14株致儿童猩红热A族_溶血性链球菌多位点序列分型

临床儿科杂志 第 29卷第 8期 2011 年 8月 J Clin Pediatr Vol．29 No．8 Aug ． 2011 A 族 β 溶血性链球菌（beta-haemolytic group A streptococcus isolates， GAS） 又称为酿脓链球菌 （Streptococcus pyogenes）， 是在世界范围内普遍存 在的以人类为主要生物学宿主的细菌性病原体， 不仅可以引起坏死性筋膜炎、 链球菌中毒休克综 合征、 咽扁桃腺炎、 脓疱病及风湿热等多种侵袭 性、 非侵袭性或免疫相关性疾病， 也是导致儿童 发生猩红热的细菌性病原体。 猩红热是一种儿童 常见呼吸道传染病， 曾是 19 世纪末期至 20 世纪 初期危害世界儿童健康的首要疾病。 随着抗生素 14株致儿童猩红热 A族 β溶血性链球菌多位点序列分型 梁云梅1，3 沈叙庄1 黄国英2 俞桑洁1 袁 林1 杨永弘1 1． 首都医科大学附属北京儿童医院（北京 100045）； 2． 复旦大学附属 儿科医院（上海 201102）； 3． 首都医科大学附属北京世纪坛医院（北京 100038） 基金项目： 国家 863 计划资助项目（No．2006AA02z417） 通信作者： 杨永弘 电子信箱： yyh66＠vip．sina．com 摘要： 目的 对 A 族 β 溶血性链球菌（beta-haemolytic group A streptococcus isolates， GAS）进行多位点序列 分型（multilocus sequence typing， MLST）。 方法 应用多聚酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）对来源于 2007 年北京和上海两地区分属于不同 emm 分型及其亚型、 且对大环内酯类抗生素高水平耐药的 14 株致儿童猩 红热 GAS的 7 对等位看家基因进行扩增， 并将目的基因产物测序， 然后将所测得的每对等位看家基因的基因序 列提交到 MLST 网站， 获得相应的由 7 对等位看家基因组成的等位基因谱， 最后将等位基因谱再次提交到 MLST 网站， 确定 GAS 临床分离株 MLST 序列分型（sequence type， ST）。 结果 St5240、 emm1．0 型及其亚型 GAS 等位 基因图谱为 4-3-4-4-4-2-4， 属于 ST28 型； emm4．0 型 GAS 等位基因谱为 5-7-8-5-15-2-1， 属于 ST38 型； emm12．0 型及其亚型 GAS 等位基因谱为 5-2-2-6-6-2-2， 属于 ST36 型； emm22．0 型 GAS 等位基因谱为 9-8-1-1-1-3-4， 属于 ST46 型。 结论 致 2007 年北京和上海两地区儿童发生猩红热的 14 株 GAS 分属于 ST28、 ST38、 ST36 及 ST46 四 个不同的克隆系。 [临床儿科杂志，2011，29（8）：739－742] 关键词： A 族 β 溶血性链球菌； 猩红热； 多位点序列分型； 大环内酯类抗生素 中图分类号： R725 文献标志码： A 文章编号： 1000－3606（2011）08－0739－04 Multilocus sequence typing of 14 group A streptococcus isolates from children with scarlet fever LIANG Yun-mei1，3， SHEN Xu-zhuang1， HUANG Guo-ying2， YU Sang-jie1， YUAN Lin1， YANG Yong-hong1 （1． Beijing Children’s Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100045， China； 2． Children’s Hospital of Fudan University， Shanghai 201102， China； 3． Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100038， China） Abstract： Objective To analyze beta-hemolytic group A streptococcus （ GAS） isolates using multilocus sequence typing （MLST） ． Methods In 2007， 14 GAS isolates of scarlet fever were collected from children in Shanghai and Beijing． All isolates had high-level macrolide resistance and belonged to different emm types and sub-types． Seven house-keeping genes of these isolates were amplified by PCR and sequenced． These sequences were sent to the MLST website for their isoallele sequences to identify their sequence types． Results St5240， emm1．0， and its subtype isolates had the same allelic profiles （4-3-4-4-4-2-4） which belonged to ST28， the emm4．0 isolate （5-7-8-5-15-2-1） belonged to ST38， the emm12．0 and its subtype isolates （5-2-2-6-6-2-2） belonged to ST36， and the emm22．0 isolate （9-8-1-1-1-3-4） belonged to ST46． Conclusions Fourteen GAS isolates obtained from children with scarlet fever in Shanghai and Beijing were found to belong to different clone of ST28， ST36， ST38， and ST46． （J Clin Pediatr，2011，29（8）：739－742） Key words： beta-hemolytic group A streptococcus； scarlet fever； multilocus sequence typing； macrolide resistance doi：10．3969 ／ j．issn．1000－3606．2011．08．011 ·论 著· 739· · 临床儿科杂志 第 29卷第 8期 2011 年 8月 J Clin Pediatr Vol．29 No．8 Aug ． 2011 的应用， 儿童猩红热的发病率于 20 世纪 70 年代 初期得到了有效控制。 但近年来， 伴随着 GAS 感 染所致严重侵袭性疾病的发病率在欧洲一些国家 明显增加， 儿童猩红热的发病率也在一些国家呈 现上升趋势 [1，2]。 对细菌病原微生物进行分型是流 行病学研究的重要方法， 本研究应用 PCR 技术对 来源于北京和上海两地区分属于不同编码成熟 M 蛋白基因 （ encoding mature M protein gene， emm gene）分型及其亚型的 14 株致儿童猩红热 GAS 进 行多位点序列分型 （multilocus sequence typing， MLST）。 1 资料与方法 1．1 菌株来源 14 株 GAS 来源于 2007 年北京和上海两地区 猩红热儿童的咽拭子， 其中 6 株来源于北京地区， 8 株来源于上海地区。 经既往研究证明这些菌株分 属于 St5240、 emm1．0 型及其亚型 ， emm4．0 型 ， emm12．0 型及其亚型和 emm22．0 型， 并对大环内 酯类抗生素高水平耐药， 均携带 ermB 耐药基因， 现为 cMLSB结构型耐药[1]。 具体情况见表 1。 1．2 试剂 链球菌分组诊断试剂购自英国 OXOID 公司。 多聚酶链反应中所用相关试剂购自大连宝生物工 程有限公司。 螯合树脂型 DNA 提取试剂购自北京 赛百盛基因技术有限公司。 1．3 PCR引物 所有 PCR 引物由北京奥科生物技术有限责任 公司合成。 MLST分型中的 7对 GAS等位看家基因 包括葡萄糖激酶（glucose kinase， gki）， 谷氨酰胺 传递蛋白（glutamine transporter protein， gtr）， 谷氨 酸消旋酶（glutamate racemase， murI）， DNA 错配修 复蛋白（DNA mismatch repair protein， mutS）， 酮醇 基转移酶（transketolase， recP）， 黄嘌呤磷酸核糖基 转移酶（xanthine phosphoribosyl transferase， xpt）和 乙酰辅酶 A 乙酰转移酶 [acetyl coenzyme A（acetyl- CoA）acetyltransferase， yqiL]引物序列。 