鲜汁对皮肤黑色素抑制作用的实验研究

·60· 湖北中医杂志 2008年第30卷第3期 益母草鲜汁对皮肤黑色素抑制作用的实验研究 王理呜 (湖北中医学院，湖北武汉430065) 关键词：益母革鲜汁；黑素瘤细胞；酪氨酸酶；药理学研究 中图分类号：R285．是 文献标识码：A 文章编号：1000-0704(2008)03-0060一02 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的主要限速酶。其活力 可控制黑索生成量¨-2】。它不仅决定黑素合成的速率。还 是黑素细胞成熟的特征性标志H“】。益母草虽为妇科良药， 但在美容方面的功效也早有记载。笔者选择益母草鲜汁进 行实验研究，以验证其对皮肤黑色素的抑制作用。 1 材料 1．1 实验材料及设备 自制益母草鲜汁(4mg／m1)。B—16黑察瘤细胞株， 由武汉大学细胞库提供。 主要试剂有：RPMll640(美国cmco)；TYPSIN(胰 蛋白酶)(美国SIGMA)；小牛血清(北郊农场)；噻唑蓝 (美国SIGMA)；二甲基亚砜(北京北化精细化学公司)；L 一多巴，蘑菇酪氨酸酶(Sigma公司产品)；其他试剂均为 市售分析纯。 主要设备有：高速低温离心机(美国SIGMA)；净化 工作台(天津)；酶标仪(美国B10RADmodel560)；C02 恒温孵育箱(法国JousJl)；倒置显微镜(Nikon)；UV一 2401分光光度计(日本岛津)；AE240电子分析天平(梅 特勒一托利多仪器有限公司)。 1．2试剂制剂及药物剂量 1．2．1RPMll640培养基：用双蒸水配制，按200∥ml和 100∥m1分别加入青霉紊及链霉素，充入CO：调节pH值 至7．2—7．4，0．22tun微膜孔过滤。分装，4T：贮存。 1．2．20．25％胰蛋白酶：用pH7．6无血清1640配制， ’0．22p,m微膜孔过滤。 1．2．3Mar液：37℃水浴中溶解于0．01ml／L。pH值7．4 的PBS，浓度为5mg／ml，0．22斗m微膜孔过滤，置棕色小 瓶中，4℃保存。 1．2．4药物计量换算，益母草鲜汁6．659／ml。高剂量：相 当于生药33mg／ml；中剂量：相当于生药的3．3mg／ml；低 剂量：相当于生药的0．33mg／'nd。 1．3 B一16黑素瘤细胞椿的培养H“】 B—16黑素瘤细胞株由武大细胞库提供(CCTCC)的 原代细胞株用0．25％胰蛋白酶消化2rain。然后加入 RPMl640培养基，用吸管反复吹打，分别加入卡氏培养瓶 置PCS一100电脑C细胞培养传代培养，一般2—3天传一 代，细胞汇合作以后制备成细胞悬液备用。 1．4．Mar法检测B—16细胞株的生长抑制率 1．4．1检测原理：活细胞的线粒体中琥珀胶氢酶能使外源 性的Mar还原为难容的蓝色结晶物，而死细胞无此功能， DMSO(二甲基亚砜)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶 联免疫检测在490rim波长外测空吸收值，可间接地反映活 细胞数量。 1．4．2检测步骤：①0．25％胰酶消化培养的B一16细胞 株，将10％CSTRPMll640常规培养基配成的细胞悬液以7 ×10’个／孔种入96孔板(长满时约有105个细胞)培养 板周边的孔不加人细胞，防止有边缘效应，另留空白孔调 零。以只加细胞不加中药作空白对照。⑦待细胞贴壁后， 分别加入含中药33mg／'ml(30∥孔)3孔，3．3m∥ml (30td／孔)3孔和0．33mg／ml(30t,,J／孔)3孔，培养基培 养48h后弃培养基。③吸弃旧液。加PBS洗1次，加入 Mar溶液20ml，37℃，5％co,继续培养4h，终止培养。 ④吸净孔内培养液弃之，加入DMSO100∥孔，振荡10rain， 使结晶充分溶解。⑤在酶联免疫检测仪上(490nm波长)测 定各孔吸光度OD值(OD值与活细胞成正比)。⑥根据公式 计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=(空白对照组OD 值一实验组OD值)／空白对照组OD值X100％。 1．5酪氨酸酶活性测定p“’ 1．5．1取pH6．8磷酸缓冲液2m1．分别加入0．075％L一多 巴反应液2ml与蘑菇酪氨酸酶2rid(200u)混合，25℃孵 育10min，置分光光度计上300—600m扫描，结果在 453nm处有最大吸收蜂。 1．5．2取益母草鲜汁2ml(4mg／m1)，加入0．075％L一多 巴反应液2ml与蘑菇酪氨酸酶2ml(200u)混合，立即置 分光光度计于453nm处测吸收值。连续记录20min。得生 成物一时间曲线。以pH6．8磷酸缓冲液作为空白对照。A。 为pH6．