4.2微生物生长繁殖

null 微生物生长、繁殖 微生物生长、繁殖主要内容主要内容一、 微生物的生长繁殖的测定 二、 群体生长规律——生长曲线 三、 生长曲线在污水处理中的应用 一、 微生物的生长繁殖测定一、 微生物的生长繁殖测定基本概念： 生长 繁殖 发育微生物的分离和纯培养 微生物的分离和纯培养 微生物的混合培养：含有一种以上微生物的培养。 微生物的纯培养：指在实验条件下从一个细胞繁殖得到的后代。创造无菌环境创造无菌环境灼烧接种工具 无菌操作台 提供无菌空气 微生物的纯培养及分离微生物的纯培养及分离 （1）稀释倒平板法 （2）涂布平板法 （3）平板划线分离法 （4）稀释摇管法 （5）单孢子或单细胞分离法 （6）利用选择性培养基分离法 null1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释null1.稀释平皿分离法 a.倾注平皿分离法 b.涂布平皿分离法null2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法null3.单细胞（单孢子）挑取法3.单细胞（单孢子）挑取法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。 null单细胞挑取法接种针解剖镜……….. .. …null利用选择培养基 在培养基中加入某些化学物质或除去某些营养物质以抑制不需要微生物生长，而促进某种微生物的生长。 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。 null微生物纯培养分离方法的比较二、微生物生长繁殖的测定二、微生物生长繁殖的测定1.评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响； 2.评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果； 3.客观地反映微生物生长的规律；生长测定方法生长测定方法1.测定体积 2.称重法 3.测定碳含量 4.其它细胞体积堆积法细胞体积堆积法将细胞悬液装入毛细沉淀管内，在一定条件下离心，根据对机体积计算含菌量。也可将发酵液直接装入常用的刻度离心管，经过分离，得出沉淀体积推算出细胞重量。 细胞密度一般在1.05~1.1之间。干重测定法干重测定法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。 U形管培养法 U形管培养法 将霉菌自管的一端孔口接到管内的培养基上，经一定时间间隔测菌丝长度。 优点：试验时间可以很长且菌落不易污染。 缺点：与平皿法一样，不能测菌丝的总量，不易挑出菌丝和孢子作检查，且通气不良。 菌丝长度测定法菌丝长度测定法将霉菌接种在平板的中央，在一定的时间内测量菌落的直径或面积。对生长速度快的霉菌，可每24h测量一次；对生长缓慢的，可数日测量一次，直到菌落掩盖全皿为止。由此可求出菌丝的平均生长速度。 缺点是仅能测菌落的直径或面积，不能包括菌落的厚度和生长在培养基内的菌丝，所以不能反映菌丝的总量。 其它法其它法 氮 磷 DNA 与其群体的规模成正相关 RNA 产酸、产热、二氧化碳、氧耗等 null（1） 显微镜直接计数法 采用细菌计数板或血球计数板，显微镜下直接计数 （计算一定容积里样品中微生物的数量）。 特点:简便\快速.适用于单细胞微生物的测定. 但死活细胞不分,同时要求被测细胞悬液中不能存在容易与细胞混淆的颗粒. 繁殖测定null血球计数板null 每ml原液含菌数＝每小格平均菌数×400 ×1000 ×稀释倍数null 显微镜直接计数法缺点： 不能区分死菌与活菌；（ 染色） 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；（2）比例计数法 将待测细菌悬液与等体积的血液混合涂片，镜检。 （3）涂片染色法（3）涂片染色法 一般均匀涂布0.01ml样品于载玻片上，涂布面积为1cm2，染色后镜检，选择几个到十几个视野计算细胞数。用测微尺测出视野的直径，算出视野面积，然后用1cm2内的视野数乘每个视野中的细胞平均数，再乘以100（因为涂布样品量为0.01ml），即得每毫升菌液的含菌数。若原菌液含菌量大，需适当稀释，最后再乘以稀释倍数。 null 平板菌落计数法 对样品进行适当稀释 → 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖 → 肉眼可见的菌落 → 对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数 分为：混匀浇注法和涂布法 样品的菌浓应控制在9cm的培养皿上生长30~300个菌落为宜。nullnull 使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）同一稀释度三个以上重复,取平均值；每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液；样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数；要求：每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5 注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌菌落计数器菌落计数器3.液体稀释法3.液体稀释法 对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。4.电子自动计数器法4.电子自动计数器法电子自动计数器具有一个特制的有孔玻璃薄膜，当定量的菌悬液中的菌体高速通过小孔时，由于悬液与菌体的导电性不同，使小孔的电导下降，电阻强度明显增加，并形成一个脉冲，自动在电子记录尺标装置上。这样，一份已知体积的待测菌悬液，每一个菌体通过小孔时就产生一个脉冲而被记录下来。 特点：测定快速、精确。但菌悬液中应无其他碎片（电子计数器不能区别菌体与杂质）。 null5、比浊法 在一定波长下（600~700nm)，测定菌悬液的光密度，以光密度 (optical density, 即O.D)表示菌量。菌体不透光，在一定的浓度范围内，悬液中单细胞的数量与光密度成正比。 注意： 测量应在菌浓度与O.D成正比的线性范围内，否则不准 ； 培养基的成分和培养产物不能在选择的波长范围内有吸收（不适用于颜色甚或多细胞的微生物生长测定）。 nullnull生长繁殖测定方法分类null测定方法比较null微生物的生长规律 一、单细胞微生物的生长规律 在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线null 将 少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。 null生长曲线可分：延滞期对数期 衰亡期 稳定期 null1.延滞期 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。出现延滞期的原因 暂时缺乏分解和催化有关的酶 缺乏充足的中间代谢产物 产生诱导酶或合成有关的中间代谢产物迟缓期的特点迟缓期的特点 生长速率常数R等于零 细胞形态变大或增长 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性 合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶 对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感 影响延迟期的因素 影响延迟期的因素 （1）接种龄 接种龄即“种子”（inoculum）的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。 （2）接种量 接种量大，则延滞期短，反之则长 。一般采用1／10的接种量。 （3）培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。 （4）菌种遗传性 缩短延滞期的措施 缩短延滞期的措施 ①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； ②利用对数生长期的细胞作为“种子”； ③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； ④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。null2.对数期 以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加， 细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数期特点对数期特点a.细胞高速生长繁殖。因为这时养分充足，而排出的代谢废物还不足以影响生长繁殖； b.温度影响细胞的生长繁殖速度，接近最适生长温度则速度快； c.处于对数期前期的细胞对理化因素仍比较敏感，而且菌体大小均匀，单个存在的细胞占多数。因此在研究细菌的代谢和遗传特性时，使用这个时期的细胞较佳；d.用处于对数期后期的细菌接种合适的发酵培养基可以缩短延迟期。应用意义应用意义 ①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； ②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 ③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 ④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。 null在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时 间为代时(Generation time)。代时通常以G表示。 在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增 时间（Doubling time)。 生长数学模型dNdt＝μNN：每毫升培养液中细胞数 μ ：比生长速率，每单位数量细菌 在单位时间增加的量 t：培养时间 t1 – t0 0.639 G = —————— = ————— n m 繁殖代数（n） 繁殖代数（n） lgx2=lgx1+nlg2 生长速率常数（R） 生长速率常数（R） null例：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ B ），经4h （ t ）后增加到49，000，000（ b ）， 这样， n ＝ (lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G， G ＝ t / n 在本例中， G ＝4×60 / 12 ＝20min ∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。影响指数期微生物增代时间的因素 影响指数期微生物增代时间的因素 ①菌种： ②营养成分 ③营养物浓度 ④培养温度 null菌种营养物浓度 的影响营养物浓度 的影响培养温度 的影响培养温度 的影响3.稳定期3.稳定期特点 生长速率常数R等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体产量达到了最高点 。 细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物； 多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢； 有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。 null ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽； ②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜， 成因：获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施： 补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等 null4.衰亡期 细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。现象：衰亡期微生物的生理特征衰亡期微生物的生理特征a.细胞内颗粒更明显，出现液泡，细胞出现多种形态，包括畸形和衰退形； b.因细菌本身所产生的酶和代谢产物的作用而使菌体分解死亡； c.衰亡期与其它各期相比相对较长，其时限取决于细菌本身的特性及环境条件。生长曲线的分析生长曲线的分析 ① 微生物在对数生长期生长速率最快。 ② 营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起的培养条件的变化，是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因。 ③ 用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延迟期，加速进入对数生长期。 ④ 补充营养物，调节因生长而改变了环境 pH 、氧化还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长对数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。 ⑤ 对数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。 分批培养分批培养是指将菌体接入一定量的培养集中进行培养，最后一此性收获菌体或其代谢产物的培养方法。 特点： 系统是封闭的 培养环境不断变化：代谢产物增加、营养物减少。 null三、连续培养 连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物连续培养类型恒浊连续培养恒化连续培养nullnull连续发酵与分批发酵相比优点：缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化细菌生长曲线在废水处理中的应用细菌生长曲线在废水处理中的应用常规活性污泥利用稳定期的微生物 对数其生长繁殖快，代谢活力强，可大量除去废水中的有机物。但是根据恒化培养的特点，要求进水有机物浓度高，当然出水的有机物浓度也高；对数期生长旺盛，细胞表面粘液层和荚膜尚未形成，运动活跃不利于形成菌胶团。而利用稳定期的细胞可强化活性污泥的生物吸附能力、自我絮凝、聚合力强，在二次沉淀池中泥水分离效果好。乃至同一反应器内不同位置处细菌的生长状态也不同。 延时曝气法处理低浓度有机废水时用衰亡期 延时曝气法处理低浓度有机废水时用衰亡期 低浓度的有机物不能满足稳定期微生物的营养要求，处理效果欠佳。 所以，延时曝气法一般延长曝气8h以上，长的达24h。以延长水力停留时间，增大进水量，满足微生物生长要求。null连续生物处理中的细菌状态表 细菌的生长阶段应用举例特点迟缓期无连续化稳定操作中没有这一阶段对数生长期高负荷活性污泥法 (大部分区域)稳定期生物膜法常规活性污泥法 (大部分区域)衰老期污泥的厌氧消化1:0.4~0.8BOD.d- 细菌与降解BOD重量比1:0.4以下