急性肾功能衰竭病理模型的设计和方法

急性肾功能衰竭病理模型的和方法 邓虹珠 　金伟军 　廖锡麟 　何永佳 (第一军医大学南方医院 　广州 510515) 摘要 　综述了急性肾功能衰竭 (ARF) 病理模型的原理及实验研究方法。着重介绍了大鼠甘油致 ARF 模型、犬去甲肾上腺素 ARF 模型、夹闭犬肾动脉引起的 ARF 模型、汞剂引起的动物 ARF 模型和庆 大霉素的 ARF 模型等 5 种方法。 关键词 　急性肾功能衰竭 　动物模型 　　急性肾功能衰竭 (以下简称 ARF) 是危急 重症 ,属中医“癃闭”、“关格”、“肾风”等范畴。 其临床表现主要是小便点滴而下 ,或点滴全无 , 往往突然发作起病。治疗乃根据“腑以通为用” 的原则 ,着重于通。实证宜清湿热、散瘀结、利 气机而通水道 ;虚证宜补脾肾、助气化而达到气 化得行则小便自通的目的。改善少尿、氮质血 症和肾小管坏死是治疗 ARF 药效学的主要研 究内容。 1 　药效学研究的设计和方法 111 　对疾病动物模型的治疗作用试验 11111 　常用动物模型 ①大鼠血红蛋白尿 ARF 模型 　以甘油肌 内注射 ,24h 后即有尿素氮升高、少尿或无尿等 类似人的 ARF 症状。 ②犬去甲肾上腺素 ARF 模型 　雄性犬麻 醉后以适当剂量的去甲肾上腺素经一侧肾动脉 连续滴注 ,引起肾血流量急剧下降 ,同侧输尿管 收集的尿量也相应减少等出现的一系列肾衰症 状。 ③夹闭犬肾动脉引起的 ARF 模型 　麻醉 犬用外科手术暴露左侧肾动脉并夹闭 1h ,引起 急性缺血性 ARF。 ④汞剂引导起的动物 ARF 模型 　以适当 剂量的氯化汞 ( HgCl) 肌注或静脉注射家兔 ,也 可皮下或静脉给予大鼠 ,1～2 天内引起肾小管 损伤坏死 ,出现急性肾功能障碍的一系列变化。 ⑤大鼠氨基糖甙类抗菌素 ARF 模型 　大 剂量氨基糖甙类抗生素 (多用庆大霉素) 给大鼠 腹腔注射 ,通过影响肾小管上皮细胞膜脂代谢 及抑制线粒体的能量代谢造成肾小管损害 ,引 起尿量改变及尿蛋白和尿素氮升高等急性肾衰 症状。 除了上述一般采用且公认较好的模型外 , 还有大鼠变性血红蛋白 ARF 模型和硝酸双氧 铀 ARF 模型 ;针对内毒素所致肾衰的注射大肠 杆菌引起的 ARF 模型[1 ] ;针对某些氨基酸对肾 功能损伤的赖氨酸模型[2 ]以及顺铂引起的非少 尿性 ARF 模型[3 ]等。鉴于人的 ARF 病因及发 病机制不同 ,临床表现也有所不同 ,在评价药效 时可根据药物适应症及特点选择适当模型。 11112 　观察指标 1111211 　生化指标 　①血肌酐 (BUN) 、血清尿 素氮 (Scr)水平 ; ②24h 肌酐、尿素氮总排出量 ; ③24h 肌酐清除率 ; ④血电解质如 K+ ,Na + 等 水平。 1111212 　尿常规检查 　①24h 总尿量 ; ②24h 尿蛋白和管型等。 1111213 　病理形态学检查 1111214 　其它可供的指标 　①血清总蛋 白和白蛋白 ; ②对主要以损害肾小管功能的模 型如庆大霉素 ARF 模型可选择 NA G酶及溶菌 酶作为观察指标反映肾小管损伤的严重程度。 11113 　方法学评价 1111311 　ARF 模型较多 ,从机制上可分为缺 血性和中毒性。一般认为大鼠血红蛋白尿性 ARF模型二种机制均有 ,接近于人的创伤性 ARF ,特别是挤压综合征。在此模型早期 ,肾血 ·84· 　中国中药杂志 　1998 年第 23 卷第 1 期 　 管阻力增加 ,肾血流量减少 ,肾皮质区域的血管 重度收缩 ,如所试药物可能有类似于异搏定的 降低肾血管阻力、增加肾血流量等作用 ,采用此 模型较适当。本模型所用动物价廉易得 ,方法 简便 ,病变稳定。如需在一定时间内做动态观 察 ,也可用家兔 ,以便多次采血检查。此模型是 新药药效评价较常用的模型。 1111312 　家犬去甲肾上腺素及家犬夹闭肾动 脉引起的 ARF 模型均属于缺血性 ARF ,机理相 同 ,所用动物相同 ,费用较高并要求熟练掌握手 术技术。但此模型病程稳定 ,成功率高 ,且取血 容易 ,可连续取血检测 ,动态观察了解药物作用 时间与特点。所试药物如可能有明显增加肾血 流量保护肾细胞或清除自由基作用 ,用此模型 易有阳性结果。 