WST 353-2011 天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定(无磷酸吡哆醛)参考方法

ICs 11.020 C50 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 Ws/T353 —ˉˉ2011 天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定 (无磷酸吡哆醛)参考方法 Reference procedure for the measurement of catalytic activity concentration of aspartate aⅡlinotransferase(No pyridoXaI-5’-phosphoric acid) 2011-09-3o 发 布 中华人民共和国卫生部 发 布 2012-04-01 实施 Ws/T 353- 2ˉ011 前言 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ Ⅱ 1 范围 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·1 2 性引用文件 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·1 3 术语和缩咯语 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 1 4 参考方法描述 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 3 4.1 测定原理和方法 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·3 4.2 检查列表 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 3 4.3 试剂 ·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨4 4.4 仪器 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·7 4.5 采样和样本 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8 4.6 澍定系统和部分的准备 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8 4.7 酶催化活性浓度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 12 4.8 测定结果处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 14 ⒋。9 分析可靠性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 14 4.10 通过实验室间比对进行确认 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·15 4.11 参考区间 ·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 15 4.12 报告 ·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 15 4.13 质量保证 ⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 16 附录 A(规范性附录) 测定储存酶溶液中LD催化活性浓度 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·17 附录 B(规范性附录) 测定储存酶溶液中MD催化活性浓度 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 20 附录 C(资料性附录) 试剂原料详细信息 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·23 附录D(规范性附录) 不同温度下溶液 1、溶液 2的 pH值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 30 附录 E(资料性附录) AST IFCC37℃ 参考方法与 30℃参考方法的比较 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 32 参考文献 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 34 次目 www.bzfxw.com Ws/T353- 2ˉ011 剐 肓 本标准按照 GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准修改采用由国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)批 准的《IFCC37℃ 酶催化活性浓度坝J 定原级参考方法 第 5部分:天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定参考方法》,将原参考方法试剂 中磷酸吡哆醛去掉,重新建立依据本标准的参考区间,并参考 Iso15193:2009《体外诊断器具 生物源 样品中量的测定 参考测定程序的表述》适当增加内容。 本标准的附录 A、附录 B、 附录 D为规范性附录,附录 C、 附录 E为资料性附录。 本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。 本标准起草单位:北京航天总医院。 本标准主要起草人:陈宝荣、邵燕、孙葸颖、胡滨、陈琦。 