人角膜上皮细胞系的建立及其特性的研究

人角膜上皮细胞系的建立及其特性的研究 毕业 全部作者： 王智崇 刘敬波 葛坚 宋革 黄冰 高楠 马萍 第1作者单位： 中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室 摘要： 目的 通过体外连续传代培养，建立具有正常生物学特性和功能的人角膜缘上皮细胞系，为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 采用组织块法进行细胞纯化和扩增，建立角膜缘上皮细胞系。①观察细胞在建系过程中的特征性形态变化；②通过MTT法绘制细胞生长曲线，通过流式细胞技术进行细胞DNA倍体分析及周期检测，有限稀释法检测细胞的克隆形成能力；③通过免疫组织化学、Western blot等方法检测建系细胞蛋白达：包括转录因子P63，角质蛋白CK3、CK19，CK14, 波形蛋白Vimentin, 微丝蛋白(F-actin)，微管蛋白(β-tubilin)，细胞增殖细胞核抗原（PCNA），β1-integrin；④对细胞进行染色体分析，观察细胞在传代过程中核型的变化；⑤通过皮下注射建系细胞到裸鼠颈背部皮下的方法，检测细胞的致瘤性；⑥将细胞接种在Transwell培养皿中进行气液界面培养，观察建系细胞体外复层形成能力。结果：SDHCEC1细胞系在体外已经传代超过50代，细胞保持圆形、椭圆形，表面有丰富的微绒毛。细胞倍增时间为19.6小时，第1、10、20、30、50代细胞的克隆形成率分别为6.87%、3.47%、6.33%、5.08%、6.52%，早代细胞(<10代)形成的克隆小而紧密，后代的克隆则比较松散。细胞浆内可见大量的粗面内质网，核糖体，微丝，微管，细胞合成、分泌旺盛，核/质比变小；随着细胞传代次数增加，S期细胞的比例分别为23.2%、7.5%、6.1%、17.5%、11.4%、7.7%；P5代细胞已无转录因子P63的表达，建系细胞表达CK3、CK19、CK14、波形蛋白（Vimentin）、微丝蛋白(F-actin)，微管蛋白(β-tubilin)，细胞增殖细胞核抗原（PCNA），β1-integrin等。核型分析结果表明，细胞在传代过程中逐渐变成多倍体，异倍体；裸鼠皮下细胞接种80后未见有肿瘤生长；采用气液界面培养建系细胞2周，细胞可以形成3-4层复层角膜上皮。结论 我们采用非基因转染的方法，在体外成功建立了人角膜缘上皮细胞系，并保持了细胞的高增殖活性和分化潜能，为角膜上皮细胞增殖和分化的基因调控，细胞外基质的合成，生长因子的作用，药物的开发和毒性检测，角膜病发病机制等方面的研究提供方便的细胞来源，也可为构建组织工程化生物角膜提供种子细胞 关键词： 角膜、角膜缘，角膜上皮细胞、细胞系、组织工程 远程下载 (免费PDF全文) 发表日期： 2006年11月14日 同行评议： （暂时没有） 综合： （暂时没有） 修改稿：