醋酸甲羟孕酮单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

2．1 抗 MPA McAb的制备与纯化结果 2．1．1 抗 MPA McAb制备 结果 按照 1．20操 作 ，通过 MPA人工抗原合成 、BALB／c小 鼠免疫 与细胞融合、间接 ELISA和间接阻断 ELISA阳 性筛选和 5次有限稀释法克隆亚克隆获得 1株稳 定 分 泌 抗 MPA McAb 的 杂 交 瘤 细 胞 株 M68F9H9，分泌的抗 MPA McAb腹水效价可达 1：1×1O ，Ic 。值为 5．0 ng／mL，特异性良好，属 于 IgG1亚类 。 2．1．2 纯化抗 MPA McAb的鉴定结果 纯化 抗 MPA McAb的 SDS—PAGE鉴定 ：按照 1．2② 操作，分别将阳性杂交瘤培养上清(250／,g／mI )、 腹 水 纯 化 的 McAb(250 t~g／mL)、McAb腹 水 (250“g／mL)、腹水杂蛋 白进行 SDS-PAGE蛋 白 质纯度鉴定 ，结果见图 1。 1 M 2 3 4 115．1— 65．7— 44．6— 34．7 24．8— 18．3— 14．3—◆ 54．6ku 27．3ku M．蛋白质SD~PAGE分子质量标准 Protein molecular marker；1． MPA杂交瘤细胞培养上清 Hybridoma culture supernatant；2．纯化 的单克隆抗体 Purified anti—MPA McAb；3．腹水杂蛋白 Others protein in abdominal dropsy；4．未纯化腹水 Abdominal dropsy 图 1 MPA纯化抗体 SDS-PAGE鉴定结果 Fig．1 The SDs-PAGE identification results of purified anti-M PA M cAb 西 北 农 业 学 报 18卷 由图 1可知 ，纯化的 McAb(Line2)在电泳 图 上 27．3 ku和 54．6 ku左右的位置分别出现 IgG1 轻链(L)和重链 (H)，与未纯化腹水的总蛋白 (Line4)相比，已除去了(Line3)腹水中非抗体的 杂质蛋 白，明所收集的抗 MPA McAb具有 良 好纯度。 纯化抗 MPA McAb的 ELISA活性检测 ：按 照 1．2② 中操作，将纯化抗 MPA McAb(1 mg／ mL)分 10倍梯度稀释后进行间接 EI ISA 法，结 果见表 1。 表 1 纯化抗 MPA McAb的效价测定结果( ) Table 1 The indirect ELISA results of purified anti MPA MeAb(x) 1、 M ， PA M ． c ．Ab 释譬 照 吸光度 Th di0 。0 n o nti MPA Abs。rb )D 。 ) M cAb and controls 。 ⋯ ⋯“ l：1× 100 2．89l0 1：l× l04 2．8555 1：1× 1O 5 2．2810 l：1× l06 0．6865 1 ：1× 10 0．335O 1 ：1× 10s 0．1640 1 ：l× 109 0．1225 NC 0．077O PC 1．3150 注：NC表示生理盐水免疫小鼠阴性血清(1：5 000)；PC表示小 鼠 MPA阳性血清(1：5 000)。 Note：NC means serum sample from mice immunized with normal saline(NS)diluted in 1：5 000；PC means positive serum diluted in 1：5 000 contro1． 由表 l可知 ，纯化 McAb当 1：1×1O 稀释 时 OD㈣ 值仍大于阴性对照的2倍，因此纯化的 McAb的效价不低于1：1×10 ，同时表明纯化的 McAb的活性 良好。 2．2 间接竞争 ELISA模式的建立 2．2．1 间接竞争 ELISA反应模式的确立 按照 1．3的操作分别对抗 MPA McAb的阴性和阳性 对照、MPA—BSA 包被浓度 、酶标一羊抗 鼠 IgG浓 度、底物显色时间等进行优化，确立了间接竞争 ELISA反应模式如下：①包被：用 pH9．