双光径免疫浊度分析仪测定尿视黄醇结合蛋白2

双光径免疫浊度分析仪测定尿视黄醇结合蛋白 吴俊渊, 郭新荣, 陈彤, 曹兴建*（南通大学附属第二医院检验科 江苏南通226001） 摘要:目的　评价国产试剂在双光径免疫浊度分析仪（IMMAGE 800）上检测尿视黄醇结合蛋白（RBP）的可行性。方法　对瑞源公司生产的RBP试剂在IMMAGE800上的检测精密度、准确性、线性、干扰性进行评价，并与日立7170型自动生化分析仪（7170）的检测结果进行相关性分析。结果　低值、高值RBP的批内CV分别为4.78、3.47，批间CV分别为6.78、5.70；在RBP浓度为0.62和2.36mg/L的2份样本中, 加入2.50mg/L 的标准品, 其回收率分别为90.6%、96.4% ；用高浓度的参考物作线性测定，7170与IMMAGE800的检测范围分别为：0.25 mg/L～7.80 mg/L和0.16 mg/L～9.20 mg/L之间；在尿液中Hb < 5.0g/L时,对本法无明显干扰。40份标本分别在7170和IMMAGE800上检测RBP，结果经配对资料t检验，两者存在显著差异(P<0.01)，将两组数据进行线性回归分析，显示出良好的相关性，回归方程为Y =0.9064X +0.098，γ=0.991，P<0.01。结论　应用国产试剂在IMMAGE800上检测尿RBP，其精密度、准确性、线性、均符合临床，与7170的检测结果相比有良好的相关性,且具有更高的检测上限，可以替代7170型自动生化分析仪的检测。 【关键词】：视黄醇结合蛋白 IMMAGE特定蛋白仪 速率散射比浊法 方法学评价 视黄醇结合蛋白（RBP）为低分子量蛋白,正常人血浆中90%的RBP 与前白蛋白结合,不能透过肾小球滤出,游离状态的RBP经肾小球滤出几乎全部被肾小管重吸收,因此正常尿液中含量很低 。由于RBP 相对分子量小,在酸性尿中十分稳定,被认为是最敏感的近曲小管的损伤标志[1-2] ，在临床上具有广泛的应用前景。检测尿RBP水平的方法较多，包括酶免法(EIA)、放免法(RIA)、免疫透射分析法,免疫散射分析法等[3]。EIA 、RIA等操作繁琐，不易于自动化，不适宜临床常规检测。免疫透射分析法是较为常用的方法，但该法检测灵敏度较低，存在钩状效应等弊端。IMMAGE800双光径免疫浊度分析仪具备散射和透射两套光路以及抗原过剩自动检测系统，是目前测定特定蛋白的较先进的仪器，但RBP的检测还没有试剂盒提供。我们开发该仪器的科研通道，利用国产试剂中的抗RBP抗体，建立了速率散射比浊测定尿RBP浓度的方法，并与日立7170型自动生化分析仪（7170）免疫透射检测系统的检测结果进行比较分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器 日立7170型自动生化分析仪(日本)；双光径免疫浊度分析仪（BECKMAN IMMAGE 800）(美国)。 1.1.2 试剂及校准品 RBP检测试剂、标准品均由宁波瑞源公司提供; UDR（自定义）试剂盒________________________ 作者简介：吴俊渊，男，1963年出生，副主任技师，现主要从事生化免疫方面工作。电话：051385838196 通讯作者：曹兴建 Email:ntcaoxh@163.com 以及配套的缓冲液buffer 1、稀释液dilution 1,由贝克曼库尔特公司提供。 1.1.3 样本收集来源于临床检测样本,其浓度选择符合EP9-A[4] 文件数据分布的要求。 1.2 方法 1.2.1 免疫透射比浊双试剂终点法在7170上完成。将4.0 mg/ L校准品按倍比稀释为2.0，1.0，0.5，0.25 及0 mg/L作6 点定标。基本测定参数: 主波长340nm ,副波长700 nm ,比色皿光径0.7cm。尿液经离心沉淀后取上清液进行测定。加样量: 尿样/ 校准品∶试剂1∶试剂2 = 8μl∶240μl∶60μl 。加入试剂1 5min后加入试剂2 ,反应时间5min 。 1.2.2 速率散射比浊在IMMAGE800上完成。