1111313 　经典的汞剂引起的 ARF 模型 ,属于 中毒性 ARF 模型。其特点为方法简单易行 ,病 变较稳定 ,可用家兔、大鼠、小鼠等做模型动物。 1111314 　近年来对于肾小管间质病变的研究 越来越受到人们的重视。虽然原发性肾小管疾 病的发病率低于肾小球疾病 ,但是随着多种抗 生素、非甾醇类抗炎药及一些抗排异药物的大 量应用 ,继发性小管间质病变的发生率有升高 趋势。在 ARF 中急性肾小管功能不全或坏死 约占 75 %[4 ] 。庆大霉素 ARF 模型是近年研究 较多的模型 ,主要通过影响肾小管上皮细胞膜 脂代谢及抑制线粒体的能量代谢等 ,造成肾小 管细胞损伤而引起的 ARF。如所试药物是治 疗由以上原因引起的以肾小管损伤为主的 ARF ,在评价药效时用此模型较为合适。 112 　其它试验 11211 　辅助试验 　对能反映解除主症有作用 的其它实验 ,如药物的利尿作用、血管扩张作 用 ,对高血钾、酸中毒的控制作用 ,以及药物对 其它原因引起的氮质血症的影响 ,均可酌情选 用。 11212 　作用原理研究 　如用游离水清除率、截 流分析实验、肾小管微穿刺技术等探讨药物作 用部位和功能。这些内容对于了解新药特点很 有意义 ,但在中药新药申报时并不是必需的资 料。 113 　阳性对照组 阳性对照药可选用药典收载或正式批准生 产的中药或西药 ,选用药物应力求与新药主治 相同、功能相似 ,剂型及给药途径相同。 2 　动物模型建立方法 211 　大鼠血红蛋白尿 ARF 模型 21111 　原理 　肌肉注射甘油后 ,大鼠肾血流减 少 ,肾小管内皮细胞肿胀 ,增大了肾血管阻力 , 血管节段性坏死 ,外膜纤维化 ,血管自身调节功 能丧失 ,导致肾小球滤过率下降。另外 ,肾小球 及肾小管周围纤维蛋白沉积 ,血管内血瘀积 ,血 栓形成 ,血流不畅 ,导致肾小球滤过率下降 ,肾 小管坏死。 21112 　操作方法 　采用体重 150～250g 雄性 大鼠 ,置于代谢笼中。记录正常饮水量及尿量 , 用药前禁水 24h。选体重减轻并有脱水的大鼠 以 50 %甘油按 10ml/ kg 分别在两侧后肢肌肉 注射。大鼠自由进食和饮水 ,一般于 2h 后出现 血红蛋白尿 ,48h 形成稳定模型 ,2～5 日内可进 行实验。 21113 　造模成功的指标和药物疗效观察 　24h 尿量较对照组明显减少 ,尿蛋白明显升高 ; BUN ,Scr 明显增高 ,血清总蛋白减少 ; 血清 K+ ,Na + 增高 ;病理学检查可见明显的肾小管 病变。 所试药物的药效可根据用药后对以上指标 的改善来评价 ,结果进行组间比较 ,统计学处理 采用 t 检验。百分比相差 10 %且差异有显著 意义时 ,可判断阳性。 21114 　注意点 　个别大鼠可在肌注甘油后 ,肾 脏损害过重而死亡。禁水 24h 后体重减轻明 显、脱水严重的大鼠选作实验动物效果较好。 21115 　举例 　精芪口服液对肾衰大鼠肾功能 的影响[5 ] 2 . 1 . 5 . 1 　方法 　受试药物精芪口服液 ,动物采 用雄性 SD 大鼠 ,体重 150～200g。按上述方法 制成 ARF 大鼠并于 48h 后进行试验。 2 . 1 . 5 . 2 　动物分组及药物剂量 　空白对照组 : 正常 SD 大鼠。肾衰模型对照组 :每只肾衰大 ·94·　中国中药杂志 　1998 年第 23 卷第 1 期 　 鼠 ig 生理盐水 1. 5ml/ d。地塞米松治疗组 :每 日 ig 地塞米松 0. 1mg/ kg。精芪口服液治疗 组 :每日 ig 精芪口服液 811ml/ kg。每组大鼠 10 只 ,每日给药 1 次 ,连续 4 天。每日同时收集每 只大鼠 24h 的尿量 ,进行尿蛋白定性 (醋酸加热 法)测定。给药 4 天后 ,全部大鼠在不麻醉的状 态下股动脉放血处死 ,采血测 BUN , Scr ,血清 总蛋白及血清 K+ 和 Na + 含量。结果用 t 检验 作组间比较。 2 . 1 . 5 . 3 　结果 ①尿量及尿蛋白定性 　结果见表 1。 表 1 　肾衰大鼠 4 天内的尿量 ml/ 24h 　 第 1d 第 2d 第 3d 第 4d 空白对照 13. 1 ±1. 3 (10) 14. 