www.bzfxw.com Ws/T353-2011 天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定 (无磷酸吡哆醛)参考方法 1 范围 本标准规定了在临床医学应用中,测 定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)催 化活性浓度 (无磷酸吡哆 醛)的参考方法。 本标准主要适用于参考实验室 ,作为天门冬氨酸氨基转移酶催化活性浓度(无磷酸吡哆醛)测 定的 溯源 ,也可作为与酶催化活性浓度检验有关的仪器和试剂生产企业的溯源,可供有关认可单位及质量管 理部门应用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注 日期的引用文件,仅所注 日期的版本适用于本 文件。凡是不注 日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 Iso15193:⒛09 体外诊断器具 生物源样本中量的测定 参考测定程序的表述 3 术语和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 原始样本 primary sample 最初从一个系统中取出的一个或几个部分的集合物 ,旨 在提供该系统的信息或作为对该系统做出 决定的基础。 注:在 某些情况下,所 提供的信息可以适用于一个较大的系统或一组系统,此时取样系统是这些系统的组成 部分。 3.1.2 实验室样本 Iaboratory sampIe 准备送到实验室或实验室接收的用于测定的原始样本或原始样本的分样本。 3.1.3 分析样本 analytical samph 自实验室样本制备的、可从中取出分析部分的样本 。 注:在取出分析部分之前,分析样本可经过各种处理。 3.1.4 乡卜猢厅舀阝乡卜 anaIyticaⅡ portion 从分 析样 本 中取 出的用于实际测定 和观察 的物质部分 。 注:如果不需预处理,分析部分直接从原始样本或实验室样本中取出。某些情况下,需将分析部分溶解成分析溶液 再上机测定。 1 www.bzfxw.com Ws/T353—2011 3.1.5 步卜和亍漯舁Π攴 anaIyticaI soIution 将分析部分溶解在气体 、液体或 固体 中而制备的溶液 ,溶解过程 中可 以有反应发生或无反应发生 。 3.1.6 (某 一物质系统的)基质 matrix(of a maternal system) 一个物质系统 中除被分析物之外 的所有成分 。 3.1.7 参考方法 reference proCedure 是在校准或表征标准物质时为提供测定结果所采用 的测定方法 ,它适用 于评定 由同类量 的其他测 定方法获得的被测定量值 的测定正确度 。 3.1,8 测定系统的灵敏度 sensitivity of a measuring吖stem 简称 :灵敏度 sensitivity 测定系统的示值变化除 以相应 的被测定值变化所得 的商 。 注 1:测定系统的灵敏度可能与被测定的量值有关。 注2:所考虑的被测定值的变化必须大于测定系统的分辨力。 3.1.9 哆卜书斤牛竽J帚 巾± analyticaⅡ specificity 测定方法只测定可测定 的量的能力 。 3.1.10 分析干扰 analytiCa1interference 由一个影响量引起 的系统测定误差 ,该影响量 自身在测定系统 中不产生信号 ,但它会引起示值 的增 高或降低 。 3.1.11 影Ⅱ向量 inf1uence quantity 被测定以外 的可影响测定结果 的量 。 3,1.12 被测虽 measurand 拟测定的量 。 注 1:对被测定的说明要求了解量的种类,以及含有该量的现象、物体或物质状态的描述,包括有关成分及所涉及的 化学实体。 注 2:在 VIM第 二版和EC6005⒍300:⒛01中 ,被测定定义为受到测定的量。 注 3:测 定包括测定系统和实施测定的条件,它可能会改变研究中的现象、物体或物质,使被测定的量可能不同于定 义的被测定。在这种情况下,适 当的修正是必要的。 3.1.13 检出限 detecton Ⅱmit,Ⅱm⒒of detection 由给定测定方法获得 的测得值 ,其声称的物质成分不存在的误判概率为 β,声称物质成分存在 的误 判概率为 α。 注 1:国际理论和应用化学联合会(IUPAC)推 荐 α和β的默认值为 0.05。 注 2:有时使用缩写词 LOD。 注 3:不要用术语“灵敏度”表示“检出限”。 3.1.14 校准品 ca1ibrator 用于校准的测定标准 。 2 www.bzfxw.com Ws/T353-2011 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AST:天 门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase) LD:孚1酸脱氢酶(lactate dehydrogenase) MD:苹 果酸脱氢酶(malate dehydrogenase) NAD:氧化型 阡烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β n忆otinamide-adenine dinucl∞t1de,oxid讫ed form) NADH:还原型 阡烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-ni∞tinamide-耐enine dinucl∞tide,reduccd form) R5-P:5’ -磷酸吡哆醛(pyridoxa15vhosphooc a0d) IFCC:国 际 临 床 化 学 与 检 验 医 学 联 合 会 (international federati°n of dinical chemistry and laboratory medicine) SOP:标准操作方法(standard operation procedure) 4 参考方法描述 4.1 测定原理和方法 本法采用偶联反应 ,⒈天门冬氨酸和 旷酮戊二酸在 AST催化下,生 成草酰乙酸和 L-谷氨酸 ,草 酰 乙酸在 MD催化下生成 ⒈苹果酸 ,同 时 NADH被 氧化成 NAD+,反 应式如下 : L天门冬氨酸+2-酮戊二酸」翌L草酰乙酸十⒈谷氨酸 草 酰 乙 酸 +NADH+H+工 哩辶叱-苹果 酸 +NAD+ 在 339nm下,监测 NADH的 氧化速率 ,摩 尔消光系数的下降速率与 AST催化活性浓度呈正比。 