鸡卵黄抗体Fab’的制备及鉴定

2010年 2月 第 23卷 第 2期 J Med Post~a，Vo1．23，No．2，February，2010 鸡卵黄抗体 Fab 的制备及鉴定 邹 强，李敏惠，杨淑霞，何建荣，刘 阳，李腾飞，常 山 · 133· 论 著 (基础研究) 【摘要】 目的 鸡卵黄抗体(immunoglobulin Y，IgY)的活性片段Fab 免疫原性低，可口服用于预防胃肠道感染。文中 制备并鉴定 IgY Fab 片段。 方法 采用 胃蛋白酶水解法制备 Fab ，对酶与 IgY混和质量比、pH值、酶解时间进行优化；采 用 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—polyacrylamide gel eleetrophoresis，SDS—PAGE)及 Western blot对酶解产物进行鉴定。 结 果 胃蛋白酶：IgY的质量比为 1：40，缓冲液 pH 4．2，酶解时间9h的条件下，可得到无 pFc片段的特异性抗体Fab 片段。 结论 获得制备 IgY Fab 的最佳条件，得到的Fab 产量高、纯度高，特异性强，是规模化制备特异性 Fab 片段的良好的实验 方法 。 [关键词】 鸡卵黄抗体；酶解；Fab 【中图分类号】 R392．11 [文献标志码】 A 【文章编号】 1008—8199(2010)02-0133-04 Preparation and identification of Fab fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y ZOU Qiang ，LI Min．hui ，YANG Shu．xia ，HE Jian．rong ，LIU Yang ，LI Teng—fei ，CHANG Shan。 (1．Department ofImmunology，2．Experiment Centerfor Scientific Research，3．Department of Orthopedics，The Fimt Affiliated Hospital，Chengdu Medical College，Chengdu 610081，Sichuan，China) [Abstract] Objective Fab ，the active fragment from chicken egg yolk immunoglobulin Y(IgY)，is characterized by low antigenicity and can be used orally to prevent gastrointestinal tract infection．This study was to prepare the active Fab fragment and identify the target product． Methods We prepared Fab fragments by digestion of the pepsin，optimized the quality—ratio of enzyme to IgY，pH value and the time of digestion，and determined the purity and specificity of the products by SDS—polyaerylamide gel electro— phoresis(SDS—PAGE)and Western blot，respectively． Results The optimal quality—ratio of pepsin to IgY was 1：40。the optimal pH value of buffer was 4．2，and the time of digestion was 9 h at 37℃ ．Th is condition led to complete digestion of the pFc fragments． 1eaving only the Fab fragments． Conclusion Th e optimal condition was achieved for the preparation of the Fab fragment，under which high—yield，high—purity and high—specificity Fab fragm ents were successfully produced． [Key words] Egg yolk immunoglobulin；Enzymolysis；Fab 0 引 言 鸡卵黄抗体(immunoglobulin of egg yolk，IgY)是 鸡卵黄中存在的免疫球蛋白，是由鸡血液中的 IgG 基金项目：四川省科技厅重点应用基础研究(05JY029-083) 作者单位：610081成都，成都医学院免疫学教研室[邹 强(医学博 士)]，科研实验中心(李敏惠、杨淑霞、何建荣、刘 阳、李 腾飞)，第一附属医院骨科(常 山) 通讯作者：常 山，E—mail：changshancmc@tom．