3 ±2. 7 (10) 13. 1 ±1. 8 (10) 14. 6 ±3. 0 (10) 肾衰模型 10. 1 ±3. 9 (7) 1) 9. 7 ±3. 3 (7) 2) 10. 6 ±2. 0 (7) 1) 9. 6 ±1. 0 (7) 2) 地塞米松 23. 4 ±12. 0 (10) 1) 21. 8 ±7. 5 (9) 2) 14. 3 ±3. 8 (9) 1) 14. 2 ±3. 9 (9) 2) 精芪口服液 34. 6 ±13. 4 (8) 2) 30. 0 ±14. 1 (9) 1) 21. 8 ±9. 6 (10) 2) 19. 7 ±9. 6 (9) 1) 　　注 : ①x ±s 　②括号内为动物数　模型组与空白对照组比较 ,治疗组分别与模型组比较1) P < 0105 　2) P < 0101 (下同) 　　由表 1 可见肾衰模型组大鼠尿量较对照组 明显减少 ( P < 0105) ,说明肾衰动物模型成立。 药物治疗组均可使尿量增加 ,地塞米松、精芪口 服液和模型对照组比较 ,24h 尿量均显著增加 ( P < 0105) 。空白对照组每日尿蛋白定性均为 - ,模型组第 1 天为 + ,以后在 + ～ + + 之间。地塞米松组及精芪口服液组尿蛋白定性 ,分别于第 3 天和第 4 天转为 - ,其它时间均在 + ～+ + 之间。②BUN ,Scr ,血清总蛋白 　结果见表 2。 表 2 　肾衰大鼠 BUN ,Scr 和血清总蛋白 mmol/ L 　 BUN Scr 血清总蛋白 g/ L 空白对照 3. 34 ±0. 92 (10) 1. 32 ±0. 41 (10) 6. 87 ±1. 20 (10) 肾衰模型 4. 42 ±0. 80 (7) 1) 2. 04 ±0. 76 (7) 1) 4. 87 ±1. 20 (9) 2) 地塞米松 3. 54 ±0. 78 (9) 1) 2. 04 ±0. 87 (9) 9. 31 ±1. 10 (9) 2) 精芪口服液 2. 54 ±1. 01 (9) 2) 1. 14 ±0. 56 (9) 1) 5. 64 ±0. 60 (10) 　　从表 2 可看出肾衰模型组大鼠 BUN , Scr 增加 ( P < 0105) ,血清总蛋白减少 ( P < 0101) , 急性肾衰模型成立。地塞米松组与模型组比 较 ,可降低 BUN ( P < 0105) ,增加血清总蛋白 ( P < 0101) 。精芪口服液降低 BUN , Scr ( P < 0101 , P < 0105) ,对血清总蛋白无影响。 ③血清 K+和 Na + 　结果见表 3。 表 3 　肾衰大鼠血清 K+ 和 Na + mmol/ L 　 K+ Na + 空白对照 0. 051 ±0. 022 (10) 0. 830 ±0. 171 (10) 肾衰模型 0. 113 ±0. 041 (9) 2) 1. 512 ±0. 144 (9) 2) 地塞米松 0. 187 ±0. 151 (9) 1. 434 ±0. 220 (9) 精芪口服液 0. 052 ±0. 014 (10) 2) 0. 833 ±0. 086 (10) 2) 　　由表 3 可见肾衰大鼠血 K+ 和 Na + 增高 ( P < 0101) ,地塞米松治疗组与模型组比较血 K+ 和 Na +无变化 ,精芪口服液组和模型组比较血 K+ 和 Na + 均降低 ( P < 0101) 。 实验最后对各组大鼠进行抽样病理检查 , 空白对照组肾组织正常 ,模型组大鼠病变广泛 , 肾曲管细胞颗粒变性、空泡变性、部分管腔扩 张 ,直管内多量蛋白管型 ;地塞米松治疗组对肾 组织无影响 ,精芪口服液治疗组肾组织病变较 轻。 实验结果表明精芪口服液降低 ARF 动物 BUN ,Scr ,血清 K+和 Na + ,并使尿量增加 ,使尿 蛋白转阴 ,表明有改善肾功能作用。 212 　犬去甲肾上腺素 ARF 模型 21211 　原理 　去甲肾上腺素引起肾血管收缩 ·05· 　中国中药杂志 　1998 年第 23 卷第 1 期 　 而致肾小球的血流减少 ,肾小球滤过减少 ;肾组 织缺血、缺氧加重对肾组织损害从而产生 ARF。 