4.2 检查列表 4.2.1 试剂列表 将所用试剂按表 1列 出。 表 1 试剂列表 分 类 系 统 名 称 通用名称 、缩硌语 试剂原料 三羟甲基氨基甲烷 Tos L(+)天门冬氨酸 天门冬氨酸 ⒉酮戊二酸 ,二钠盐 ,二水合物 ~9酮戊二酸 肛烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ,还原型 ,二钠盐 还原辅酶 I,NADH 无 乳酸脱氢酶 ,LD 无 苹果酸脱氢酶 ,MD 叠氮钠 无 盐 酸 无 氢氧化钠 无 氨化钠 无 牛血清白蛋 白,Fraction V 牛白蛋 白 丙酮酸一钠盐 无 草酰乙酸 无 www.bzfxw.com Ws/T353—2011 表 1(续 ) 4.2.2 分光光度计和辅助仪器列表 参考实验室应在表 2登记主要测定仪器(分光光度计)和 主要辅助仪器(点式温度计 、天平、pH计、 恒温水浴箱、稀释配液仪、移液器等)。 表 2 分光光度计和辅助仪器 4.3 试剂 4.3.1 试剂原料倌息 按表 3填写试剂原料详细信息 。 表 3 试剂原料详细信息 试剂系统名 通用名 分 类 系 统 名 称 通用名称 、缩咯语 溶 剂 质量与双蒸水类似的高纯度水(电导率<2uS·cm-l pH6~7,硅酸盐(0.1mg·Ll) 无 参考物质 JCTLM和 (或 )国 家批准的参考物质 无 质控物质 常规系统校准品 无 指示剂 无 无 仪 器 名 称 生 产 厂 家 型 号 分光光度计 点式温度计 天 平 pH计 恒温水浴箱 稀释配液仪 移液器 信 息 指 标 内 容 CAS,CARN注册号 生产厂家 货号/批号 分子式 相对分子质量 纯 度 特定合格要求(如有) 危险度 贮存要求 失效期 www.bzfxw.com Ws/T 353-2011 ΛsT测定所用每个试剂原料详细信息见附录 C。 如怀疑一种化学药品含有不纯的物质影响了分 析物的催化活性 ,应进行进一步的研究 ,例如 ,比 较不同厂家和不同批号的产品。宜使用在对 比试验中 已经鉴定或认可的试剂。以下三种试剂需要注意安全 : 盐酸 :接触其蒸气或烟雾 ,可 引起急性中毒 ,出 现眼结膜炎 ,鼻 及 口腔黏膜有烧灼感 ,鼻 衄、齿龈出 血 ,气 管炎等。误服可引起消化道灼伤、溃疡形成 ,有 可能引起 胃穿孔 、腹膜炎等。眼和皮肤接触可致灼 伤。慢性影响:长期接触 ,引 起慢性鼻炎、慢性支气管炎、牙齿酸蚀症及皮肤损害。操作人员应经过专门 ,严格遵守操作规程。操作人员宜佩戴 自吸过滤式防毒面具 (全面罩),穿橡胶耐酸碱服 ,戴橡胶耐 酸碱手套。远离易燃、可燃物。 氢氧化钠 :有强烈刺激和腐蚀性。粉尘或烟雾会刺激眼和呼吸道 ,腐蚀鼻中隔;皮肤和眼与 NaOH 直接接触会引起灼伤;误服可造成消化道灼伤,黏膜糜烂 、出血和休克。本品不会燃烧 ,遇 水和水蒸气大 量放热,形 成腐蚀性溶液。与酸发生中和反应并放热。具有强腐蚀性 。燃烧(分解)产 物 :可 能产生有害 的毒性烟雾。呼吸系统防护 :必要时佩戴防毒 口罩。眼睛防护 :戴化学安全防护眼镜。防护服 :穿 工作 服(防腐材料制作)。 手防护 :戴 橡皮手套。 叠氮钠 :本品和氰化物相似 ,对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用,并 能使体内氧合血红蛋白形 成受阻,有 显著的降压作用。对眼和皮肤有刺激性。如吸人、口服或经皮肤吸收 ,可 引起中毒死亡。高 血压病人口服本品有显著降压作用。本品在有机合成中可有叠氮酸气体逸出,吸人中毒后出现眩晕、虚 弱无力、视觉模糊、呼吸困难、昏厥感 、血压降低、心动过缓等。呼吸系统防护 :可 能接触其粉尘时,应 佩 戴头罩型电动送风过滤式防尘呼吸器。紧急事态抢救或撤离时,宜佩戴 自给式呼吸器。眼睛防护 :呼吸 系统防护中已作防护。身体防护 :穿连衣式胶布防毒衣。手防护 :戴橡胶手套。其他 :工作现场禁止吸 烟、进食和饮水。工作毕 ,淋浴更衣。单独存放被毒物污染的衣服 ,洗 后备用。保持 良好的卫生习惯。 皮肤接触 :脱去被污染的衣着 ,用 肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。眼睛接触 :提起眼睑,用 流动清水或生理 盐水冲洗。就医。吸入 :迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难 ,给输氧。如呼吸 停止 ,立 即进行人工呼吸。就医。误食 :饮足量温水 ,催吐 ,就 医。 4.3.2 试剂溶液 4.3.2.1 一般要求 制备溶液时各成分给出的质量是指 100%含量。如果化学物质的含量低于 100%[例 如 y(%)彐,则 应用因子 :凡。n饺nt=100/丿,计算出与给出质量相当的某化学物质的质量。 溶液的制备应使 用质量 与双蒸水 类似 的高纯度水 (电 导率 (2uS·cm1,pH6~7,硅酸盐 <0,1mg·Ll)。 每次称重的扩展(尼 =2)不确定度(包括物质纯度的不确定度×正态分布),应≤1.5%。 4.3,2.2 溶液 1 称量 1,17g Tris、4.02g天门冬氨酸(游离酸)及 0,052g叠氮钠,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶在约 80mL水中 ; ——加 4.2mL~4,4mL5。00mol·Ll的氢氧化钠溶液 ; ——搅拌直到试剂完全溶解 ; ——混合液的 pH值应 比pH靶值低(约 0.3到 0.9pH单位); ——在 37℃ 用 2mol·L1氢氧化钠溶液调节 pH到7.65; ——转移至 100mL容量瓶中; ——将容量瓶和水平衡至 zO℃; ——加水(20℃ )至 容量瓶的刻度线。 