gki-up： 5’-GGCATTGGAATGGGATCACC-3’ gki-dn： 5’-TCTCCTGCTGCTGACAC-3’ gtr-up： 5’-GAGGTTGTGGTGATTATTGG-3’ gtr-dn： 5’-GCAAAGCCCATTTCATGAGTC-3’ murI-up： 5’-TGCTGACTCAAAATGTTAAAATG- ATTG-3’ murI-dn： 5’ -GATGATAATTCACCGTTAATGTC- AAAATAG-3’ mutS-up： 5’ -GAAGAGTCATCTAGTTTAGAAT- ACGAT-3’ mutS-dn： 5’ -AGAGAGTTGTCACTTGCGCGTT- TGATTGCT-3’ recP-up： 5’ -GCAAATTCTGGACACCCAGG-3’ recP-dn： 5’ -CTTTCACAAGGATATGTTGCC-3’ xpt-up： 5’ -TTACTTGAAGAACGCATCTTA-3’ xpt-dn： 5’ -ATGAGGTCACTTCAATGCCC-3’ yqiL-up： 5’ -TGCAACAGTATGGACTGACCAG- AGAACAAGATGC-3’ yqiL-dn： 5’ -CAAGGTCTCGTGAAACCGCTAA- 740· · 临床儿科杂志 第 29卷第 8期 2011 年 8月 J Clin Pediatr Vol．29 No．8 Aug ． 2011 AGCCTGAG-3’ 1．4 DNA提取 将已经鉴定的 14 株 GAS 菌株接种在含 5％脱 纤维羊血的大豆胰蛋白胨琼脂培养皿上， 并置于 37℃含 5％ CO2 的恒温箱中孵育 24 h。 应用北京 赛百盛公司的鳌合树脂型 DNA 提取试剂盒获取 DNA 染色体组， 作为 MLST 分型中 7 对看家基因 PCR 扩增的 DNA 模板。 DNA 的提取过程严格按 照北京赛百盛公司螯合树脂型 DNA 提取试剂的要 求进行。 1．5 应用 PCR技术扩增 7对看家基因 1．5．1 50 μl PCR 反应体系 DNA 模板 2 μl， 10 mmol ／ L 的上下游引物各 2 μl， 5 U ／μl Taq DNA 聚合酶 0．4 μl， 10 × Taq 缓冲液 （含 2．5 mmol ／ L MgCl2） 2．5 μl， 2．5 mmol ／ L 的 dNTP 4 μl， 双蒸水 34．6 μl。 1．5．2 PCR 反应条件 94℃预变性 1 min， 94℃变 性 1 min， 55℃退火 1 min， 72℃延长 1 min， 共 30 个循环。 1．5．3 PCR 扩增产物测序 5 μl PCR 扩增产物与 1 μl 加样缓冲液混匀， 应用含 GoldViewTM核酸染 料的 1．5％琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物（电泳条 件为 0．5 × TBE 缓冲液， 120 V， 30 min）， 紫外灯 下或自然光线下拍照， 获取图像采集实验结果， 所有 PCR 阳性扩增产物送北京奥科生物技术有限 责任公司。 应用 3730 DNA 测序仪以最初 PCR 扩 增引物作为测序引物对每一个等位看家基因片段 的基因序列进行双向测序。 1．6 MLST序列分型 将每株 GAS 测得的 7 对等位看家基因扩增片 段的 DNA 序列与 GAS MLST 网站 （http： ／ ／ www． mlst．net）上公布的相应等位基因进行比较， 从而获 得该菌株的等位基因谱， 再次将等位基因谱提交 到 MLST 网站， 确定其 MLST 序列分型（sequence type， ST）。 2 结果 St5240 型 、 emm1．0 型及其亚型 GAS 的等位 基因谱相同， 为 4-3-4-4-4-2-4， 为 ST28型； emm4．0 型 GAS 的等位基因谱为 5-7-8-5-15-2-1， 为 ST38 型 ； emm12．0 型及其亚型 GAS 的等位基因谱相 同， 为 5-2-2-6-6-2-2， 为 ST36 型； emm22．0 型GAS 的等位基因谱为 9-8-1-1-1-3-4， 为 ST46 型 。 见 表1。 3 讨论 GAS 感染性疾病的发生与其分型密切相关， 不同分型的 GAS 可导致不同的疾病。 细菌性病原 体分型方法包括经典的表型分型（如血清分型、 生 物分型及耐药基因分型等）、 分子分型（如限制性 片段长度多态性分型、 脉冲凝胶电泳分型、 小片 段限制性内切酶分析、 核糖分型及多位点酶电泳 等）及基因序列分型（如 emm 分型及 MLST 分型）。 