21212 　操作方法 　取 10～20kg 雄性家犬 ,以 戊巴比妥钠 30mg/ kg ,iv 麻醉后 ,手术分离一侧 输尿管 ,插入套管收集尿液。从肾动脉按每分 钟 0175μg/ kg ,滴注去甲肾上腺素 ,连续 40min 后停药 ,1～4h 内可进行实验。实验分组 :新药 组分二个剂量 ,肾衰阳性对照组用地塞米松 (0. 1mg/ kg) 或右旋糖酐 (平均分子量 7500 , 10ml/ kg ,iv) 。肾衰阴性对照组用等量生理盐 水。每组动物至少 5 只。 21213 　药物疗效的评价指标 　尿量及尿常规 检查 (用药前 1h 及用药 1 ,2 ,4h 后) ;BUN ,Scr , 血清总蛋白、血清白蛋白、血清 K+和 Na + (用药 前 1h 及用药 1 ,2 ,4h 后) ;病理学检查。 所试药物的药效可根据对以上指标的改善 来评价 ,结果进行 t 检验作组间比较 ,百分比相 差大于 10 %且差异有显著意义时 ,可判断为阳 性。 21214 　注意点 　集尿套管内应预先充满温水 并防止导管弯曲而阻碍尿液通畅 ;实验前勿给 高蛋白饮食 ,以免影响 BUN 水平。 213 　犬夹闭肾动脉引起的 ARF 模型 21311 　操作方法 　取 10～20kg 雄性家犬 ,以 戊巴比妥钠 30mg/ kg iv 麻醉后 ,手术暴露左侧 肾动脉 ,夹闭 1h 后放开 ,使血流再通 ,从该侧输 尿管收集尿液。实验分组 :新药组分 2 个剂量 , 肾衰阳性对照组用地塞米松 (0. 1mg/ kg) 或右 旋糖酐 (平均分子量 7500 ,10ml/ kg ,iv) 。肾衰 阴性对照组 (只手术 ,不夹闭肾动脉) 用等量生 理盐水。每组动物至少 5 只。 21312 　原理、评价指标等同犬去甲肾上腺素 ARF 模型。 214 　汞剂引起的动物 ARF 模型 21411 　原理 　一般认为是由于汞离子经肾小 球滤过后 ,被肾小管上皮细胞重吸收 ,并在细胞 内累积 ,与细胞膜和细胞内巯基 (2SH) 和二硫基 ( - S - S - ) 等结合 ,影响细胞和细胞内的酶活 性。受累细胞由于汞2硫反应而损害细胞及其 膜的功能与结构 ,细胞呼吸功能丧失 ,变性坏 死 ,并部分脱落于管腔中阻塞肾小管 ,使原尿通 过受阻。受损的肾小管通透性增高 ,原尿漏出 并返回肾血管 ,因而产生少尿、无尿。原尿漏至 肾间质 ,形成间质水肿 ,压迫肾小管。HgCl2 中 毒还可以引起肾血流重新分布 ,肾皮质缺血 ,髓 质瘀血 ,肾小管滤过减少 ,也是引起 ARF 的原 因之一。 21412 　操作方法 　2kg 以上的健康成年家兔 , 雌雄不限。以 HgCl2 2. 5mg/ kg 一次静脉注射 ( HgCl2 可用生理盐水或蒸馏水配成适当浓度的 溶液) 。测定实验前 3 天的血、尿的尿素氮和肌 酐含量 ,取平均值作自身对照 ;注射 HgCl2 后的 前 5 天 ,每天作同样测定 ,以后可改为隔天或多 天测 1 次 ,直到肾功能正常。并进行尿常规检 查。 本法也可采用肌注方法 ,即在实验前两天 , 每天于兔后腿两侧分别注射 011 %升汞溶液各 10ml (10mg/ kg 体重) 。采用大鼠时 ,体重 180 ～250g ,雌雄不限 ,实验前48 h大鼠皮下注射 0. 1 %升汞溶液 5ml/ kg。采用小鼠时 ,实验前 3h 先 ig 小鼠水 0. 5ml ,目的在于增多尿液便于 检查 ;小鼠于注射升汞后 4h ,即可造成中毒性 ARF。 21413 　造模成功的指标和药物疗效观察 　生 理生化指标 : ①Scr 水平迅速上升至 2mg %以 上 ,并持续多天 ; ②BUN 水平在中毒后 3 天升 高至 60～70mg %以上 ; ③24h 肌肝清除率显著 降低 ; ④24h 肌肝、尿素氮总排出量显著减少。 尿常规检查 : ①中毒后 3～5 天内明显少尿 ,以 后紧接着多尿 ; ②尿中出现蛋白质 ,有各类管 型 ,中毒后 3～5 天最为明显。病理形态检查 : ①肉眼检查 :肾显著肿大 ,重量增加 (肾指 数增大) ,皮质缺血 ,髓质瘀血 ; ②镜下检查 :肾 曲小管变性坏死。 注意点 : ①HgCl2 溶液必须是新鲜配制 ; ② 精确收集 24h 尿 (在收集器内事先加入少量甲 苯 ,以防腐败) ; ③实验前后动物所食饲料、青菜 不加限制。 