上海地区儿童化脓性链球菌的红霉素耐药基因研究

生堡筐銎盘查21Q§笠!!旦筮21鲞筮!!翅￡婪!』!!!壁!堕!!盟!!!虫!笪!QQ§!y!!：211堕!：!! 上海地区儿童化脓性链球菌的红霉素 耐药基因研究 叶颖子 俞蕙 曾玫 王晓红 朱启镕 王传清 ·671· ·临床论著· 【摘要】目的 了解上海地区化脓性链球菌对红霉素的耐药情况及耐药基因谱的特点。方法 2004年11月至2006年6月经复旦大学附属儿科医院传染病门诊诊断为猩红热的患儿，其咽拭子 培养分离获得100株化脓性链球菌。应用PCR及序列分析法检测红霉素耐药基因mefA、ermA、 ermB在该批菌株中的分布规律及其与红霉素耐药性的关系。结果上海地区化脓性链球菌的红霉 素耐药率为98％，克林霉素耐药率为95％，两者耐药性的一致率为97％。100株菌株中含ermB基 因的化脓性链球菌94株，占所有菌株的94％，对红霉索耐药率为loo％；含mefA基因的化脓性链 球菌16株，占所有菌株的16％，对红霉素耐药率为100％；100株菌株中未发现ermA基因。5株菌 株未发现ermB基因及mefa基因，其中2株对红霉素敏感，3株对红霉素耐药。mefa基因单独阳 性的菌株仅占1％。结论 上海地区化脓性链球菌对红霉奈普遍具有较高耐药率，且与克林霉索存 在较严重的交叉耐药。ermB基因是决定上海地区化脓性链球菌对红霉素耐药的重要基因。 【关键词】链球菌感染；红霉素；基因，细菌；抗药性，细菌；上海 ErythromycinresistantgenesinStreptococcuspyogenesofchildreninShanghaiYEYing-zi，yUHui， ZENGMei，WANGXiao-hong，ZHUQi—rong，WANGChuan—qing．DepartmentofInfectious Diseases，TheChildren7sHospitalofFudanUniversity，Shanghai200032，China Correspondingauthor：ZHUQi-rong，Email：qrzhu@shmu．edu．cn [Abstract]ObjectiveTounderstandtheerythromycinresistancerateandtheerythromycin resistantgenespectruminStreptococcuspyogenesstrainsisolatedinShanghai．MethodsTheOut- patientchildrenwhowerediagnosedwithscarlatinalintheChildren’SHospitalofFudanUniversity fromNovember2004tOJune2006wereenrolledand100strainsofStreptococcuspyogeneswere isolatedbypharyngealswabculture．ThedistributionsofermA，ermB，mefAgenesweredetermined bypolymerasechainreaction(PCR)amplification．TherelationshipbetweenermA，ermB，mefA genesanderythromycinresistancewerealsoanalyzed．ResultsTheerythromycinandclindamycin resistanceratesofStreptococcuspyogenesinShanghaiwere98％and95％，respectively；the concordaneerateofthesetWOdrugswas97％．Among100strainsofStreptococcuspyogenes，94 strains(94％)containedermBgene，with100％oferythromycinresistancerate．Sixteen(16％) containedmefAgene。with100％oferythromycinresistancerate．ermAwasnotdetectedinallthe 100strains．TheermBandrnefAgeneswerenotfoundin5strains，amongwhich，2weresusceptible toerythromycinand3wereresistanttoerythromycin．Only1％ofisolateswasmefagenesingle positive．ConclusionsThereisahigherythromycinresistancerateofStreptococcuspyogenesstrains isolatedinShanghai，andtheCROSSresistancetOclindamycinishigh．TheermBgeneisimportant erythromyeinresistancedeterminantsofStreptococcuspyogenesinShanghai． [Keywords】Streptococcalinfections；Erythromycin；Genes，bacterial；Drugresistance， bacterial；Shanghai 作者单位t200032上海。复旦大学附属儿科医院感染科 通信作者：朱启铅．Email：qrzhu@shmu．edu．cn 万方数据 化脓性链球菌是人类呼吸道感染的重要致病 原，主要引起儿童咽炎、扁桃体炎，在儿童细菌性 咽炎中最常见，感染率为15％～30％u]。该细菌 感染可导致急性肾炎及风湿性疾病等并发症，早 期、有效的抗生素治疗可减少并发症的发生。