结核分枝杆菌

分枝杆菌属（mycobacterium）试讲人：陈洁概述一.主要特点形态上：细长弯曲，分枝状生长结构上：细胞壁富含脂质（分枝菌酸）染色上：呈抗酸染色阳性致病性上：引起疾病都呈慢性，并伴肉芽肿抗酸染色由于细菌细胞壁中含大量脂质，一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后又能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fastbacilli)抗酸染色法(acid-faststain)：以5％石炭酸复红加温染色，再用3％盐酸酒精脱色，然后用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色(+)，其他细菌和背景物质为蓝色(-)。二、分类根据国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）的将本菌分为三类：缓慢生长菌迅速生长菌不能培养菌结核分枝杆菌一、分类结核分枝杆菌（Mycobacterium　Tuberculosis，TB）复合群：人结核分枝杆菌(M.tuberculosis)牛分枝杆菌(M.bovis)非洲分枝杆菌田鼠分枝杆菌1.形态结构无鞭毛无芽孢有荚膜齐尼（Ziehl-neelsen)抗酸染色呈红色荧光金胺O染色呈橘黄色L型细菌呈非抗酸性G＋性颗粒（Much颗粒）一、生物学特性（二）菌体成分1脂质：磷脂脂肪酸蜡质蜡质D索状因子分枝菌酸2蛋白质：结核菌素3多糖免疫佐剂：胞壁酰二肽3变异性形态及菌落变异：结核杆菌的L型：颗粒状、丝状（Much颗粒）抗酸（+）（-）菌落RS毒力变异：如卡介苗BCG：是Calmette和Guérin将牛分枝杆菌经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株耐药性变异：多重耐药结核病（MDRTB）菜花样菌落4.培养特性　　专性需氧菌，对营养要求严格丑--典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。　懒--生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5w才出现肉眼可见的菌落。　挑--营养要求较高，必须在含血清、卵黄等物质的特殊培养基（罗氏）上才能生长良好。　液体培养基---生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可呈索状生长（吐温干扰）。　5.生化反应：不活跃1．各型菌均不发酵糖类，产生H2O2酶。结核分枝杆菌触酶（+）、热触酶（-）非结核分枝杆菌两种均为（+）。2．人型结核分枝杆菌能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼。而牛型结核分枝杆菌不能。3．有毒株中性红试验阳性，无毒株则阴性，亦失去索状生长现象。二者鉴别的依据二者鉴别的依据有毒株和无毒株的区别6.抵抗力四怕乙醇湿热紫外线抗痨药物（链霉素、异烟肼、利福平等）四不怕干燥酸（3%HCl或6%H2SO4)或碱（4%NaOH)有抵抗力碱性染料青霉素等抗生素临床意义全球形势严峻WHO2009年全球结核病控制显示，全球现有结核病患者1370万，每年发病人数为927万，每年死亡人数177万。结核病仍为单一病原菌引起疾病死因的第一位。目前全球有1/3人口即17亿人感染了结核病,每1秒钟就有1人受感染。发病人数占前五位的国家分别为印度、中国、印度尼西亚、尼日利亚、南非。（一）致病物质TB不产生内毒素、外毒素也不具有侵袭性酶致病物质主要是菌体成份二、致病性与免疫性致病物质荚膜与细胞表面受体结合（粘附与入侵作用）含多种酶（分解利用营养物质）保护（抑制溶酶体与吞噬体的融合）脂质索状因子（破坏线粒体膜--抑制细胞代谢抑制白细胞游走--引起肉芽肿）磷脂（形成结核结节，干酪样坏死）硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）蜡质D（引起迟发性过敏反应）蛋白质引起迟发性过敏反应（二）所致疾病传染源：病人传播途径：呼吸道、消化道、破损的皮肤粘膜等途径。——结核，尤其以肺结核多见。肺部感染原发感染：多见于儿童继发感染：多见于成人，慢性肉芽肿炎症肺外感染：脑、肾、肠结核，结核性腹膜炎等。免疫力低下：全身粟粒性结核免疫力正常：不治而愈，结核结节（三）免疫性1.带菌免疫（传染性免疫）:细菌在机体消失或死亡后，其免疫也终止。2.细胞免疫（主要作用）与体液免疫分离:细胞免疫随病情加重而减弱，体液免疫则相反。3.机体免疫与迟发性变态反应：不同T细胞介导。