论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响

论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响 　  [论文关键词]干细胞；组织培养；视网膜神经节细胞；细胞分化； 　　[论文摘要]　目的　探讨大鼠视神经离断对神经干细胞一上丘组织共培养诱导分化的影响。采用机械分离，无血清选择培养的方法从孕14d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并进行传代培养。使用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定。采用显微手术的方法建立大鼠视神经离断模型，分别取正常大鼠、假手术和视神经离断大鼠的上丘组织进行体外培养。使用组织一细胞共培养系统将大鼠上丘组织与神经干细胞共培养，观察干细胞分化过程，对分化细胞进行鉴定，并与干细胞的自然分化过程进行比较。结果从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长，可形成单细胞克隆，具有多向分化能力，经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞。视神经离断大鼠的上丘组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养可以促进神经干细胞的分化，并诱导分化出Thyl.1阳性的视网膜神经节细胞。结论从胚胎大鼠上丘可以分离培养出神经干细胞，与视神经离断大鼠的上丘组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化为视网膜神经节细胞。  　　1材料与方法  　　1.1主要材料和试剂  　　孕14d和3个月龄SD大鼠均由复旦大学医学院实验动物中心提供。高糖DMEM／F12、Neurobasa1、N2、B27购自美国Gibeo公司；EGF、b-FGF购自美国R&D公司；小鼠抗Nestin单克隆抗体、小鼠抗Thyl.1单克隆抗体购自美国Chemieon公司；兔抗GFAP购自武汉博士德公司；兔抗MAP-2单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。  　　1.2动物分组与视神经离断模型  　　取3个月龄sD大鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组：正常对照组、假手术组和视神经离断组，每组动物均为10只。视神经离断组大鼠随机选择一侧眼，在手术显微镜下钝性分离显露视神经；在离后极约2 mm处剪断视神经。术后于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验。假手术组动物外科操作同视神经离断组，但不离断视神经。正常对照组则不做任何处理。  　　1.3胚胎上丘NSCS的分离与培养  　　取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕龄的计算方法为：将雌雄大鼠合笼后，次晨检查发现阴栓者为孕0天。按照大鼠脑解剖图谱细心分离出上丘组织。胚胎上丘NSCS的分离与原代培养程序参见冯东福等已建立的方法。  　　1.4单细胞克隆及鉴定  　　将第2代的神经干细胞球，吹打成单细胞悬液。使用连续稀释法，最终细胞密度为100／ml。参照Reynolds和Weiss的方法，建立单细胞克隆。  　　使用细胞免疫荧光法对传4代的细胞克隆进行鉴定，一抗为小鼠抗Nestin单克隆抗体(1:100)，二抗为羊抗小鼠IgG Cy3(1:10)。使用TCS-SP2型激光共聚焦显微镜对荧光标记后的细胞克隆球进行观察，并进行计算机三维图像重建，激发波长为543mm。具体方法见冯东福等的报道。  　　1.5上丘组织培养