www.bzfxw.com Ws/T353-2011 最终配制的溶液中 Tris浓度为 96.92mmol·Ll、天门冬氨酸(游离酸)浓度为 302.4mmol·L〗 、叠 氮钠浓度为 8.00mmol·L1。 该溶液 2℃ ~8℃稳定性为 3个月。 注:加水之后天门冬氨酸不溶解,必 须先加氢氧化钠溶液,以 5m°l· L〗 代替 2m。l· Lˉ 1氢 氧化钠溶液可减少所 需用量,精确调整 pH值时需用 2m°l· Lˉl氢氧化钠溶液。 4,3.2.3 溶液 2 称量 1,17g Tris、0,052g叠氮钠 ,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶在约 80mL水中 ; ——在 37℃ 用 lm°l· Lˉl HCl调pH值到 7.65; ——转移至 100mL容量瓶 ; ——将容量瓶和水平衡至 zO℃; ——加水(20℃ )至容量瓶刻度线。 最终配制的溶液中 Tris浓度为 96.92mmol·Lˉ 、叠氮钠浓度为 8.00mmol·L¨ 。该溶液 2℃~8℃稳定性为 3个月。 4,3,2.4 溶液 3 称量 16.1mg NADH二钠盐 ,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶于 2.00mL溶液 2中 ; ——避光保存(如 棕色瓶)。 最终配制的溶液中 NADH二钠盐浓度为 11.34mmol·Ll。 该溶液 2℃ ~8℃稳定性为 1周 。 4,3.2.5 酶试剂的稀释液 称量 1.zO g牛血清白蛋白、0.90g NaCl,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶于约 80mL水中; ——转移至 100mL容量瓶 ; ——将容量瓶和水平衡至 ⒛ ℃ ; ——加水(20℃ )至容量瓶刻度线。 最终配制的溶液中 Naα浓度为 154mmol·Lˉ 1。 该溶液 2℃~8℃稳定性至少 1个月。 4.3.2.6 溶液 4 按以下步骤配制 : ——用 4.3.2.5中 的酶试剂稀释液稀释 LD储存液,使 LD催化活性浓度在 37℃ 时为 3.钯 mkaⅡ Lˉ 1 (226.8kU·Lˉl),按公式(1)计算稀释 LD储存液所需酶试剂稀释液体积 : ‰ = ⋯ ⋯ ⋯⋯ ⋯ “ 。 式中: V训 "“ n——稀释 LD储存液所需酶试剂稀释液体积 ,单位为毫升(mL〉; VLD。∝k——LD储存液体积 ,单位为毫升(mL); LD“。ck——LD储存液中 LD催化活性浓度 ,单位为毫凯塔尔每升(mkaⅡ Lˉ 1)或千单位每升 (kU·Lˉl)。 示例:见 附录B。 ——用 4.3.2.5中 的酶试剂稀释液稀释 JWID储存液,使 NID催化活性浓度在 岁 ℃时为 2.52mkat·Lˉ l (151.2kU·Lˉl),按公式(2)计算稀释 NID储存液所需酶试剂稀释液体积 : 6 www.bzfxw.com VMJlst。ck×(MD合ωck-151.2) Ws/T353-2011 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)Vdnutl。n= 151.2 式中: V嗣 "⒗ n——稀释 MD储存液所需酶试剂稀释液体积 ,单位为毫升(mL); V,,rD ψrk~~MD储存液体积 ,单位为毫升(mL); MD⒒。ck——MD储存液中 MD催化活性浓度 ,单位为毫凯塔尔每升(mkat·L1)或千单位每 升(kU·Lˉl)。 示例:见 附录C。 ——将两种稀释后的酶溶液等体积混合可得溶液 4。 最终配制的溶液中 LD催化活性浓度在 37℃ 时为 1.89mkaⅡ L l(113。4kU·L1)、 MD催化活 性浓度在 37℃ 时为 1.26mht·L1(75.6kU·Lˉl)。 该溶液 2℃~8℃稳定性为 2d。 4,3.2.7 反应溶液 分别移取 10.0mL溶液 1、 0.⒛0mL溶液 3、 0,⒛ O mL水、0.100mL溶液 4,将 上述溶液充分混 匀、避光保存。该溶液 2℃ ~8℃稳定性为 1d。 4.3.2.8 起始试剂溶液 称量 0.326g2-酮戊二酸二钠二水化合物 ,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶于约 6mL水中 ; ——转移至 10mL容量瓶 ; ——将容量瓶和水平衡至 zO℃; ——加水(20℃ )至刻度线。 最终配制的溶液中 ⒉酮戊二酸二钠二水化合物浓度为 144,O mmol·L1。 该溶液 2℃ ~8℃稳定 性为 1周 。 4.3.3 温度对缓冲溶液 pH的影响 当温度偏离 37℃ 时,调节 pH值的方法 :将 温度计与 pH电极同时浸人混合液中。然后将溶液边 搅拌边滴定至表中列举在当前测定温度下的pH值。在校准、控制和调节 pH的过程中,搅拌速度要一 致。pH电极应位于被搅拌溶液的中心。 应考虑到在调节 pH的滴定过程中,温度是可能改变的因素。为此 ,接近靶值时应重新控制温度 , 如果需要 ,根据附录 E调整 pH靶值。同样的方法也适用于 pH计的温度补偿调节。 配制溶液 1、 2时 ,需根据不同温度调整 pH值。参阅附录 D来调节溶液的 pH值。 4.4 仪器 分光光度计及辅助仪器主要性能的要求 ,见表 4。 表 4 分光光度计、辅助仪器主要性能的要求 仪 嵛 名 称 '"∶ 能 指 标 IFCC参 考方法娑求 分光光度计、配件 波长准确度/nm 339=± 1(虑 ==2) 带宽/nm ≤ 2 光径/mm 10 00=L0.01(虑 ==2) pH计 pH值 7.65+0 05(虑 ==2) 点式温度计 温度/℃ 37 0=L0 1(汔 ==2) www.bzfxw.com Ws/T353-2011 4.5 采样和样本 4.5.1 通贝刂 参考实验室主要接受外检样本 ,不 自行采血 ,一 般不需考虑分析前因素对样本特性的影响。 4.5.2 对收检样本的要求 宜以表格形式样本的详细信息 ,见表 5。 