8磷酸缓冲液作为待测液时的吸收度值，A誓为 (益母草鲜汁2ml+0．075％L一多巴反应液2ml4-蘑菇酪氨 酸酶2mO一(0．075％L二多巴反应液2ml+益母草鲜汁 2ml+pH6．8磷酸缓冲液2m0。 3实验结果 3．1益母革鲜汁对B—16细胞株抑制率的影响(见表1) 万方数据 2008年第30卷第3麓 潮寇孛豢杂恚 ·6l· 毒性中药的炮制 羞迎超，韩俊流 (湖爿l：省罗田县人民医院，湖北罗田438690) 关镶谲：毒性中筠；炮制；分类 中国分类号：R283．3 文献标识码：A 文鬃编号：1000一0704(2008)03-0061一02 中药之毒，其说自古即有兰：一日“凡药皆有毒也”， 。集毒药以供医攀”，此乃广义之毒，泛指一切药物；=日 8蓊叛治病，囡毒为能，掰灞毒，鞋气曝之偏奄”，就指药 物龙偏性；三翻。神农尝酉革⋯⋯一日而遇七十毒”。<神 农本摹经>将中药分成上、巾、下三熬，。下晶之药不可 久瑕”。劐专捂狻义之毒。瑗今入船所宵有毒中药鄹此。 毒性中药，本为医家龙招矢，虽具毒性，却熊疗痼治 覆，起沉拯垂。然。永能载舟，赛戆覆痔”，中药用之褥 当锈猿显其摄，不然赠为絮稚浅。所戳冁床应用中药强调 辨证配伍、合理炮制、严格控制用法用量。篡中合理炮制 去毒、降毒笼显重要。 、 吉入对子毒性中药魑耧酶研究。著述鼹多，积豢了率 富的经验。以陈嘉谟为代表的<炮制药歌>，虽经后世学 者豹掺歪补充、掺亚，仍存有许多不足之处。笔者试就毒 性孛药的斑镪原瑾迸符分类、探毒鼋，保证毒德中药盼瞌床 应用安全有所助益。 '毒性巾翡豹分类 稷据药物有效戚努等毒性戚分之闷的美系。可将有毒 囊'瓣器-16壤Jg橡捧囊辜戆影麓(i圭1) 与对照细胞缀比较，·P《O．001。 结果显示，箍母蕈鲜汁对B—16蒜索瘤细胞的增殖有 抑制作用。 3。2益母葶鲜冲时酪氨酸秘活蛀的影崎(霓表2) 囊2对爵蠹馥薅活性的影响 (i±·) 望型 。 堕些蹩堡 空白组 ’0。3981毒O。0841 勰母草鲜汴缀 o-2178毒o．0692‘ 与空白组比较，·P≮o．001。 垂表2翔，豢母摹攀汾组与空自组魄较有蹇度囊著性 差异，表明益母筚鲜汁对酪氨酸酶有较好的抑箭作阁。 4讨论 现代医学美容舞究表爨，益母草所窘豹铜、锰、韬等 雾静微量元素。在抗衰防瘸、益颜美容、延年蕴寿上具有 显蒋的功效。益母草所含的_益母草碱、水苏碱、月桂酸及 油酸等物质，能促进皮肤掰陈代谢，使波获得到充分营养， 交褥涪自润泽，对皮获起瑟嶷好耱营养傺毽作蔼。 本实验也证嗳，签母荤鬓津霹挪镧繇氮激臻活毪稀熬 一16黑索瘤细胞的增殖。从而起猁消除面黑、面斑和益颜 美容的作糟。 参考文藏： 【1】 尚靖，敖秉臣。刘义鬣，等．屯种增自中药在体外对酪蕉 酸赡的影响【J】．中国药学杂：敷，1995，30(11)：653． Kubol。YokokawaY。Kinst—Horil．Tyrminaseinhibito口form bolivianmedieinelplants【嚣。lNetProd，1995．58-739．‘ SmithB，蛳P，So．thereJ，et-1．Detselonofmehmomaeell． in州删bloodbymeansofreversetremerlptoseandpolym镁- ageehs／n玮td蚺【瓣．12mcet，1991，338(8777)：1227。 ZhangL。Y06hidaT。KuroiwaY．Stimulationofmelaninsynthe- ．i8耐B16一F10mousemelanomacellebybafalin【J】．Life Sel，1992。51：17． 许爱娥，王遂塞，瓣晓东，等．常震串蓊瓣鼹氨酸酶的激 活作用[J】．巾肇皮肤科杂志。1998，31(1)：48． 章静波。蔡有余．绷胞生物学实耀方法与技术【M】．北京：池 索簇辩大学。孛嚣镑纛医耪大学联合遗藏鏊，1997．57。 MoemannT．Rapideolorlmetrleassayforeelluargrowth●nd$Ⅷ卜 vivel：appliemion协proliferationandeytotoxieity唧[J】．J lmmunolMethods，1983，65：55． Nak蛳mtM．Shinodal。融uwatarlY，ella1．Arbutinincreases thepigmentation甜culturehumanmeinnoeytesth∞ughmeeha- nismsotherthantheinductionoftyresinaseactivity【J】．Pigment C罐lies．1鳄g，11l12． 1收稿日期：2007一05—10编辑：郑晓屏l ，j，J，J，j 1J 1J，J 泣 p H ≯ № p 泌 万方数据