215 　庆大霉素引起的 ARF 模型 21511 　原理 　大剂量氨基糖甙类抗生素 (A G) ·15·　中国中药杂志 　1998 年第 23 卷第 1 期 　 在动物体内大部分以原形从尿中排出 ,小部分 被近端小管重吸收 ,导致药物在肾皮质蓄积。 A G抑制肾皮质细胞溶酶体内的磷脂酶 A 和 C 导致磷脂、磷脂酰肌醇在溶酶体内蓄积 ,溶酶体 由于磷脂的沉积 ,最后破裂而致细胞损伤。此 外 ,A G还作用于线粒体氧化磷酸化 ,造成肾小 管损伤。 21512 　操作方法 　Wistar 雄性大鼠 ,体重 250 ～300g ,每天腹腔注射庆大霉素 140mg/ kg 体 重 ,共 7 天 ,治疗组动物在注射的同时给予药 物 ;阳性对照药用异搏定 ,每只大鼠每日灌胃 15mg/ kg ;空白对照组则给予溶媒。 21513 　评价指标 　①尿量及尿常规检查 ; ② BUN ,Scr ,血清总蛋白和白蛋白 ,血清 K + 和 Na + ; ③NA G 酶及溶菌酶的检查 ; ④病理组织 学检查。 3 　参考文献 1 　Shimahara Y et al. Circ Shock ,1987 ;21 :197 2 　Racusen L C et al. Kid Int ,1985 ;22 :517 3 　Stein J H et al. Transplant Proc ,1985 ;17 (4) :72 4 　黎磊石等 1 肾脏病讲稿选编 1 南京 :南京军区后勤部出版 , 　　1982 :202 5 　董忠田等 1 精芪口服液对肾衰大鼠肾功能的影响. 中国药 　　学杂志 ,1995 ;30 (6) :339 1996 —12 —19 收稿 ·25· 　中国中药杂志 　1998 年第 23 卷第 1 期 　 Determination of Sal idroside in Eight Rhodiola Species by TLC2UV Spectrometry An Feng and Yue Songjian (School of Pharmaceutical Sciences ,West China Medical University ,Chengdu 610041) Guo De’an and Zheng J unhua (School of Pharmaceutical Sciences ,Beijing Medical University ,Beijing 100083) Abstract 　Quantitative determination of the salidroside in eight Rhodiola species by TLC2UV spectrometry is re2 ported. The salidroside was separated on a silica GF254 TLC plate using CHCl32CH3OH2H2O (26∶14∶3) as developing sol2 vent and determined at wavelength 223. 8nm. The results show that this method in simple and convenient . Key words 　Rhodiola ;salidroside ; TLC2UV spectrometry (original article on page 43) A Study of Scavenging Action of Shengmaiyin Decoction on Hydroxyl Radical Wang Yuqiu ,Bai Lingjun and He Xiwen (Department of Chemistry ,Nankai University , Tianjin 300071) Abstract 　A study has been made on the scavenging action of Shengmaiyin Decoction and its ingredients Radix Gin2 