tom 转移至卵黄中对子代产生具有保护性作用的抗体。 其结构与哺乳动物的 IgG相似，性能却更加稳定，具 有较强抵抗热、酸、碱的能力_l-2]。 IgY蛋白经胃蛋白酶水解可得到分子质量更小 的鸡卵黄抗体特异性片段 Fab 。在相同条件下， Fab 的活性可保持 IgY原始活性的 70％以上 ]。 Fab 还能更好地抵抗 胃酸屏障，因此更适宜采用 口 服活性抗体这一简便途径来有效预防胃肠道感染。 而且 Fab 具有更低的免疫原性和更高的稳定性等 · 136· 3 讨 论 医学研究生学报2010年 2月 第 23卷 第2期 J Med Postgra，Vo1．23．No．2．February。2010 在 pH4．2的条件下，胃蛋 白酶水解哺乳动物 IgG可得到两个抗原连接点的 F(ab ) ，水解 IgY 时可生成单价的 Fab 。我们以本实验室纯化的 IgY免疫球蛋白为基础，采用胃蛋白酶水解法制备 鸡卵黄抗体特异性片段 Fab 。IgY经胃蛋 白酶消 化后裂解为 Fab 段和 pFc段，其中 Fab 段具有完全 抗体特异结合抗原的活性。利用在 胃蛋 白酶存在 条件下，pFc稳定性小于 Fab 的特性，延长消化时 间，使 pFc片段进一步被消化降解为无功能活性的 小分子片段，仅保留单一的 Fab 片段，使 Fab 可进 一 步纯化，有效保障了临床应用。 酶解体系中pH值、质量比和消化时间是影响 Fab 片段得率和纯度的 3大关键因素。本实验显 示的Fab 最佳制备条件是：乙酸钠缓冲液 pH值为 4．2，胃蛋白酶与 IgY质量比例为 1：40，酶解时间为 9 h。经 SDS．PAGE鉴定，制备的 Fab 酶解后条带单 一 、清晰，分子质量为45 000，色谱结果显示其 纯度高达91％；并且通过 Western blot明其 具有 良好 的抗原特异性。用 胃蛋 白酶消化制备 Fab 操作简单、快速，产量大、纯度高、特异性强，并 且成功地降解了pFc段，是规模化制备特异性 Fab 片段的良好实验方法。 【参考文献】 [1] Deigan T，Kelly J，Alwan A，et a1．Comparative analysis of meth· ods of pufific~ion of egg yolk immunoglobulin[J]．Food Agric Im— munol，2000，12(1)：77-85． [2] Dong D，LiuH，XiaoQ，et a1．Affinity purificationof egg yolkim- munoglobulins(IgY)with a stable synthetic ligand[J]．J Chrom- atogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，870(1)：51-54． [3] 孙淑清，段春燕，胡彦涛，等．抗轮状病毒 IgY和 Fab 的分离与 纯化[J]．化学工业与工程，2006，23(4)：317019． [4] Akita EM，Nakai S．Neutralization of enterotoxigenic Escherichia CO- li Heat—labile toxin by chicken egg yolk immunoglobulin Y and its antigen-bind fragments[J]．Food Agfic Immunol，1998，10(2)： 161．172． [5] 萨姆布鲁克J．分子克隆实验指南[M]．第3版．北京：科学出版 社 ，2002：1713-1721． [6] Akita EM，Nakai S．Production and purification of Fab fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y(IsY)[J]．J Immunol Methods，1993，162(2)：155—164． (收稿日期：2008—11-03； 修回Et期：2009-02-02) (责任编辑：齐 名； 英文编辑：罗永合) 《国医论坛》征订启事 《国医论坛》(双月刊)是面向国内外公开发行的中医药学术期刊。创刊24年来，一直把张仲景学说研 究作为办刊特色，辟有张仲景学说研究、经方实验录、老中医经验、学术探讨、研究生论坛、临床研究、临床报 道、中西医结合、医学护理、实验研究、中药天地、医苑百花、文献综述等栏目。本刊理论与实践并重，普及与 提高兼顾，是从事中医药临床、教学、科研人员及大中专院校学生的良师益友。 本刊2010年定价不变，仍为每期4．00元，逢单月20日出版。国内统一连续出版物号 CN41—1110／R， 国际连续出版物号 ISSN1002—1078，国内邮发代号36—100，国际邮发代号 BM4417。欢迎广大新老读 者及时到当地邮局(所)订阅，错过订期者可直接向本刊编辑部索购。本刊地址：河南省南阳市卧龙路 1439 号。邮编：473061 电话：0377—63529058 电子信箱：gylt1986@126．COB