SNT 2497.9-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第9部分：血清溶血素测定试验

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 犛犖／犜２４９７．９—２０１０ 进出口危险化学品安全试验方法 第９部分：血清溶血素测定试验 犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊— 犘犪狉狋９：犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊犲狉狌犿犺犲犿狅犾狔狊犻狀 ２０１００３０２发布 ２０１００９１６实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前　　言 　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分： ———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验； ———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验； ———第３部分：大型溞繁殖试验； ———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； ———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验； ———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； ———第７部分：小鼠耳肿胀试验； ———第８部分：腘窝淋巴结试验； ———第９部分：血清溶血素测定试验； ———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验； ———第１１部分：种系突变试验； ———第１２部分：单细胞凝胶电泳试验； ———第１３部分：荧光原位杂交试验； ———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； ———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验； ———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验； ———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验； ———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法； ———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验； ———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量； ———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验； ———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法； ———第２３部分：细胞器的分离实验方法； ———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法； ———第２５部分：体液免疫功能试验； ———第２６部分：巨噬细胞功能试验； ———第２７部分：流式细胞术检测凋亡； ———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； ———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。 本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７的第９部分。 本部分修改采用《毒理学实验方法与技术》中的免疫毒理学研究方法，其有关技术内容与上述方法 完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：张园、王利兵、王华、赵琢、于智睿、熊中强。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 Ⅰ 犛犖／犜２４９７．９—２０１０ ????? www.bzfxw.com ???? 进出口危险化学品安全试验方法 第９部分：血清溶血素测定试验 １　范围 ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了血清溶血素测定试验的术语和定义、试验原理、试验方法和试验结果。 本部分适用于半数溶血值测定法检测进出口危险化学品对绵羊红细胞所致小鼠溶血素生成的 影响。 ２　规范性引用文件 下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 ＧＢ１４９２４．１　实验动物　配合饲料通用质量标准 ＧＢ１４９２５　实验动物　环境及设施 ３　术语、定义和缩略语 ３．１　术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 ３．１．１ 溶血素　犺犲犿狅犾狔狊犻狀 经绵羊红细胞免疫动物后产生的抗体。 ３．２　缩略语 下列缩略语适用于本部分。 ３．２．１ 犛犚犅犆 绵羊红细胞　狊犺犲犲狆狉犲犱犫犾狅狅犱犮犲犾犾。 ４　试验原理 用绵羊红细胞（ＳＲＢＣ）免疫小鼠，然后将免疫活性细胞（小鼠脾脏Ｂ淋巴细胞）、ＳＲＢＣ和补体在液 相介质中进行反应。ＳＲＢＣ与抗体形成细胞所产生的ＩｇＭ 结合形成抗原抗体复合物，激活补体系统， 裂解ＳＲＢＣ而释放出血红蛋白，以分光光度计定量测定。所测值反映了抗体形成细胞产生抗体的功能。 ５　试验方法 ５．１　试验动物 小鼠，体重１８ｇ～２５ｇ。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。 ５．２　主要试剂和材料 ５．２．１　犛犚犅犆的制备 脱纤维防凝处理的ＳＲＢＣ，以ＮＳ洗涤２次，每次２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。弃上清液，制成ＳＲＢＣ悬 １ 犛犖／犜２４９７．９—２０１０ www.bzfxw.com 液，然后用血细胞计数板计数细胞，最后稀释成ＳＲＢＣ溶液１．５×１０８／ｍＬ。 ５．２．２　免疫小鼠脾细胞的制备 取上述稀释的ＳＲＢＣ，经尾静脉或腹腔内注射免疫小鼠（鼠龄８周～１０周），每只０．２ｍＬ。４ｄ后拉 颈处死，取出脾脏用含５％小牛血清的Ｈａｎｋｓ液清洗，去除脂肪和结缔组织。在２００目铜网上研磨，制 备单个脾细胞悬液，取滤液至试管内。加入含５％小牛血清的冷 Ｈａｎｋｓ液，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃 上清液，沉淀中加入４．５ｍＬ蒸馏水，反复吹打约４５ｓ以破坏红细胞，然后加入９％ＮａＣｌ０．５ｍＬ恢复等 渗状态。用含有５％小牛血清的Ｈａｎｋｓ液洗涤一次，计数，用 Ｈａｎｋｓ液调整细胞浓度为２×１０７／ｍＬ。 ５．２．３　补体的制备 新鲜豚鼠血清，用前经ＳＲＢＣ吸收后，用ＲＰＭＩ１６４０稀释。吸收处理的目的是为了减少补体介质 中非特异性溶血及不同豚鼠间的补体反应差别，因此使用前需要把豚鼠的血清进行处理。在新鲜的豚 鼠血清中加入经洗涤３次的压积ＳＲＢＣ，按血清液与ＳＲＢＣ体积比为５∶１加入。４℃吸收３０ｍｉｎ后， ３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸出的上清液即为ＳＲＢＣ吸收的豚鼠血清。临用前１∶１０稀释。 ５．３　试验步骤 在实验管中加入１ｍＬ脾细胞２×１０７／ｍＬ；对照管中加入１ｍＬｐＨ７．２的Ｈａｎｋｓ液。两管中同时 加入制备好的ＳＲＢＣ１ｍＬ，１∶１０稀释的补体１ｍＬ，充分混匀，置３７℃水浴１ｈ。取出，３０００ｒ／ｍｉｎ离 心５ｍｉｎ。 ６　试验结果 以７２１分光光度计４１３ｎｍ波长，测上清液中红细胞裂解释放出的 Ｈｂ量（以ＯＤ示）。 ２ 犛犖／犜２４９７．９—２０１０ ????? www.bzfxw.com ???? www.bzfxw.com 书书书 ０１０２— ９７９４２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 进出口危险化学品安全试验方法 第９部分：血清溶血素测定试验 ＳＮ／Ｔ２４９７．９—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．５　字数 ５ 千字 ２０１０年５月第一版　２０１０年５月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２０９２９　定价 １４．００ 元