先将上述稀释好的6点定标品放入IMMAGE的样品盘中,利用国产试剂中的抗RBP抗体（试剂2），参照其提供的相关参数，样品和标准品的加样量设定为6μl ，试剂1的用量设定为200μl，改变试剂2的用量，分别为30ul、40 ul、50 ul、60 ul和80 ul进行实验比较，结果当尿样/ 校准品∶试剂1∶试剂2 = 6μl∶200μl∶50μl时,线性最佳。进入IMMAGE的用户自定义试剂(UDR)系统,使用自建的用户自定义检测项目,进行参数设置，样本中加入试剂1 5min后进入IMMAGE 800的速率散射比浊程序，读测时间由仪器自动控制。配置5%的正常人血清，作为抗原过剩检测试剂，设置用量5μl。仪器通过多点定标曲线自动计算样本中的RBP含量。结果太高的样本，仪器将自动稀释后重新测定。 1.2.3 统计学处理　两样本资料比较采用t 检验,相关分析采用直线相关分析。 2　结果 2.1 精密度　取RBP浓度分别为0.87、3.2 mg /L的二份尿液样品,每个浓度的样品分别在IMMAGE 800上连续测定20次,计算各浓度批内的 、S和CV,每个浓度每天测定一次,连续测定20d,计算各浓度日间的 、S 和CV,见表1。 表1　 IMMAGE 800测定尿RBP的精密度 浓度 (mg/L) 批内 日间 S CV S CV 0.87 0.87 0.042 4.78 0.93 0.063 6.78 3.20 3.20 0.112 3.47 3.34 0.19 5.70 2.2 回收试验　在RBP浓度为0.62和2.36mg/L的2份样本中, 加入2.50mg/L 的标准品, 用IMMAGE 800检测RBP,其回收率分别为90.6%、96.4% ,平均为93.5%。 2.3　干扰试验　将Hb 标准液稀释成不同浓度加入到3份等体积的混合新鲜尿液中，获得干扰样本, 所得Hb加入浓度为10.0g/L 、5.0g/L 、2.5g/L，用同样的方法加入0. 9%生理盐水为对照样品,每个样品按照随机次序在IMMAGE 800上测定3次,得出干扰样品和对照样品各自的 ,并计算干扰率,分别为+10.3%、+4.02%、+3.2%，因此在尿液中Hb < 5.0g/L时,对本法无明显干扰。 2.4 线性　用高浓度的参考物作线性测定。免疫透射比浊法的实测浓度与理论浓度在0.1 mg/L～7.80 mg/L之间线性良好，速率散射比浊法在0.06 mg/L～9.20 mg/L之间线性良好。 2.5 抗体用量的确定 设定5种不同的抗体用量模式（A、B、C、D、E）见图1，以定值样本6点（0、0.25、1.0、4.0、8.0、10.0）检测RBP浓度,5种模式的直线回归方程分别是：YA=0.085X+0.565,直线相关系数（r）=0.702；YB=0.143X+0.607, r =0.85；YC=0.212X+0.599, r =0.919；YD=0.231X+0.649, r =0.908；YE=0.255X+0.688, r =0.892。 2.6 方法比较 40份样本每份标本两种方法双份平行测定,每天测定8个,依次1-8，8-1，共测5天。以7170的免疫透射比浊法为比较系统(X1、X2 )，以IMMAGE800的速率散射比浊法为实验系统(Y1、Y2 )，计算每个样本测定结果的均值Xi和Yi、样本重复测定值间差值的绝对值（DXi和DYi）和2种方法测定结果均值间的差值（Xi-Yi）及其平均数。部分数据见表1。结果：两种方法的平均偏差0.31mg/L ，95% 的偏差值落在0.03mg/L 到0.79mg/L之间，将两结果配对t检验后，发现两者存在显著差异，IMMAGE 800的测定结果略低,将两组数据进行线性回归，则显示出良好的相关性。回归方程为Y =0.9064X +0.098，γ=0.991，P<0.01。绘制散点图，发现两者之间亦有良好的线性关系。 表2 部分样本的双份测定结果及差值（mg/L） 样本号 7170 IMMAGE800 X1 X2 DXi Y1 Y2 DYi Xi-Yi 1 1.56 1.45 0.11 1.20 1.32 0.12 0.24 2 3.19 3.43 0.24 2.64 2.40 0.24 0.79 3 7.20 7.00 0.20 6.50 7.15 0.65 0.27 … 39 4.00 3.64 0.36 3.50 3.22 0.28 0.46 40 2.33 2.56 0.23 2.10 1.93 0.17 0.43 图2 方法比较散点图 3 讨论 利用国产试剂在进口双光径免疫浊度分析仪上开展检测项目，是近年来特定蛋白检测的研究热点，也多有报道[5]。