青 霉素和其他B一内酰胺类抗生素对化脓性链球菌仍 保持敏感，被推荐为治疗化脓性链球菌咽炎的首 选药物，而对B-内酰胺类抗生素过敏的患者，大环 内酯类抗生素是最主要的替代治疗药物比]。近年 来，由于抗生素选择压力及菌株突变等原因，化脓 性链球菌对大环内酯类药物产生耐药且耐药趋势 迅速上升。面对严重的耐药现况，充分了解该细 菌对大环内酯类的耐药机制。有助于更好地指导 临床治疗。本研究旨在了解上海地区的耐药状 况，探讨其对红霉素的耐药机制，为上海地区化脓 性链球菌感染的经验用药提供依据。 材料与方法 一、材料来源 2004年儿月至2006年6月在复旦大学附属 儿科医院传染病门诊诊断为猩红热的患儿，取其 咽拭子培养分离出的化脓性链球菌100株。 二、方法 1．细菌采集方法：咽拭子标本接种于哥伦比 亚血平板及巧克力平板(上海祥和科学技术有限 公司)，在35℃，体积分数为0．05的COz温箱培 养24～48h。 2．细菌鉴定方法：血琼脂平板上为口型溶血 性链球菌菌落，触媒试验阴性，0．04U杆菌肽试 验阳性(英国Oxoid公司)，CAMP阴性。革兰染 色阳性，成链状排列。APISTREP生化反应系统 提示肺炎链球菌，8一溶血链球菌血清分型试验诊断 为A群(英国Oxoid公司)。 3．药物敏感试验：抗菌药物敏感性试验采用 琼脂扩散法。A群p型溶血性链球菌药物敏感试 验培养基采用MH培养基(英国Oxoid公司)添加 5％脱纤维羊血。培养环境为35℃培养24h。所 有药物敏感纸片均为英国Oxoid公司产品。结果 判断参照美国临床与实验室委员会2004至 2006年制订的标准[3-53。 4．细菌DNA提取：挑纯培养菌落置入 0．5mL离心管(内预置200I￡g／L蛋白酶K溶液 200ttL)，56℃水浴2h后，95℃水浴10rain， 15000r／min离心30S，离心半径为8cm。上清 液即为基因检测的模板液，一20℃保存备用。 5．基因检测：均采用PCR法，各种靶基因引 物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR 扩增体系P1、P2引物各0．5“mol／L，三磷酸脱氧 核糖核苷各200mmol／L，KCl10mmol／L， (NH4)2S048 mmol／L，MgCl22mmol／L，Tris— HCI(pH9．0)10mmol／L，NP40的体积分数为 0．005，牛血清白蛋白2×10～mmol／L，TaqDNA 聚合酶1U。总反应体积20肚L，其中模板液5 pL。热循环参数(PCR产物长度>500bp)为：93 ℃2min；93℃60s，55℃60s，72℃60S，35个 循环；72℃5min。余均为：93℃2rain；93℃30 s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min。 产物经2％琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子 相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、 靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市 克隆遗传技术研究所提供。 表1各靶基因引物序列和目的产物长度 基因 引物序列 产物长度 (bp) ermAP1：5'-AGGTTATAATGAAACAGAAA一3’208 P2。5'-GCATGACATAAACCTTCATC一3 7 ermBP1：5'-GAAAAGGTACTAAACCAAATA一3’617 P2：5’一AGTAACGGTACTTAAATTGTTT-3’ w，AP1：5'-ACTATCATTAATCACTAGTG3’347 P2：5'-TTCTTCTGGTACTAAAAGTG-3’ 6．基因序列分析：PCR产物行基因序列分 析。并与标准株比对。 结 果 一、化脓性链球菌的耐药情况 100株菌株中，对红霉素耐药的为98株．耐药 率达98％，对克林霉素耐药的为95株，耐药率达 95％。两者耐药性的一致率为97％。 二、化脓性链球菌的耐药基因构成情况 100株菌株中16株检出mefA基因，阳性率 为16％，见图1；100株菌株中94株检出ermB基 因，阳性率为94％，见图2。经测序比对确定为 ermB基因，见图3；100株菌株中未检出ermA 基因。 万方数据 生堡佳銎瘟盘查2QQ!生!!旦箜；!鲞筮!!塑生丛!』!!!!!!墅!：丛!!!婴照!!!!!：Y!!：2i：丛!：!!．673． 三、各耐药基因的阳性率与菌株耐药性的关系 含ermB基因的94株菌株对红霉素耐药率为 100％。含mefA基因的16株菌株对红霉素耐药 率为100％。仅有1株检出mefA基因而未检出 errnB基因的菌株对克林霉素敏感而对红霉素耐 药。有5株菌株未检出以上任何一种基因，其中2 株对红霉素敏感，另3株对红霉素耐药。 注：l、2．w弘基因阳性标本；3．阴性对照；4．阳性对照；~L标记物 图l me，A基因阳性化脓性链球菌的聚合酶链反应电泳图 注；1、2．ermB基因阳性标本；3．I{Ij性对照；4．阳性对照；帆标记物 田2 ermB基因阳性化脓性链球菌的聚合酶链反应电泳图 讨 论 近十多年来随着分子生物学技术的发展，了 解到化脓性链球菌对大环内酯类抗生素耐药主要 有两大机制¨]：①核糖体靶位修饰：主要由化脓性 链球菌产生甲基酶使50S核糖体亚基23SrRNA 中2058位点腺嘌呤残基发生双甲基化，从而阻止 大环内酯类抗生素与其结合，甲基酶由errnB基因 和erl'llTR(即ermA的亚类)编码。结合位点改变 可导致菌株对14、15、16元环的大环内酯类发生 中度或高度耐药，同时对林可霉素类、链阳霉素B 发生交叉耐药。这种由et'TYl基因介导表达的耐药 表型被称为MLSB表型，可以是构建型(cMLSB)， 通常由ermB基因介导；也可以是诱导型 (iMLS。)