6的碳酸 盐缓冲液将 MPA—BSA按照 1：8000稀释，每孑L 100 L，4℃包被 12～16 h。②洗涤 ：用 pH 7．4 0．01mol／L PBST洗涤液洗板 5次后，拍干。③ 封闭：加入含 1％BSA 的 pH 7．4 0．01mol／L PBS (BS)每孔 200 I ，37。C封闭2 h，同②中方法洗涤 拍干后进行下步试验或者一20℃保存备用。④ 竞争反应：用样品稀释液精确配制 8O、4O、2o、4、 2、1、0．5、0．1 ng／mI 浓度 的 MPA标准物 ；在抗 体阴性孔和 MPA标准物零对照孔先加入 50 L 样品稀释液，在 MPA标准物对照孔先加入5O L 已配置的8O、40、20、4、2、1、0．5、0．1 ng／mL浓度 的 MPA标准物，检样孔加入 50 L待检样品；除 在抗体 阴性孔加入 100 I 1：1×10 稀释的 ND 单克隆抗体外，其他孔加入 1：5×1O 稀释的纯 化 MPA单克隆抗体，每孔 100 txI ，混匀后 37℃ 孵育90 min(每孔作平行对照)，同②中方法洗涤 拍干。⑤酶标一羊抗鼠IgG：加入 1：5000稀释的 酶标一羊抗鼠IgG(HRP—goat anti mouse IgG)，每 孔 100 L，37℃孵育 45 min，同②中方法洗涤拍 干。⑥显色 ．力Ⅱ人底物显色液 (TMB Work solu～ tion)，每孔 100 I ，37℃9阵育 10 min。⑦读判：加 1 mol／L H2SO4终止液(Stop solution)，每孔 5O L，立即在全自动酶标仪上450nm波长处进行扫 描测量(操作时间控制在 5 min以内)，保存结果 并进行分析 。 2．2．2 间接 竞争 EI ISA标 准曲线的绘制 按照 1．3确立的条件操作，分别精确配制 8O、6O、4O、20、 10、4、2、1、0．5、0．1、0．05、0．01 ng／mL浓度的 MPA 标准物 ，进行间接竞争 ELISA，结果见表 2。 表 2 不同浓度 MPA标准物间接竞争 ELISA检测结果( ) Table 2 The results of indirect competitive ELISA with different concentration MPA standard(x) 对照与MPA标准物浓堡八“ J 吸光度 The con ， cert ． rat ion M ． PA Ab 。rb D ) standard and controls 0．0950 0．1250 0．1955 0．2850 0．3725 0．4500 O．5960 0．6420 0．8400 0．8970 0．9345 0．9150 0．9735 0．0615 注 ：NC表 不 抗 体 阴 性 对 照 单 抗 。Note：NC means negative MeAb against NDV． 由表 2可知，所测 OD 随着浓度的 MPA 标准物浓度的减小不断增大，即OD 。 与 MPA 标准物浓度呈负相关；根据 EI ISA结果，添加 MPA标准物浓度一OD伽 值趋势线(图2)，按照 A／A。一logC法拟合标准 曲线进行回归分析(图 3)，标 准 曲线 回归 方 程 为 Y一 一 30．491X+ 胁∞ 4 2 L耋 川0 1期 韩雪清等 ：醋酸 甲羟孕酮单克隆抗体制 备及 El ISA检 测方 法的建立 67．712，R 一0．9771，并可估算出其 IC 。值为 3．8 ng／mI 。经反复测试 ，MPA浓度在 0．1～80 ng／ mI 范围时呈良好 的线性关系 。 ： 0． 、 o 0 ． 0． 0． 0． 0． MPA标准物 的浓度／(mg／mL1 图 2 间接竞争 ELISA A--浓度 曲线 Fig．2 A一(：0ncentl’ati0n tendency cure of indirect competitive EL1SA llU -＼ 7 5O " 3O lO 0 MPA标准物浓度对数OgO 图 3 MPA检测竞争 ELISA标 准曲线 Fig．