 h后行原位肝移植；(4)雷帕霉素组：冷保存12 h组给予静注雷帕霉素2 mg/(kg·d)。大鼠原位肝移植模型制作参照刘骅等［3］的“2袖套法”原位肝移植模型并加以改良，显微外科缝合肝上下腔静脉、套接门静脉及肝下下腔静脉。利用小儿静脉留置针内蕊作为动脉支架管，直接对合供受体肝固有动脉，完成肝动脉重建。无肝期约13 min。分别于术后1、3、7、14 d取材，每组样本各8只。     1.3  各组术后生存分析     观察冷保存1 h组、 12 h组、 雷帕霉素组术后14 d存活情况，绘制生存曲线并比较各组生存率的差异。     1.4  肝功能指标检测     测定冷保存1 h组、12 h组、雷帕霉素组ALT、ALP、TB。     1.5  兔抗增殖细胞核抗原、α?平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测     肝组织常规固定、包埋、切片。采用兔抗增殖细胞核抗原作为细胞增殖期G1?S期的评价指标，α?平滑肌肌动蛋白作为肌纤维母细胞。按Chem?MateTM Envision免疫组化试剂盒说明书操作。显微镜下观察α?平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞的胞质呈棕色，增殖细胞的胞核呈棕色。计算7个高倍镜(×400)视野内，每100个胆管细胞中增殖的胆管上皮细胞所占比例的均值作为该样本的胆管上皮细胞增殖率［4］。     1.6  统计学分析     计量资料以±s表示，所有数据应用SPSS 10.0软件进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，采用Kaplan?Meier法绘制生存曲线，Log?rank法检验各组生存率之间的差异。     2  结果     2.1  各组术后生存分析     冷保存12 h组生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017 4)，而与雷帕霉素组水平接近(P=0.89，图1)。两组大鼠死亡的主要原因为移植肝肝功能不全，表现为肝脏淤血或伴有局灶性坏死，腹水、黄疸，肝功能酶谱升高，部分死亡大鼠胆管内可见褐色胆泥形成。     图1  各组肝移植术后生存曲线     2.2  各组肝功能检测     冷保存1 h组术后7 d内，肝功能各项指标趋于正常。冷保存12 h组血清ALT、ALP水平明显高于冷保存1 h组同时相点水平，术后14 d达到峰值；血清TB水平呈上升趋势，术后3 d显著高于冷保存1 h组；雷帕霉素组各项指标均明显低于冷保存12 h组同时相点水平(表1～3)。表1  血清ALT水平的检测表2  血清ALP水平的检测表3  血清TB水平的检测     2.3  各组胆管上皮细胞增殖     对照组、冷保存1 h组胆管上皮细胞增殖较少，冷保存12 h组胆管上皮细胞增殖率明显高于其他各组同时相点水平，术后3 d达到峰值，其中大胆管内壁胆管上皮细胞增殖较为明显；雷帕霉素组胆管上皮细胞增殖率明显低于冷保存12 h组(表4，图2)。表4  胆管上皮细胞增殖率的检测     2.4  胆管周围肌纤维母细胞分布     对照组、冷保存1 h组、12 h组术后1 d，肌纤维母细胞主要见于血管壁。冷保存12 h组术后3 d，胆管周围环绕少量肌纤维母细胞，至7、14 d明显增加；雷帕霉素组术后各时相点，胆管周围肌纤维母细胞分布明显少于冷保存12 h组(图3)。     A：冷保存1 h组术后3 d，偶见增殖胆管上皮细胞；B：冷保存12 h组术后3 d，较多胆管上皮细胞增殖；C：冷保存12 h组术后14 d仍可见胆管上皮细胞增殖；D：雷帕霉素组术后3 d，胆管上皮细胞增殖较少     图2  肝移植术后胆管上皮细胞增殖(红色箭头所示为增殖细胞)  (2氨基联苯胺染色  ×400)     A：对照组肌纤维母细胞主要分布于血管壁；B：冷保存12 h组术后3 d，胆管周围少量肌纤维母细胞环绕；C：冷保存12 h组术后14 d，较多肌纤维母细胞环绕于胆管周围；D：雷帕霉素组术后14 d，胆管周围肌纤维母细胞较少出现     图3  肝移植术后肌纤维母细胞分布(红色箭头所示为肌纤维母细胞)  (2氨基联苯胺染色  ×400)     3  讨论     作为与肝移植术后胆道并发症密切相关的病理生理过程，冷保存?