浅谈Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析

浅谈Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析　　【关键词】洛伐他汀合成酶合成酶　　摘要:目的分析Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的结构。方法用3对以土曲霉洛伐他汀合成酶基因为基础的PCR引物对红曲霉基因组进行了PCR分析，其中一对引物序列为，正向：5’TTCGATGCGGCCTTCTTCAAT3’和反向5’ATGGTTCGGCATCGTAATTCC3’。结果在红曲霉基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的LNKS区域扩增出了745bp的核酸片段，其序列与土曲霉合成酶的这一区域序列相同。结论土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。　　关键词:红曲霉平;土曲霉;洛伐他汀合成酶合成酶;PCR　　Abstract:ObjectiveAnalysesthestructureofMonascusruber5031lovastatinbiosynthesisgenecluster.MethodsThreepairsofdegeneratePCRprimersweredesignedmatchingtheregionsoflovastatinbiosynthesisgeneclusterinAspergillusterreus,oneofthemis,5’primer:TTCGATGCGGCCTTCTTCAAT,3’primer:ATGGTTCGGCATCGTAATTCC.ResultsA745bpDNAsequencewasamplifiedbyPCRfromMonascusruber5031genomicDNAandthesequenceisthesamewithAspergillusterreuslovastatinbiosynthesisgene.ConclusionThereissimilarsequencewithinthelovastatinbiosynthesisgeneclusterofAspergillusterreusandMonascusRuber.　　Keywords:Monascusruber;Aspergillusterreus;lovastatinbiosynthesisgenecluster;PCR　　红曲霉(Monascusruber)中产生的莫那可林K(monacolinK)即洛伐他汀(lovastatin)，是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一，并且对心绞痛患者和心肌梗死患者也有一定的治疗效果[1]。此外，它还可下调炎症相关转录因子的表达,从而有益于治疗动脉粥样硬化症[2]。近期研究表明,它可促进恶性甲状腺细胞凋亡[3]，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能[4]。　　对参与洛伐他汀生物合成的聚酮合成酶的研究主要在土曲霉中进行[5-7]，土曲霉也是目前工业化生产洛伐他汀的主要菌种。Reeves和Vederas等研究了土曲霉(Aspergillusterreus)洛伐他汀的PKS基因结构，序列分析发现在克隆的64kbDNA中有18个开放读框(ORF)，经序列对比分析确定了13个ORF的功能。其基因簇可分为洛伐他汀结构中九酮部分的合成酶基因(即LNKS)和二酮部分的合成酶基因(即LDKS)，LNKS也称为lovB，而LDKS含有的功能域有：lovC(酯酰还原酶)、lovD(转脂酶)、ORF8(HMGCoA还原酶)、lovE(调节蛋白)、lovF(聚酮合成酶)、ORF13(调节蛋白)及细胞色素P450加单氧酶等。　　红曲霉中与合成洛伐他汀相关基因的结构的研究则较少，Chen等[8]于2005年8月发往Genebank的丛毛红曲霉的莫那可林K合成酶基因簇是第一个被发现的红曲霉合成洛伐他汀相关酶的基因簇。由于红曲霉中可产生洛伐他汀及多种有生理活性的物质，它又是传统的食品添加剂，所以通过分析研究红曲霉中洛伐他汀合成相关基因将有利于更好地开发利用红曲霉。本文分别以土曲霉的LNKS基因的KS区域(位于lovB基因区域内)、土曲LDKS基因簇中的lovC(酯酰还原酶功能域)及lovE(调控蛋白功能域)基因为靶标设计了3对PCR引物，以这3组引物对产洛伐他汀的红色红曲霉菌的基因组DNA进行了PCR分析。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1菌株和培养基　　红曲菌种：中国工业微生物菌种保藏中心红色红曲霉Monascusruber5031。　　斜面培养基：取50g大米，洗净加水800mL，煮成稀粥，冷却到60~65℃。将150g麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀，放入55~60℃保温箱内糖化4h，取出过滤。取250mL加250mL水，加2%的琼脂，装瓶、灭菌。　　菌丝生长培养基：以上培养基不加琼脂。　　1.1.2仪器与试剂　　日立高速冷冻离心机。MonacolinK标准品，购自Sigma公司。PCR引物由上海生工合成。Taq酶采用上海生工的TaqPlus。上海生工的胶回收试剂盒UNIQ-10。TaKaRa公司的pMD-18T克隆载体。　　1.2方法　　1.2.1培养方法　　用2mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。　　固体斜面培养7d后，以5mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2mL加入100mL菌丝生长培养基，培养温度28℃，转速150r/min。培养4d。　　1.2.2红曲基因组DNA的提取　　根据文献[9]的方法改进而成。取1g菌丝，液氮中磨成粉状，加入5mL2×CTAB缓冲液[100mmol/LtrisCl(pH8.0),20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl,2%(ρ)CTAB,2%(ρ)β巯基乙醇]，58℃1h，冷至室温后加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提，10000g离心10min，取上清，加入0.1倍体积10%CTAB0.7mol/LNaCl溶液，温和摇动，再加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提，10000g离心10min，取上清，加入2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA，1000g离心15min，沉淀溶于100μLTE中，加入RnaseA至终质量浓度100μg/mL，37℃作用2h，加入等体积酚氯仿(1∶1)抽提，10000g离心10min，上清中加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗1遍，风干，溶于TE，4℃保存。　　1.2.3PCR引物的设计　　3对PCR引物的设计详见表1。表1PCR引物的设计(略)　　第1组引物是参照Thomas等[10]针对土曲霉的lovB基因的KS功能域序列设计的引物设计的。　　1.2.4PCR反应　　①反应体系：200μmol/LdNTPs,1UTaq酶，2.625mmol/LMgCl2,2μmol/LMgSO4,10mmol/LKCl,10mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LTrisHCl(pH8.75),0.1%Tritonx100,0.1mg/mLBSA,模板40ng(基因组DNA和cDNA),引物60ng，总反应体积20μL。②热循环条件：94℃预变性5min，之后以94℃1min，50℃1min，72℃2min程序45个循环，延伸72℃10min。　　1.2.5lovB扩增片段的克隆与测序　　回收及克隆红曲的lovB引物扩增产物中约750bp的片段，其中连接反应液成分为pMD18T载体1μL，PCR产物4.5μL，含T4连接酶和连接酶缓冲液的solutionⅠ5μL，在16℃连接2h。大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆的片段交由TaRaKa公司完成测序。