3 Calibration cure of indirect competitive ELISA 2．3 间接竞争 E1JSA方法相关技术参数测定结果 间接竞争 EI IsA的灵敏度：按照 1．3确立的 ci—EI ISA反应条 件 ，随机 抽取 5块包 被备 用 的 El ISA板 ，挑选出 15个孑L，按确立 的反应条件进 行 MPA标准品零含量检测 ，结果见表 3。 所测出的 15个 OD值的平均值 z为0．9791， 标准差为 0．0421，z一2SD值为 0．8949，根据同时 检测的不同浓度 MPA标准物检测结果 (表 2)可 知，间接竞争 ELISA的灵敏度(最小检测 限量)在 0．1～0．5 ng／mI 之间，由图 2中方程式可计算出 灵敏度为 0．16 ng／mI 。 间接竞争 EI ISA 的特异性 ：根据已确立 的问 接竞争 EI ISA反应条件 ，按照 1．5进行特异性试 验，估算 IC 。值，判断各种药物与 MPA的交叉反 应性，交叉反应性 ( )一 IC 。(MPA)×100／IC 。 (其他兽药)。表 4表明，间接竞争 EI ISA与甲羟 孕酮、甲地孕酮交叉反应率分别为 100 和25 ， 与莱克多巴胺、克伦特罗、己烯雌酚的的交叉反应 率均小于 0．01 ，表明所建立的 EI ISA具有良 好特异性。 表 3 间接竞争 ELISA的灵敏度试验 结果(X) Fig．3 The sensitivity test results of indirect competitive ELISA(x) 孔 号及相 关项 目 The well N0．and iterns 吸光度 Absorbance(OD4 50 ) 表 4 间接竞争 ELISA特异 性试 验测定结果 Table 4 The specific test results of the indirect competitive ELISA 常见兽药 Veterinary drugs 半数抑制浓度交叉反应率／ ／(ng／mI ) The cross— IC50 reaction rate 2．4 间接竞争ELISA方法添加样品的检测结果 按 照 1．6中的操作 ，分别对人工添加了 MPA 的牛奶检样、饲料检样和牛 肉检样进行测试试验 ， 同时 以进 口试 剂 盒 Medroxyprogesterone Ace— tate EIA Kit(5131MPA1p[3]08．05)进行平行检 测 ，结果见表 5。 由表 5可知 ：两种检测方法 的检测结 果基本 一 致，MPA零浓度 添加试样全为阴性；肌 肉样品 中MPA检测回收率低于牛奶样品和饲料中的 MPA检测回收率，可能是由于在肌肉样品处理 过程中MPA的损失引起的；同时也可能存在基 质效应 ，与牛奶 、饲料样品的成份有一定 的关系 ； 间接竞争 EI ISA对样品检测结果 的回收率在 74．36 ～100．3O 之间，进 口试剂盒检测结果的 回收率在 71．O2 ～100．9O ，表 明了所 建立问 接竞争 ELISA的检测结果的准确性。 5 2 4 5 O O l 5 7 5 9 9； 9 l 1 9 州 蚴㈣ L L L ¨ D u M ∞ X 西 北 农 业 学 报 18卷 表 5 添加 MPA样品的测试 结果 Table 5 The detection results of spike samples MPA添加试样与浓度／(ng／mI ) MPA concentrati0n of different spike samples 进口试剂盒检测结果 间接竞争 EI ISA检测结果 The detection results by EIA kit The detection results by ci—ELISA 检测值／(ng／mL) 回收率／ 检测值／(ng／mL) 回收率／ Detection results Recovery rate Detection results Recovery rate 牛奶样品 Milk samples 0 5 10 40 饲料样 品 Feed samples 0 5 10 40 肌 肉样品 Muscle samples O 5 10 40 0 3．