再灌注直接损伤肝细胞和胆管上皮细胞。胆管上皮细胞是1族高氧耗、高代谢、低缺氧耐受的娇贵细胞群体，较肝细胞更易在缺血?再灌注时受到氧自由基的损伤［5］。我们的研究发现，冷保存12 h组术后各时相点，反应胆道损伤的酶谱ALP、TB明显升高，表明严重的冷保存?再灌注明显损伤胆管上皮细胞。出于对损伤修复的需要，以细胞增殖为特征的再生?修复过程被启动，在本研究中则表现为该组胆管上皮细胞的明显增殖。     残存的胆管上皮细胞在对损伤做出再生修复时，虽然最终能恢复到近似原先的细胞形态，但在该过程中极有可能经历DNA损伤或基因序列改变，具有和正常细胞不同的功能，分泌多种与器官纤维化密切相关的细胞因子如TGF?β等，促进胆管周围成纤维细胞活化转化为肌纤维母细胞，而后者的持续出现是器官纤维化过程的关键［6］。同时，大量而活跃的细胞分裂需要消耗较多的能量，就有可能削弱肝内非新生细胞正常的能量代谢过程［7］。这对移植物的长期存活及功能是不利的。我们观察到伴随着明显的胆管上皮细胞增殖，较多肌纤维母细胞环绕于冷保存12 h组胆管周围。这表明严重冷保存?再灌注诱导的胆管上皮细胞增殖可能是促进肌纤维母细胞聚集的重要因素。由于胆管上皮细胞和胆管周围肌纤维母细胞之间维持着非常精妙的平衡，冷保存?再灌注对胆管上皮细胞的严重损伤触发肌纤维母细胞的大量活化，导致胆管壁创面收缩，增加了胆管壁及其周围组织纤维化和胆管狭窄形成的风险，在肝外胆管或肝内大胆管常表现为管腔狭窄，在小胆管则可能出现管腔阻塞［8］。我们还观察到大胆管尤其肝门附近大胆管内壁的胆管上皮细胞增殖最为活跃，该区结缔组织丰富，内含大量成纤维细胞，极易受到胆管上皮细胞增殖的影响而活化为肌纤维母细胞。这也许正是临床观察到的肝门附近大胆管成为移植肝胆道狭窄易患部位的原因之1，也是影响移植物功能与存活的重要因素。     作为1种新型免疫抑制剂，体外和体内实验均证实雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖，其有效抑制浓度远低于临床肝移植术后患者应用雷帕霉素作为免疫抑制剂时的血药浓度［9］。我们的研究也发现，雷帕霉素明显抑制由冷保存?再灌注损伤诱导的胆管上皮细胞增殖，并减少胆管周围肌纤维母细胞的聚集。雷帕霉素是信号转导及转录激活因子?3活化的特异性抑制剂，因而部分阻断转录激活因子?3介导的信号通路，从而调控细胞周期进展，影响细胞增殖与分化［10］，这可能是其抑制胆管上皮细胞增殖的分子机制之1。同时我们还观察到，雷帕霉素虽然明显抑制肝移植术后胆管上皮细胞的增殖，但并未降低术后14 d内生存率，进1步提示以胆管上皮细胞增殖为靶点的雷帕霉素极可能成为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆管狭窄等并发症的有力武器，将会更广泛地应用于肝移植领域。   【】   ［1］ Guichelaar MM, Benson JT, Malinchoc M, et al. Risk factors for and clinical course of non?anastomotic biliary strictures after liver transplantation. Am J Transplant,2003,3(7):885-890. ［2］ Ramadori G, Saile B. Portal tract fibrogenesis in the liver. Lab Invest,2004,84(2):153-159. ［3］ 刘骅，曹晖，吴志勇.改良2袖套法大鼠原位肝移植180例.消化外科,2006,5(1):52-56. ［4］ Alvaro D, Alpini G, Onori P, [1]