对不符合样本收检要求的样本应及时与委托方联系。 表 5 AsT收检样本要求 4.6 测定系统和分析部分的准备 4.6.1 测定系统的准备 4.6.1.1 分光光度计准备 测定工作前 ,按 已制定的 SOP文件对分光光度计进行检查 ,填写表 6。 表 6 分光光度计准备 要求指标 内 容 可接受样本种类 □血清 □血浆 □其他 可接受样本类型 基质类型说明 □冻干粉 □人血清 □液体 □午血清 □冰冻 □水 □其他 □其他 样本最低数量 支 每支样本最低体积 每支 mL 允许添加物 运输条件 □干冰 □常温 □冰袋 □其他 贮存条件 □常温 □4℃ □-20℃ □-70℃ □其他 稳定性 危险性 注意事项 准备事项 具 体 内 容 开机前检查 □电源 □温度 □接地 □湿度 □电脑 □机身清洁 □打印机 □是否 24h开机 □比色仓清洁 □比色窗清洁 组 合 恒温装置 : 测温装置 : 搅拌装置 · 比色杯 : □与分光光度计连接完整 □提前开机 □电量 □测温探头勿挤压、碰撞坚硬物体 □清洁 □转速 □完整 □清洁度 开机注意事项 光源灯: □提前预热 比色杯: □光径 □比色杯间匹配 www.bzfxw.com 、Vs/T 353-2011 表 6(续 ) 准备事项 具 体 内 容 仪器性能检查 核实是否在国家计量机构检定合格有效期内 每 日开机性能检查 : □波长准确度 □波长重复性 □基线平直度扫描 匚带宽测试 □噪音测试 大型实验前性能检查 : □氧化钬玻璃检查波长准确度 □国家标准溶液检查摩尔消光系数准确度 顶防性维护 分光光度计 : □无明显振动 □无线电干扰 辅助仪器 : □更换进 、出水管 □及时待机 □UPs □定期清洁 □使用后清洁点温计探头 、搅拌装置 各实验室可根据具体情况制定本实验室分光光度计准备图。 4,6.1,2 点式温度计准备 测定工作前 ,按 已制定的 SoP文件对点式温度计进行检查 ,填写表 7。 表 7 点式温度计准备 各实验室可根据具体情况制定本实验室点式温度计准备流程图。 4.6,1.3 恒温水浴箱准备 测定工作前 ,按 已制定的 SoP文件对恒温水浴箱进行检查 ,填写表 8。 表 8 恒温水浴箱测定系统的准备 准备事项 具 体 内 容 开机前检查 □电源 □机身清洁 □点式温度计温度探头是否正常 组 合 □主机与点式温度计温度探头连接完整 开机注意事项 电量 : □查看剩余电量 校准提示 : □查看校准有效期是否到期 仪器性能检查 核实是否在国家计量机构检定合格有效期内 大型实验前性能检查: □用计量合格的标准温度计检查温度的准确性 预防性维护 主机 : □机身清洁 温度探头 : □使用后及时清洁 □保证直形 、不弯曲 准备事项 具 体 内 容 开机前检查 □电源 □温度 □湿度 □机身清洁 组 合 □与分光光度计连接 开机注意事项 □水量 □进 口水管 □出口水管 仪器性能检查 □温度校正 □温度稳定性 预防性维护 □定期更换进 口水管 □清洗滤网 □定期更换出口水管 □水箱内部消毒 www.bzfxw.com Ws/T353-2011 各实验室可根据具体情况制定本实验室恒温水浴箱准备流程图。 4.6,1.4 稀释配液仪准备(实 验窒若有) 测定工作前 ,按 已制定的 SoP文件对稀释配液仪进行检查 ,填写表 9。 表 9 稀释配液仪测定系统的准备 各实验室可根据具体情况制定本实验室稀释配液仪准备流程图。 4.6.1.5 移液器准备 测定工作前 ,按 已制定的 SOP文件对移液器进行检查 ,填写表 10。 表 10 移液器测定系统的准备 各实验室可根据具体情况制定本实验室移液器准备流程图。 4.6.1.6 天平准备 测定工作前 ,按 已制定的 sOP文件对天平进行检查 ,填写表 11。 表 11 天平准备 各实验室可根据具体情况制定本实验室天平准备流程图。 4.6.1.7 pH计准备 测定工作前 ,按 已制定的 SOP文件对 pH计进行检查 ,填写表 12。 10 准备事项 具 体 内 容 开机前检查 □电源 □温度 □湿度 □机身清洁 开机注意事项 □注射器 □移液 口 口管路冲洗 仪器性能检查 □加样量正确性 □加样量精密度 预防性维护 □定期更换注射器 □定期更换移液管 准备事项 具 体 内 容 应用前检查 □温度 □湿度 □机身清洁 □机械移动 仪器性能检查 □加样量正确性 □加样量精密度 预防性维护 □定期进行保养 □定期校准 准备事项 具 体 内 容 开机前检查 □电源 □打印机 □水平珠位置 开机 自检 □电量 □零位显示 校 准 核实是否在国家计量机构检定合格有效期内 大型实验前:标准砝码校准 每次应用前 :仪器自带校准 开机注意事项 □使用前清洁天平 □电源充足 www.bzfxw.com 准备事项 具 体 内 容 开机前检查 □电源 □温度 □接地 □湿度 □电脑 □打印机 □机身清洁 组 合 温度探头 : □与 pH计连接完整 电极 : □与 pH计连接完整 □内液的量 □外液的量 磁力搅拌器 :□ 电源 □接地 □转速 磁力搅拌子 :□完整 □清洁度 □磁力 pH标准溶液 : □剩余量 □有效期 仪器性能保证 每次应用前性能保证 : 更换电极内液和电极外液进行电极激活 采用 pH标准溶液进行校准 准备事项 具体内容 预防性维护 应用前 :□更换电极内液和电极外液 :电极激活 应用后 :□更换电极内液和电极外液 :电极保养 □清洁温度探头 、电极 、Vs/T 353—2011 表 12 pH计准备 各实验室可根据具体情况制定本实验室 pH计准备流程图。 4.6.2 分祈部分的准备 4.6.2.1 分析样本的类型 AsT(无磷酸吡哆醛)参考方法测定样本主要有 : ——参考物质(RM); ——质控品 ; ——检测实验室送检样本 ; ——其他样本。 4.6.2.2 分析系列的结构 分析样本按下列顺序排列 : ——参考物质(RM); ——质控品 ; ——空白样本 ,如 :生理盐水 ; ——被分析的“未知”物质。 上述样本重复测定可减小测定结果不确定度。从一个样本到下一个样本 的携带污染应小于 0.5%。 4.6.2.3 分析部分 AST(无磷酸吡哆醛)参考方法测定的样本多为冻干粉或深低温的冰冻样本 ,测 定前需处理为均匀 的液状状态 ,分析部分应取 自该液体样本。