5512 7．8452 3O．4722 74．36 81．52 80．18 3 讨 论 3．1 ci-ELISA方法建立 欧盟的MPA激素污染事件再次给世界各国 政府敲响了食品安全的警钟，MPA已被很多国 家禁止用于食源性动物，中国相关部门给予了高 度重视，也进行了较多的相关抗体研究制备[1 。 但其研究内容多以抗 MPA多克隆抗体为基础， 目前国内外还未见以MPA单克隆抗体为基础相 关检测方法的报道。由于多克隆抗体常受到人工 抗原合成批次、免疫剂量、试验动物、免疫时间、免 疫血清储存时间等多种因素的干扰，很难提供标 准化的相关试剂，而单克隆抗体有望解决多克隆 抗体 的不 足。本研 究通过 MPA 人 工抗原 的合 成 ，进 行 抗 MPA McAb制 备 ，并 利 用 纯 化 的 McAb，建立了 MPA检测的 ci—EI ISA方法 。 3．2 抗 MPA Mcab的纯化 单克隆抗体的纯化是单抗在样品检测研究和 预防、诊断、治疗研究中应用的关键环节。硫酸铵 盐析沉淀法是目前报道较多的用于单克隆抗体纯 化的方法，由于硫酸铵盐析有效性 良好、pH 广 泛、溶解度高、溶液散热少和经济适用 ，但是硫 酸铵沉淀法纯化过程中的操作比较高，操作 过快有可能导致蛋 白失活，并且时间也 比较长，因 此本研究在对单克隆抗体亚类鉴定的基础上使用 Protein G Sephrose 4 Fast Flow亲和层析柱对单 抗腹水进行了纯化，并获得了理想的纯化单克隆 抗体，为 MPA的免疫学相关检测技术提供了材 料。 3．3 ci-ELISA方法技术指标 进行小分子物质残 留检测 的 EIA方法主要 包括间接竞争 ELISA法(抗原包被竞争 ELIsA) 和直接竞争 ELISA(抗体包被竞争 ELIsA)。目 前 国 外 生 产 的 MPA 检 测 的 EIA 试 剂 盒 (5131MPA1 p[3]08．05)是采用直接竞争 EL1sA 方法进行检测，其检测基础是兔抗 MPA多克隆 抗体 ，并且借助羊抗兔 IgG固定在 ELISA板上， 其 MPA最低检测限 (MRI )为 0．5 ng／mL，但是 由于抗体包被竞争 EI ISA需要制备酶标半抗原 (HRP—MPA)，制备 条件难 以控 制 ，效果也 不稳 定 ，并且影响 MPA 的反应原性和酶的活性。本 研究以纯化的 MPA单克隆抗体为基础，直接购 买酶标一羊抗 鼠 IgG，通过 对 MPA—BSA 包被 浓 度、酶标一羊抗鼠 IgG浓度、底物显色时间等竞争 反应条件进行优化，建立了 MPA检测的抗原包 被 ci—ELISA检测方法，其最低检测限(MRL)在 O．16 ng／mI ，线性检测 范围在 0．1～80 ng／mL (R 一0．9771)；与甲羟孕酮、甲地孕酮交叉反应 率分别为 100 和 25 ，与其他结构的常用残留 兽药没有交叉反应；在添加试样检测试验中，所建 立的 ci—EI ISA方法检测结果与进口试剂盒检测 结果相符，MPA回收率在 74．36 9，6～100．30 之 间，为中国自主知识产权的 MPA检测 EIA试剂 1期 韩雪清等：醋酸甲羟孕酮单克隆抗体制备及 EI ISA检测方法的建立 盒的组装生产奠定了基础。 参考文献： [1] 雷贞武，吴尚纯，RogerJ Garceau，等．预先咨询对妇女使用 醋酸甲孕酮避孕停用率的影响[J]．Chin J Obstet Gynecol， l997，32(6)：250—254 [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] KaunitaAM，RosenfieldA．Injectable contraception with de— po—medroxyproges—teroneacetate厂J]．Drugs，1993，6：857． Belsey E M．Vaginal bleeding patterns among women using one natural and eigth hormonal methods 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