双光径免疫浊度分析仪IMMARE 具有两套光路系统,它将速率散射比浊在精密度和准确度方面的长处与速率透射浊度法的近红外波长检测技术相结合,使得该仪器的检测精度大大提高。国产RBP试剂在IMMAGE上的运用目前还未见报道。本研究利用实验室已有IMMAGE800特定蛋白仪作为技术平台，对其科研通道进行开发，使用速率散射比浊法检测尿液中的RBP，获得满意的效果。 速率散射比浊分析是一种动力学测定方法，即在抗原抗体反应达最高峰时，测定其复合物形成的量，峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。在本法的实验中，抗体的用量设定为50ul，这是因为：当抗体用量30ul -40ul 时，RBP的高浓度区的检测受到影响，抗体不足可能会引起检测线性范围的缩小；当抗体用量60ul -80ul 时，在RBP的低浓度区，由于抗原抗体比例不适，使得结合率反而下降，OD值降低；而当抗体用量达到50 ul 时，从图1中可见RBP浓度与OD值之间存在良好的线性关系，YC=0.212X+0.599，r=0.919。从得到的直线回归方程和相关系数来看，结果令人满意。 本实验结果显示，批内精密度<5.0%，低值CV 为4.78% ,高值CV 为3.47% ，说明该法在检测高浓度时，结果更加稳定。日间CV在5.7%-6.78%之间，均符合CLIA’ 88对常规临床化学项目可接受范围的规定（<10%）。从线性结果看，由于IMMARE 800的速率散射比浊法是在抗原、抗体特异性结合反应的上升期检测光散射信号, 因此与7170型自动生化分析仪的免疫透射比浊法（终点法）相比,线性范围上限明显提高，分别为9.20 mg/L和7.8 mg/L 。对于高浓度的标本IMMARE 800的抗原过量检测系统将自动对其进行稀释检测，避免了钩状效应引起的假性减低，结果更加可靠。以7170型自动生化分析仪的免疫透射比浊法为比较系统(X )；以IMMAGE 800 速率散射比浊法为实验系统(Y )，所得回归方程为Y =0.9064X +0.098，γ=0.991，P<0.01，有很好的可比性，完全满足临床检验要求。两法结果的差异虽然有显著意义，速率散射比浊法结果偏低，但通过回归方程完全可以将结果进行校正。另外，实验也表明，血红蛋白对其测定无明显干扰。结果显示：应用国产试剂在IMMAGE 800上检测尿RBP，其精密度、准确性、线性、均符合临床要求，与7170的检测结果相比有良好的相关性,且具有更高的检测上限，可以替代7170型自动生化分析仪的检测。 参考文献: [ 1 ] 浦春,张斌华.糖尿病肾病患者尿视黄醇结合蛋白检测的意义[ J ].临床检验杂志,2006,24(6):462 [ 2 ] Naylor H, NewcomerM. The structure of human retinol-binding protein (RBP)with its carrier protein transthyretin reveals an interaction with the carboxy teminus of RBP [ J ]. Biochemistry, 1999, 38 ( 9 ) :2647-2653. [ 3 ] 陈敏.两种测定视黄醇结合蛋白方法的比较[ J ].江苏预防医学,2008,19(4):69-70 [ 4 ] The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples Approved Guideline[S]. NCCLS, EP9-A, 1995. [ 5 ] 赵绍林,段厚全.国产试剂在Immage特定蛋白分析仪上的应用评价[ J ].临床检验杂志，2006,24(5):389 30ul、40ul、50ul、60ul、80ul A、B、C、D、E表示抗体用量分别为： 图1 RBP检测时不同抗体用量的反应曲线 OD值 RBP浓度 E D C B A 10 8 4 2 1 0.5 0 PAGE 5 _1269956088.unknown