超敏反应何谓郭霍现象（Kochphenomenon）？将一定量结核分枝杆菌健康豚鼠第一次皮下注射局部发生坏死性溃疡，不易愈合10～14d附近淋巴结肿大细菌扩散全身已感染过的豚鼠第二次皮下注射局部发生溃疡，但较浅易愈合附近淋巴结不肿大细菌很少扩散迅速1～2d结核分枝杆菌核糖体RNA（rRNA）引起免疫反应结核菌素蛋白与蜡质D共同刺激产生迟发性超敏反应意义：因为在自然感染过程中，细胞免疫与迟发性超敏反应同时存在。因此通过测定机体对结核分枝杆菌有无超敏反应可判定对结核有无免疫力，常用结核菌素来测定。四、微生物学检验　　　　　　　　　　　　　临床标本　　涂片检查　　　　　　　分离培养　　　　　核酸检测　　抗体检测直接涂片　集菌涂片　　处理标本或无污染标本　　　染色　　　　液体培养基　　固体培养基　　　　　　　动物试验　　　　　　　　　　　　　　　（罗氏或米氏）抗酸..　金胺O..　　　　　　　　　37℃，　　　　　　　　涂片镜检　　　　　　　　　仪器培养　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜7天生长　　　＞7天生长　　　　　　　　　　　　　快速生长菌　　慢生长菌　　　　　　　菌种鉴定　　　　　　　　　　　　　　　　抗酸染色　　　　菌落特点　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　鉴定试验　　　药敏试验标本采集感染部位不同，取不同的标本，宜用能抑制污染菌的方法常见标本：痰、尿、胸腹水等检查方法1.显微镜检查　1）直接涂片：用萋－尼氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，需进一步分离培养鉴定。　2）浓缩集菌涂片：如标本中菌量少，杂菌和杂质多时，用离心沉淀法将菌浓缩聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查分离培养　TB菌接种前处理－液化和处理杂菌4%NaOH、6%H2SO4、胰酶15-20min　培养基选择—罗氏培养基鉴别培养基(PNB、T2H、NAP)　仪器培养—Bacte460、BacT/ALERT3D液体培养基培养时间—长一般6-8周鉴定1.染色性2.菌落特征3.生长速度4.色素产生5.生化试验鉴别试验：NAP(p-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenome)抑制试验结核分枝杆菌NAP-非结核分枝杆菌NAP+核酸检测　快速诊断－－PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-核酸探针、PCR-核酸测序、多重PCR、双重复插入序列PCR等。色谱分析技术　测分枝菌酸免疫学检测1.结核菌素试验：OT或PPD迟发型超敏反应。　2.全血干扰素测定　3.抗体检测　检测PPDIgG辅助诊断。结核菌素试验原理：迟发型变态反应，应用结核菌素进行皮肤试验，测定机体对结核分枝杆菌是否能引起变态反应。试剂：OT(oidtuberculin，OT)旧结核菌素PPD（purifiedproteinderivative，PPD）纯蛋白衍生物方法：OT或PPD5u（0.1ml）前臂皮内注射，48～72h观察结果。红肿硬结>5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，红肿硬结＜5mm者为阴性。方法菌对结核分枝杆菌有老年人或免疫功能低下者。ⅱ接种过卡介苗ⅲ应用：⒈选择BCG接种对象和免疫效果的测定⒉作为婴幼儿结核病的辅助诊断⒊测定肿瘤患者的细胞免疫功能⒋在未接种BCG的人群中调查结核流行情况。全血干扰素测定受BCG影响小可区分非结核分枝杆菌避免操作及结果判读主观或人为因素影响非典型分枝杆菌指结核分枝杆菌与麻风杆菌以外的分枝杆菌已发现17种以上可引起人类疾病，在临床上难以与结核分枝杆菌感染区别分类光产色菌：暗处不产色素，光照后产色素暗产色菌：有光或无光均产色素不产色菌：有光或无光均不产色素迅速生长菌：普通培养基上生长3-6天光产色菌堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌暗产色菌瘰痢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌不产色菌鸟-胞内复合分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾分枝杆菌迅速生长菌偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌重点：结核分枝杆菌的细菌学特性结核分枝杆菌的实验室检查