实验室需对待测的各种样本经过一定方法处理后 ,取 出分析 部分进行测定。 对每一类型实验室样本应制定详尽的样本处理 soP文件 ,并有记录证实操作达到预期要求。实验 11 www.bzfxw.com Ws/T353—2011 室样本若为冻干粉或干粉 ,应使用质量与双蒸水类似的高纯度水 (电 导率(2uS·cm",pH6~7,硅酸 盐<0.1mg·L1)溶解 ;若为冷冻液体如冰冻血清等,应按 SOP文件在严格控制的条件下溶解。 应有处理参考物质的方法和记录。 测定过的样本有贮存待复查、销毁的文件和记录。 4.7 酶催化活性浓度测定 4.7.1 测定条件 见表 13。 表 13 AsT催化活性浓度测定条件 4.7.2 测定步骤 4.7.2.1 监测比色杯内温度 ,达到要求时开始准备试剂和分析溶液。 4.7.2.2 将一份适当体积(约 0.4mL)起始试剂溶液在 37℃ 平衡 ,剩余的起始试剂应保存在 2℃~ 8℃ 。 4.7.2.3 将 4.3.2中所列试剂体积按表 14的顺序加人到反应杯中。 表 14 总体转换率测定的分析系统(AsT催化反应速率和空白率) 参 数 指 标 温 度 37.0℃ 士0.1℃ a 波 长 339nm±1nma 带 宽 ≤ 2 光 径 10.00mm±0.01mma 孵育时间 300 s 延迟时间 90 s 测定时间 180 s 读数(测定点) 彡≥6 扩展不确定度(尼 =2)。 体 积 测 定 步 骤 2.000mL 反 应液 平衡至 37℃ o.200mL 样本 充分混合并孵育 300s。 在孵育结束时 ,反应杯中的溶液 温度应达到 37℃ 0.200mL 起始试剂溶液 充分混合,等候 90s,监测另外 180s的时间和吸光度 注:此动态光度测定的扩展(尼 =2)合成不确定度(正态分布)不应超过 1%。 (此不确定度不包括波长调整的不确 定度)。 样本体积分数的扩展(汔 =2)合成不确定度(正态分布)应≤1%。 淮备试剂和分析溶液 孵育反应液试剂 在比色杯内加入2.000mL反应液 加入分析溶液0.zOO mL,充分混匀 加入启动试剂0.200lnL,充分混匀 监诏淳尔消光系数 记录摩尔消光系数值 Ws/T353—2011 图 1 AsT(无磷酸吡哆醛)参考方法测定流程图 4.7.3 最终完全反应混和物的浓度 见表 15。 表 15 AsT催化活性浓度测定最终完全反应混合物的浓度 4.7.4 试剂空白率测定 为了测定试剂空白率 ,用 9g·Ll(154mmol·Ll)NaC1溶液代替样本 ,测 定方法同 4.7.2。 如 13 参 数 指 标 三羟甲基氨基甲烷[T“s] 80mmo1·Lˉ 1 pH(37℃) 7.65=LO.05a L天冬氨酸 240mⅡ】ol·Lˉ l NADH 0.18mmol·Lˉ l MD(37℃ ) 10ukat·Lˉ l(6001J·Lˉl) LD(37℃ ) 15ukat·Lˉ l(9001J·Lˉ l) ⒉酮戊二酸 mmd·Lˉ 样本体积 比分 0.0833(1 : 12) 扩展不确定度(尼 =2) Ws/T353—⒛ 1l 果试剂空 白摩尔消光系数 的绝对变化超过 3.3× 105s(0,002min l),反应液应丢弃 。 4.7.5 样本 空白率测定 测定样本空 白率 ,用 9g·Ll(154mmol·Ll)NaCl溶液代替起始试剂溶液 ,测 定方法 同上 。 注 1:测 定样本空白率并作记录,但在计算质控血清和校准品中 AST催化活性浓度时不予考虑。如果样本空白率 超过总 AsT的1%时 ,应发出警告该物质不适合作校准用。 注 2:样 本空白率的试剂空自可用 9g· LˉNaCl溶液代替起始试剂溶液和样本进行测定。 4.7.6 结果确认 在进行重要测定前(如 给参考物质/校准品赋值 、测定室间比对样本等),应先测定 JCTLM和 (或 ) 国家批准的参考物质 ,测 定结果应在“靶值±不确定度”范围内,否则应确认建立方法的正确性。 实验室应有 SoP文件和记录证实此活动。 4.8 测定结果处理 4.8.1 测定结果计算及数据处理 4.8.1.1 计算 通过回归分析(最小二乘法)计算摩尔消光系数随时间的改变匚s1(min l)彐。减去试剂空白率后 , 即校正后的样本摩尔消光系数变化率。按公式(3)计算 AST催化活性浓度 : 虹 sT=F× (AA/△ 莎)A贸 ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ (3) 式中 : aAsT ——人汀 催化活性浓度,单位为微凯塔尔每升(ukat·Ll)或单位每升(U· Ll); F ——系数 ,等于 1905(在 339nm波长测定时 ,ε339(NADH)=630m2· mol l); (AA/加 )AsT——经过试剂空白率校正后的样本摩尔消光系数变化率 ,单 位为每秒 (s^l)或每分 (min1)。 4.8.1.2 数据处理 4.8.1.2.1 数据剔除:必要时 ,每个实验室应建立适当的数据剔除规则。 4.8.1.2.2 计算每批次测定值的均值、标准差 ,必要时应检查数据分布类型,计算均值的标准偏差 (标 准误)。 4.8.1.2.3 根据 GUM和 QUAM原 则计算测定结果不确定度。 4.8.2 酶活性单位及换算关系 酶催化活性常用单位为 kat·Ll,使用时常出现多位小数 ,目 前常以 ukat·Lˉ l或nkat·Ll表 示,但临床医学中仍习惯于使用 U· L1。 换算关系如下 : 以 U· L1单位表示的催化活性浓度可通过乘以系数(∫=0。 01667)转化成 ukat·L1。 4.9 分析可靠性 4.9.1 概念、价值及其应用 应依据不确定度、精密度、线性范围、检出限等来评估 AST参考方法的分析可靠性。相关文献及参 考方法的实验室测定数据表明本参考方法的分析性能优于临床酶活性浓度常规方法。适合于临床常规 14 Ws/T353—zO1l 方法的溯源。 4.9.2 测定不确定度 应根据 GUM和 QUAM原 则计算测定不确定度。本参考方法测定结果的相对合成标准不确定度 在浓度 1.67ukat·Ll(100U·L1)时宜小于 2%。 