，通常由ermA基因介导，少数由ermB 基因介导。通常为高水平耐药。②泵出机制：由 mefA基因编码，介导表达的耐药表型为M型，即 对14、15元环的大环内酯类耐药，通常为低水平 耐药。 本研究发现，ermt3和mefA基因是导致上海 地区化脓性链球菌对大环内酯类抗生素耐药的重 要基因，阳性率分别为94％和16％，尤以ermB基 因为著。这与欧洲多国包括西班牙、希腊、德国以 mefA基因为主以及中国台湾ermB与mefn各 占半数的情况均有所不同[7-10]。表明上海地区该 细菌对大环内酯类抗生素的耐药性往往是高水平 耐药。l临床上选用林可霉素类抗生素同样有较大 可能会导致治疗失败。化脓性链球菌对克林霉素 和红霉素的耐药性具有较高一致性(97％)，而克 林霉素是林可霉素类的代表性抗生素之一，表明对 M埝类抗生素存在较严重的交叉耐药，同时也进 一步证实erm基因存在明确表达。 尽管mefA基因单独阳性的菌株只占l株， 但在体外实验提示，对红霉素呈低水平耐药的菌 株，临床用大剂量大环内酯类抗生素治疗仍可能 导致治疗失败。虽然本研究发现mefA基因阳性 率仅16％，但是由于药代动力学和药效学的差异， 所有大环内酯类抗生素清除低水平耐药株的能力 并不相同n川，因此对mefA基因介导的耐药株感 染患者做l临床治疗试验研究，将更客观地评估各 种大环内酯类耐药对治疗结果的影响。 本研究中有3株菌株未检出任何前述3种耐药 基因，但仍然对红霉素耐药，提示化脓性链球菌的耐 药性还可能有其他机制参与。最近，有报道在体外筛 选的大环内酯类耐药突变株中未能检测到erm和 mef基因，但发现这些突变株的23SrRNA和(或)核 糖体蛋白L4及L22存在突变，其主要突变部位在 23SrRNA的V区2058、2611位核酸碱基[12|。 综上所述，本研究结果表明上海地区化脓性 链球菌对红霉素的耐药性已非常严重，应引起足 够重视，尽量减少大环内酯类抗生素的用量。20 世纪70年代，日本每年大环内酯类抗生素的用量 为165～170吨，当时化脓性链球菌对该类药物的 耐药率>60oA，El本政府采取了干预措施减少抗 生素的用量，到20世纪80年代，每年大环内酯类 抗生素的用量降至65,--．85吨，其耐药率也相应下 万方数据 ·674· 生堡擅銎瘟盘查；QQ!堡!!旦筮；!鲞筮!!期￡!也』!!!!坐墅!：盟!!!尘!!!；!!§!Y!!：!!!盥!：!! 图3 ermB基因阳性的化脓性链球菌的ermB基因测序图 降至22．2％[13]。因此合理使用抗生素及控制细菌 耐药是我们的目标和任务。 参考文献 [1]BisnoALAcutepharyngitis．NEnglJMed，2001．344：205— 211． [23BisnoAL，GerberMA．GwahneyJMJr，eta1．Practice guidelinesforthediagnosisandmanagementofgroupA streptococcalpharyngitis．InfectiousDiseasesSocietyof America．ClinInfectDis，2002．35：113—125． [3]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute．2004．M100一 S14，Performancestandardsforantimicrobialsusceptibility testing．fourteenthinformationalsupplement．Clinicaland LaboratoryStandardsInstitute，Wayne，PA． [4]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute．2005．M100一 S15，Performancestandardsforantimierobialsusceptibility testing．fifteenthinformationalsupplement．Clinicaland LaboratoryStandardsInstitute，Wayne．PA． [5]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute．2006．M100- S16．Performancestandardsforantimicrohia[susceptibility testing．sixteenthinformationalsupplement．Clinicaland LaboratoryStandardsInstitute．Wayne．PA． [63LeclercqR．Mechanismsofresistancetomacrolidesand lineosamides：natureoftheresistanceelementsandtheir 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化脓性链球菌耐大环内酯类抗生素的研究现状[期刊论文]-中华儿科杂志 2005(8) 12.Yan JJ;Liu CC;Ko WC Molecular analysis of group A streptococcal isolates associated with scarlet fever in southern Taiwan between 1993 and 2002[外文期刊] 2003(10) 13.Bisno AL Acute pharyngitis[外文期刊] 2001(3) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhcrbzz200811008.aspx