表型分型和分子分型方法都存在不同程度的不适 合生物进化、 种系发生、 种群遗传研究或试验结 果很难在不同实验室之间进行比较等缺点， 这限制 了其在全球范围内的应用。 而 emm和 MLST两种基 因序列分型方法因其不仅可以提供准确直观的数据 资料、 分辨率高、 简便易行、 重复性好及可分型性 强， 而且能通过互联网将新发现的区域性实验结果 与既往的不同地区实验结果进行比较等优点， 被广 泛地应用于细菌性病原体的流行病学研究。 emm 分型是根据编码 GAS 成熟 M 蛋白基因高 变区核苷酸序列的特异性进行基因序列分型技术， 在一个 emm 基因序列中， 如果前 160 个碱基对中 ≥ 95％与参照基因一致被认定为同一 emm 序列分 型。 与传统血清学分型比较， emm 分型具有准确、 快速的特点， 各实验室间可方便、 快捷地通过网 络进行资料比较。 目前已有 170 余种 emm 分型及 750 种 emm 亚型的 GAS， 但 emm 分型方法不能揭 示各分离菌株之间的亲缘关系。 MLST 是 1998 年由 Maiden 等提出的、 通过对 DNA 内部 7 对看家基因核酸序列的直接分析来定 义的基因序列分型技术， 每个独一无二的看家基 因片段的大小约为 450 bp， 且与 7 对等位看家基 因中的其他 6 对等位看家基因均不相同， 7 对等位 看家基因的位点按照特定顺序共同构成一个基因 图谱， 决定一个分离菌株的基因序列分型。 不仅 能够在同一细菌菌属中比较不同高致病毒力细胞 系， 也能够使一种菌属与其他不同细菌菌属相鉴 别， 并且能够利用互联网在全球范围内鉴定和追 踪细菌性病原体毒力因子的传播及抗生素抵抗流 行株， 是一种微生物分子流行病学及种群基因结 构研究的新方法。 本研究结果表明， 2007 年来源于我国北京和 上海两地区、 不同 emm 分型及其亚型、 并对大环 内酯类抗生素高水平耐药的 14 株致儿童猩红热 GAS 分属于 ST28、 ST38、 ST36 及 ST46 四个不同 741· · 临床儿科杂志 第 29卷第 8期 2011 年 8月 J Clin Pediatr Vol．29 No．8 Aug ． 2011 的克隆系。 由于四个不同的克隆系测序分析的 7 个基因位点同源性差， 提示 ST28、 ST38、 ST36 及 ST46四个不同的克隆系之间没有密切关系。 与既往研究结果比较显示， 在我国可见 ST28、 ST38、 ST36 及 ST46 四个不同克隆的 GAS， 而 ST46、 ST52、 ST39 及 ST28 多见于欧洲国家 [3]； 在 我国流行的 emm4．0 型 GAS 属于 ST38 型 ， 在美 国、 尼泊尔及西班牙等国家流行的 emm4．0 型 GAS 属于 ST39 型， 提示我国 emm4．0 型 GAS 的流行株 与上述国家 emm4．0 型 GAS 的流行株来源不同 [4，5]。 ST28、 ST38、 ST36 及 ST46 四种克隆系 GAS 在全 球范围内广泛分布。 在我国， 这四种克隆系 GAS 均可见于猩红热、 咽扁桃体炎及健康儿童炎扁桃 体部， 但以 ST28 及 ST36 两种克隆系为主要流行 菌株； 在尼泊尔， ST28 型克隆系是主要流行菌株 之一 ， 但仅见于皮肤感染 ； 而在美国 ， ST28、 ST38 及 ST46 三种克隆系 GAS 可导致咽扁桃体炎 及严重侵袭性感染 [1，5，6]。 可见不同克隆系在不同地 区具有不同的流行趋势。 在我国流行的四种克隆 系 GAS菌株对大环内酯类抗生素呈现高水平耐药， 耐药率高达 95％以上， 其耐药机制是携带了 ermB 耐药基因， 表现为 cMLSB结构型耐药 [1]。 在美国对 大环内酯类抗生素呈现高水平耐药的克隆系仅以 ST36 型 GAS 为主， 耐药率仅为 6％， 其耐药原因 是由于该克隆系的 23S rRNA 发生了变异 [7]。 而在 葡萄牙 ST46 型 GAS 虽然也携带 ermB 耐药基因， 表现为 cMLSB 结构型耐药， 但 ST28 型携带 mefA 耐药基因， 表现为 M 型耐药， 其耐药率却不因为 携带 ermB 耐药基因的菌株减少， 携带 mefA 耐药 基因的菌株增加而发生变化 [3]。 即使同一克隆系， 在不同地区的耐药情况也存在明显差异。 综上所述， MLST 是一种有效的细菌病原体分 型手段， 联合应用表型分型、 分子分型及基因序 列分型， 对 GAS 进行多中心的流行病学研究更具 有价值。 参考文献： ［1］ Liang Y， Shen X， 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