4.9.3 精密度 应根据本 实验室测定条件评估 建立 的参考 方法 的重 复性 、复现性精 密度。本 参考方法测 定 1.67ukat·Ll(100U·L1)样本 的重复性精密度宜小于 1.5%,实 验室 内复现性精密度宜小 于 2.0%。 4.9.4 检出限 与分光光 度 计 的最 小 分 析 信 号 有 关。本 参 考 方 法 测 定 的最低 检 出 限为 0。 08ukat·L1 (5,OU· Ll)。 4.9.5 线性范围 线性范围(4.13ukat·L1(247.7U· Ll)。 4.9.6 误差的来源 在孵育过程中,样本中高浓度的丙酮酸将导致 NADH大 量消耗 ,这样会降低测定范围的上限 ,并 大大降低测定结果。 4.10 通过实验室间比对进行确认 目前尚无 AST催化活性浓度测定(无磷酸吡哆醛)参考方法的实验室间比对活动。 4.l1 参考区间 初步调查男性与女性(≥ 17岁 )的参考区间。 男性 : ——下限(第 2.5百分位):0.31ukat·L1(18.6U· Ll); ——上限(第 97.5百 分位):0.55ukat·L1(32.7U· L1); 女性 : ——下限(第 2.5百分位):0.26ukaⅡ L】 (15.5U· LˉI); ——上限(第 97.5百 分位):0.47ukat·Ll(28.1U·Ll)。 注:中 国AsT催化活性浓度(无磷酸吡哆醛)参考区间尚在调查中。 4.12 报告 应设计适宜的测定结果报告格式 ,包括但不限于以下内容 : ——血清、血浆或其他 ; ——取样 日期和测定 日期 ; ——测定所使用的参考方法 :IFCC在 37℃下测定 AST催化活性浓度的原级参考方法 ; ——被测定的名称、测定结果数字值和测定单位 : 被测定的名称 :AST 15 Ws/T353一ˉ2011 测定单位:ukat·Lˉ 1或 U· L【 ; ——评定测定结果的不确定庋:一般取 屁=2; ——样本异常特性记录:如溶血、黄疸、乳糜等 ; ——测定方法的异常倩况或改变测定方法记录。 4.13 质Ⅱ保江 4.13.1 室内质Ⅱ控制 每个工作日开始正式测定样本前均测定质控品,当 质控符合要求后才进人正式测定。应建立包括 质控规则、操作步骤的室内质控 S0P文件及记录。 4.13.2 室间质】控制评价 目前尚无 AsT催化活性浓度测定(无磷酸吡哆醛)参考方法的实验室间比对活动。 4.13.3 质Ⅱ日志 每个工作日完成工作日志及环境控制的质量记录。 lVs/T353- 2ˉ011 附 录 A (规范性 附录) 测定储存酶溶液 中 LD催化活性浓度 A.1 测定试剂 A。 1.1 辅助试剂 A。 1.1.1 一水 5’-磷酸吡哆醛(p”doxa⒈5’-pl1osphoHc aod,monohydrate,P5-P×C:H1° 06NP· H20),相对 分子质量=⒛5.2。 A。 1.1.2 丙酮酸一钠盐(C3H303Na),相对分子质量=110.0。 A。 1.2 试剂制备 A。 1.2.1 5’ -磷酸吡哆醛溶液 称量 16.7mg一水 5’ -磷酸吡哆醛 ,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶于约 6mL溶液 2中 ; ——转移至 10mL容量瓶中 ; ——将容量瓶和溶液 2平衡至 ⒛ ℃ ; ——加溶液 2至容量瓶的校准刻度线(20℃ ); ——避光保存(如装在棕色瓶)。 最终配制的溶液中 5’ -磷酸吡哆醛的浓度为 6.300mmol·L1。 该溶液 2℃~8℃稳定性为 l周。 A。 1.2.2 测定 LD催化活性浓度的反应液 分别移取 10。 O mL溶液 1、 0。 ⒛O mL5’-磷酸吡哆醛溶液、0。 ⒛O mL溶液 3、 0.100mL水,将上述 溶液充分混匀、避光保存。该溶液 2℃~8℃稳定性为 1d。 A。 1.2.3 测定 LD催化活性浓度的起始试剂溶液 称量 0.0990g丙酮酸一钠盐 ,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶于约 6mL水中; ——转移至 25mL容量瓶中; ——将容量瓶和水平衡至 20℃ ; ——加水至容量瓶的校准刻度线(20℃ )。 最终配制的溶液中丙酮酸一钠盐的浓度为 36。 00mmol·L1。 该溶液 2℃ ~8℃稳定性为 1d。 A。 1.2.4 LD储 存液的稀释(使用前进行)示例 A。 1.2.4.1 在 10.0mL酶试剂稀释液中加入 0。 050mL LD储存液 ,充分混匀。第一步的稀释比例是 1 : 201。 A。 1.2.4.2 将步骤 A。 1.2.4.1中 的 0.050mL最终溶液加人到 10.0mL酶试剂稀释液中,充分混匀。 第二步的稀释比例是 1:zO1。 第一步和第二步总稀释比例是 1:40401。 注:所用LD储存液催化活性浓度不同于上述步骤时,稀释度不同,需要对稀释因子(F洫u“。n)进行各自调整。 17 Ws/T353-2011 A。 2 测定条件 A.2.1 最终完全反应混合物的浓度 见表 A.1。 表 A。 1 LD催 化活性浓度测定最终完全反应混合物的浓度 三羟甲基氨基甲烷[TⅡs彐 pH(37℃) 7.65=± 0.o5a L天冬氨酸 240mm°l· Lˉ l 0.18mmol·L1 5’ 磷酸吡哆醛 o.1mm°I· Lˉ l 与反应混合液体积比分 0.083 3 (1 : 12) R扩展不确定度(虑 =2)。 A。 2.2 LD催化活性浓度测定条件 见表 A.2。 表 A.2 LD催化活性浓度测定条件 37.0℃ ±o 1 ℃ 。 339nm±1nm" 10.00mm±0.01mma 读数(测定点) 扩展不确定度(汔 =2)。 A.3 测定步骤 A.3.1 试荆准备 将一份适当体积(约 0.4 2℃~8℃。 18 mL)的起始试剂在 37℃ 下平衡 ,为测定做准备。剩余的起始试剂保存在 Ws/T353-201l A.3.2 测定方法 按表 A。 3的顺序和量 ,将试剂和样本加人比色杯。 