seng ,Radix Ophiopogonis and Fructus Schisandrae on hydroxyl radical ,as well as on the relationship between the decoction and its ingredients using ESR spin2trapping. The results indicate that the decoction is better in antioxidation than its ingre2 dients. Key words 　Shengmaiyin Decoction ;Radix Ginseng ;Radix Ophiopogonis ; Fructus Schisandrae ;hydroxyl radical (original article on page 45) Methodology for Designing Pathological Models of Acute Renal Failure Deng Hongzhu ,Jin Weijun ,Liao Xiling and He Yongjia (Nanfang Hospital ,First Military Medical University , Guangzhou 510515) Abstract 　This paper reports the methodological study on the following five pathological models of acute renal failure (ARF) : ①glycerine2induced ARF in rats ; ②noradrenaline2induced ARF in dogs ; ③ARF model caused by shutting left re2 nal artery in dogs ; ④hydrargyrism2induced ARF in rabbits ; and ⑤gentamycin2induced ARF in rats. Key words 　acute renal failure ;pathological model (original article on page 48) Observation on Inhibitory Effect of Tetrandrine on Growth of Human Skin Fibroblast in Vitro Liu Dewu ,Li Guohui ,Cao Yong ,Su Ziyi ,Wang Wen and Wu Xieqing (Burn Institute , The First Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College ,Nanchang 330006) Abstract 　The effect of tetrandrine on the growth of human skin fibroblasts was observed in vitro culture. The result revealed that tetrandrine significantly inhibited the growth of fibroblast . The higher the concentration of tetrandrine ,the higher the inhibition rate ,forming a time2dependent relationship . The possible value of tetrandrine in the treatment of hy2 pertrophic scar is discussed. Key words 　tetrandrine ;fibroblast ;cell culture ;hypertrophic scar (original article on page 55) ·46· 　中国中药杂志 　1998 年第 23 卷第 1 期