基因工程制药-1

null基因制药基因工程制药第一节 基因工程基本概念第一节 基因工程基本概念一.基因工程的概念 从生物基因组中分离感兴趣的基因(或人工合成基因)，将之与载体基因在体外重组后，再将重组DNA分子转入适当的受体细胞，获得基因表达的产物。null基因工程的目的 ① 分离获得感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）二. 基因工程主要步骤二. 基因工程主要步骤1. 获得具有遗传信息的目的基因 从复杂的生物体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。null① 鸟枪克隆法（Shotgun Cloning） 提取细胞总DNA，酶切、连接至特定载体上，再转化到宿主细胞中进行扩增，以同源基因为探针，杂交获得目的基因。null“鸟枪法”提取目的基因的步骤 1.用限制酶将供体细胞DNA切成许多片段. 2.将许多DNA片段分别载入运载体. 3.通过运载体分别转入不同的受体细胞. 4.让供体DNA片段在受体细胞内大量增殖. 5.找出带有目的基因的细胞，并分离出目的基因. null② 人工合成法 ● 酶促法：提取编码基因的信息RNA（mRNA），逆转录酶作用下，合成互补DNA（cDNA）；DNA聚合酶Ⅰ作用下形成双链DNA。 ● 化学合成法：根据已知DNA的核苷酸序列，在DNA连接酶作用下，化学合成。 ● 聚合酶链反应（PCR）：先决条件是已知基因的核苷酸序列，并据此引物，进行目的基因的扩增。null2. 选择基因载体 目 的 ● 无合适载体协助，目的基因很难进入受体细胞； ● 欲保证目的基因繁殖，必需将它与载体连接。 载体定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 重要特点 能自我复制、并带选择性标记的DNA分子。null克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而设计的载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而设计的载体。null载体的选择能自主复制，具有高拷贝数； 外源DNA片段插入载体后，不得使载体的复制功能丧失； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定（筛选阳性克隆）； 有克隆位点（外源DNA插入点），即多个单一酶切位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。null常用克隆载体 ● 质粒 是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链DNA。具有自我复制能力，它的存在与否一般对细菌生存没有决定性影响。 ● λ噬菌体 是一种能感染大肠杆菌的病毒，其DNA中的1/3对噬菌体生长并非绝对需要，因此可被外源性DNA替代。同时，它可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量小于23kb。null常用克隆载体 ● 粘性质粒（Cosmid） 人工构建的、兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载体。克隆容量可达45kb。 ● 酵母人工染色体 20世纪80年代发展起来的大片段外源基因克隆体系，其克隆容量可达200~1000kb。载体特点载体特点● 至少有一个复制起点，可在一种生物体中自主复制。 ● 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 ● 至少应有两个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 ● 具有较小分子量和较高拷贝数。 注：前三个特点必不可少。遗传标记基因的作用遗传标记基因的作用● 指示外源DNA分子是否进入宿主细胞 可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr） 也可以是非选择性的（如lacZ） ● 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子 可以是选择性的（如TcS） 也可以是非选择性（如TcS，lacZα)，绝大多数为后者。 有的遗传标记基因可以兼任上述两项作用。 充任第一作用时，最好是选择性标记基因； 充任第二作用时，多采用非选择性基因。null 标记基因的种类 ● 抗性标记基因 可直接用于选择转化子，主要是抗生素抗性基因，如：Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr ● 生化标记基因 表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZnull常用遗传标记基因及其作用机制 ● 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。 四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 null常用遗传标记基因及其作用机制 ● 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。 Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。null常用遗传标记基因及其作用机制 ● 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S 亚基上，阻止蛋白质合成。 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。null常用遗传标记基因及其作用机制 ● 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。null常用遗传标记基因及其作用机制 ● β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β- 半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚 体后才有酶活； 该蛋白质分为α链和β链。前者负责四聚体装配，后者 具β- 半乳糖苷酶活性； 仅当两者都存在，才表现酶活性，称α-互补作用； 这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码； 为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)； 两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 null lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β- 半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β- 半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色； 外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。nullβ—半乳糖苷酶基因的优点   酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观； lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多 克隆位点）而不影响酶活性； 分别表达lacZα链、β链的基因，可使载体小 而容量大。质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性● 是细菌染色体外的、能自主复制的、环形双链 DNA分子。 ● R质粒——编码抗菌素抗性基因的质粒。 R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。null● 质粒DNA分子可以持续稳定游离于染色体外，但在一定条件下，又会可逆地整合到寄主染色体上，与染色体一起复制，并通过细胞分裂传递到后代。 ● 质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。质粒的拷贝数质粒的拷贝数● 质粒拷贝数 —— 某种质粒在一个细菌细胞内的数目。 ● 根据寄主细胞中质粒拷贝数，将质粒分类为： —— 严紧型复制质粒（拷贝数少，1-5个） —— 松弛型复制质粒（拷贝数多，10-200个） 作为载体的质粒应该是松弛型的。null普通型载体 ● 至少有一个以上的克隆位点 ● 两个标记基因：一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。 ● 用途: 基因文库的构建;外源DNA扩增。 ● 例子: pBR322 和 pUC 载体。pBR322载体pBR322载体● 分子量较小，为4363bp，利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。 ● 具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。 ● 具有较高拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大方便。pUC18和pUC19pUC18和pUC19● 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。 ● 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用-互补原理进行蓝白筛选。 ● 多克隆位点区（MCS） 由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。 pUC18和pUC19载体pUC18和pUC19载体null载体容量 M13mp载体 <4 kb 细菌质粒载体 <10kb λ载体 <23kb cos质粒载体 <48kb P1载体 <95 kb pYAC载体 ∽1000 kbnull3. DNA分子重组 在体外，目的基因与载体DNA分子连接。 null发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 同源重组null4. 将重组DNA分子导入宿主细胞 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之同步增殖。 受体细胞：原核细胞（大肠杆菌、链霉菌） 真核细胞（酵母细胞） 导入方法：转化、转导，等。 null转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 null转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。null5. 鉴定带有目的基因的克隆 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA的宿主细胞。 针对不同的表达产物，采用特定的活性测定方法。 null6. 目的基因的扩增及获得表达产物 使宿主细胞在新的遗传背景下增殖，并实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 null重组DNA技术操作过程可形象归纳为