表 A.3 LD催 化活性浓度测定步骤 A.3.3 试剂空白 用 9g·Ll(154mmol·Ll)NaCl溶液代替 LD溶液测定试剂空白,按上述步骤进行操作。 A,4 计算 计算方法与 AsT催化活性浓度的计算方法相同。通过回归分析(最小二乘法)计算摩尔消光系数 随时间的改变Es"(min-】)]。 减去试剂空白率后 ,即 LD储存液稀释液的摩尔消光系数变化率。按公 式(A,1)计算储存酶溶液中 LD催化活性浓度 : LD st。ck=F×F由h“。n×(△A/△莎).D ⋯⋯¨ ⋯¨ ·¨⋯ ·¨⋯ ·¨⋯(A.1) 式中: LD对。ck ——储存酶溶液中 LD催化活性浓度 ,单位为微凯塔尔每升 (ukat·Ll)或单位每升 (U· Lˉl),单位 ukat.L】ˉ除以 lO00可得 mht·Lˉl,单位 U· Ll除以 1000 可得 kU·Lˉ !; F ——系数 ,等于 1905(在 339nm波长测定时 ,ε339(NADH)=630m2·molIˉ)贯 F汨v“⒐l —— LˉD储存液的稀释因子,本例中为 么0401, (△A/加 )LD——经过试剂空白率校正后的 LD储存液稀释液的摩尔消光系数变化率 ,单位为每秒 (s l)或每分(m1n )¨。 体 积 测 定 步 骤 2.000mL 反应液 平衡到 37℃ 0.200mL 步骤 A。 1.2.4配制的 LD稀释液 充分混匀 ,孵育 30s。 孵育结束时 ,比 色杯 中溶液温度应 达到 37℃ 0.200mL 起始试剂溶液充分混匀,等待 30s后,再连续监测 90s 的摩尔消光系数 Ws/T 353- 2ˉo11 附 录 B (规 范性附录) 测定储存酶溶液中 MD催 化活性浓度 B,1 测定试剂 B.1.1 辅助试剂 B.1.1.1 一水 5’ -磷酸吡哆醛(pyridoxa⒈5’ vho.spho血a0d,m°nohydrate,R5-D(GH1。06NP· H2o),相对 分子质量=265.2。 B。 1.1.2 草酰乙酸,游离酸(C4H405),相 对分子质量=132,07。 B.1.2 试剂制备 B。 1.2.1 测定 MD催化活性浓度的反应溶液 分别移取 10.0mL溶液 1、 0.20o mL5’-磷酸吡哆醛溶液、0.200mL溶液 3、 0.10o mL水,将 上述 溶液充分混匀、避光保存。该溶液 2℃~8℃稳定性为 1d。 B,1.2.2 测定 MD催化活性浓度的起始试剂溶液 称量 0.0317g草酰乙酸 ,将上述物质按以下步骤处理 : ——溶于约 40mL水中 ; ——转移至 50mL容量瓶中; ——将容量瓶和水平衡至 ⒛ ℃ ; ——加水至容量瓶的校准刻度线(20℃ ); ——将溶液在冰上冷却。 最终配制的溶液中草酰乙酸的浓度为 4.800mmol·Lˉ l。 该物质 2℃ ~8℃稳定性为 30min。 B,1.2.3 MD储 存液的稀释(使 用前进行)示 例 B。 1.2.3.1 在 10.0mL酶试剂稀释液中加人 0.050mL MD储存液 ,充分混匀。第一步的稀释比例是 1 : 201。 B.1.2.3.2 将步骤 B。 1.2.3.1中 的 0.050mL最终溶液加人到 10.0mL酶试剂稀释液中,充分混匀。 第二步的稀释比例是 1:201。 第一步和第二步总稀释比例是 1:40401。 注:所川MD储仃液ll化活性浓皮不 "刂 于卜述步骤时,稀释皮不 "刂 ,1∴;坠 对稀释闪了(F讪“⒗u〉进彳j符r丨讠j刂格。 B,2 测定条件 B.2.1 最终完全反应混合物的浓度 见表 B。 1。 参 数 指 标 三羟甲基氨基甲烷ET“s彐 80mm°l· Ll pH(37℃) 7.65-← 0.05a ⒈人冬纵酸 240mmol·Ll NADH 0.18mmol·Ll 5’ 磷酸吡哆醛 0,1mm°l· Ll 草酰乙酸 0.4mmol·Ll IJ反 应漉个液体积比分 0.083 3 (1 : 12) 扩展不确定度(汔 =2) Ws/T353- 2ˉ011 表 B,1 MD催 化活性浓度测定最终完全反应混合物的浓度 B,2.2 MD催 化活性浓度测定条件 见表 B.2。 表 B,2 MD催 化活性浓度测定条件 B.3 测定 B.3.1 试剂准备 将一份适当体积(约 0.4mL)的起始试剂在 37℃ 下平衡 ,为测定做准备。剩余的起始试剂必须保 存在 2℃~8℃。 B.3.2 测定步骤 按表 B.3的顺序和蚩 ,将试剂和样本加人比色杯。 参 数 指 标 温度 37.0℃ ±Ol℃。 波 长 339nm±1nm⒏ 带 宽 ≤ 2nm 光 径 10.00mm±0,01mm 孵育时间 延迟时间 测定时问 90 s 读数(测定点 ) ≥ 6 扩展不确定度(汔 =2)。 Ws/T353-2011 表 B。 3 MD催 化活性浓度测定步骤 B。 3.3 试剂空白 采用 9g·L¨ (154mmol·L¨ )NaCl溶液代替被稀释的MD原液测定试剂空白,按上述步骤进行 操作。 B,4 计算 计算方法与 AsT催化活性浓度的计算方法相同。通过回归分析(最 小二乘法)计算摩尔消光系数 随时间的改变Es (ˉmin-I)]。减去试剂空白率后 ,即 MD储存液稀释液的摩尔消光系数变化率。按公 式(B.1)计算储存酶溶液中 MD催化活性浓度 : MD“。ck=F×Fm"。n×(AA/△莎)MD ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨¨⋯(B.1) 式中: MDˇ。ck ——储存酶溶液中 MD催化活性浓度 ,单位为微凯塔尔每升(ukat·Lˉl)或单位每升 (U· Lˉl),单位 ukat·Lˉl除以 1000可 得 mhⅡ Lˉ l,单位 U· Ll除以 1000 可得 kU·Lˉ 1。 F ——系数 ,等于 1905(在 339nm波长测定时,ε339(NADH)=63om2·mol〗ˉ); FmuⅡ。l ——MD储存液的稀释因子,本例中为 40401氵 (△A/&)vIr,——经过试剂空白率校正后的 MD储存液稀释液的摩尔消光系数变化率 ,单 位为每秒 (s l)或每分(min l)。 反应液 平衡到 37℃ 步骤 B,1.2.3制 备的 MD溶液 充分混匀 ,孵 育 3