HPLC测定柴芍丸中芍药苷_栀子苷及丹皮酚的含量

檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶 ［4］ 周向荣，夏延斌，周跃斌，等 ．藠头的主要功能性成分及 其作用的研究进展［J］．食品与机械，2006，22(3) :73． ［5］ 周祖文 ．影响中药微量元素的相关因素研究概况［J］． 微量元素与健康研究，2002，19(1) :66． ［6］ 祁俊生，徐辉碧，周井炎，等 ．稀土元素与中药药性关系 研究［J］．计算机与应用化学，2000，17(2) :182． ［7］ 尹海波，张囡，罗宏，等 ．不同产地牻牛儿苗无机元素的 主成分和聚类分析［J］． 中国中药杂志，2010，35 (15) :1935． ［8］ 李瑞芬，叶明德 ．中草药中微量元素铁锰锌铜锶的形态 分析［J］．微量元素与健康研究，2010，27(2) :19． ［9］ 严寒静，房志坚 ．不同产地何首乌无机元素的含量测定 和主成分分析［J］．中国中药杂志，2008，33 (4) :416． ［责任编辑 蔡仲德］ ［收稿日期］ 20110317(006) ［通讯作者］ * 孟宪波，Tel:13506441422，E-mail:sevine@ 126. com HPLC测定柴芍丸中芍药苷、栀子苷及丹皮酚的含量 孟宪波 * ，郑晖 (淄博市药品检验所，淄博 255086) ［摘要］ 目的:建立以高效液相色谱法同时测定柴芍丸中芍药苷、栀子苷及丹皮酚含量的方法。方法:色谱柱为 Inertsil ODS-SP(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相乙腈-水梯度洗脱，检测波长 230 nm，流速 1. 0 mL·min － 1。结果:芍药苷在0. 494 4 ～ 12. 36 μg (r = 1)线性关系良好，平均回收率为 98. 77%，RSD 2. 1%;栀子苷在 0. 492 2 ～ 12. 305 μg (r = 0. 999 9)线性关系良 好，平均回收率 101. 64%，RSD 1. 9%;丹皮酚在0. 260 2 ～ 6. 505 μg，(r = 0. 999 9)线性关系良好，平均回收率 100. 92%，RSD 1. 7%。结论:方法简便、快速、重复性好，可用于柴芍丸的质量控制。 ［关键词］ 柴芍丸;芍药苷;栀子苷;丹皮酚;含量测定;高效液相色谱法 ［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)17-0072-03 Determination of Paeoniflorin，Geniposide and Paeonol in Chaishao Pills by HPLC MENG Xian-bo* ，ZHENG Hui (Zibo Institute for Drug Control，Zibo 255086，China) ［Abstract］ Objective:To establish an HPLC method for the simultaneous determination of paeoniflorin， geniposide and paeonol in Chaishao Pills． Method:Paeoniflorin，geniposide and paeonol were separated on Inertsil ODS-SP (4. 6 mm × 150 mm，5 μm)column and detected at 230 nm． The mobile phase was acetonitrile-water with gradient elution． The flow rate was 1. 0 mL·min － 1 ． Result:Paeoniflorin，geniposide and paeonol were linear within the range of 0. 494 4-12. 36 μg (r = 1) ，0. 492 2-12. 305 μg (r = 0. 999 9) and 0. 260 2-6. 505 μg，(r = 0. 999 9) respectively． The average recovery was 98. 77% (2. 1%) ，101. 64% (1. 9%) and 100. 92% (1. 7%)． Conclusion:The method is simple，reproducible，and it can be used for the quality control of Chaishao pills． ［Key words］ Chaishao pills;paeoniflorin;geniposide;paeonol;determination;HPLC 柴芍丸为一中药复方制剂，由柴胡、白芍、香附、 栀子、牡丹皮、当归、茯苓等 11 味药组成，具有疏肝 ·27· 第 17 卷第 17 期 2011 年 9 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol． 17，No． 17 Sep．，2011 清热，养血健脾的功效;主要用于肝郁生热、脾弱血 虚证。方中白芍养血敛阴，柔肝缓急;栀子清散肝经 之郁热，并引热下行;牡丹皮清泻血中之伏火，三者 均发挥重要作用。芍药苷具有保肝［1］、促进造血细 胞增殖［2］等广泛的药理作用;栀子苷具有保肝利 胆［3］、降血脂及抗血栓［4］等药理作用;丹皮酚具有 抗菌［5］、抗炎［6］、抗血小板聚集［7］等药理作用，三者 均为主要活性成分。故采用高效液相色谱法，对该 制剂中白芍及牡丹皮所含的芍药苷、栀子所含的栀 子苷和牡丹皮所含的丹皮酚进行了含量测定，以便 为控制该制剂的质量提供依据。 1 材料 1. 1 仪器 LC-20AT 型高效液相色谱仪，SPD-20A 型 UV /VIS 检测器 (日本岛津公司) ，METTLER AE240 型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公 司) ，KS-300E 超声波清洗机(宁波科生仪器厂)。 1. 2 试药 芍药苷(批号 110736-200933，含量以 98. 1%计算)、栀子苷(批号 110749-200714)、丹皮 酚对照品(批号 110708-200506)均购自中国药品生 物制品检定所;柴芍丸 3 批，批号分别为 20100414， 20100520，20100608;乙腈为色谱纯，水为高纯水， 其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2. 1 色谱条件 色谱柱 Inertsil ODS-SP(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ;流动相 A 为乙腈，B 为水，梯度洗脱 程序为 0 ～ 5 min 10% A，5 ～ 35 min 10% ～ 30% A， 35 ～ 45 min 30% A;检测波长 230 nm，流速为 1. 0 mL·min － 1，柱温 30 ℃。理论板数按芍药苷峰计算 不低于5 000。 2. 2 溶液的制备 2. 2. 1 对照品溶液 分别取芍药苷对照品、栀子苷 对照品和丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成 每 1 mL 各含0. 494 4，0. 492 2，0. 260 2 mg 的混合溶 液，即得。 2. 2. 2 供试品溶液 取本品适量，研细，取约 5 g， 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 mL， 密塞，称定质量，超声处理(功率 220 W，频率 33 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的 质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2. 2. 3 阴性对照溶液 取处方中除白芍、栀子和牡 丹皮外的其他药味，按柴芍丸制备方法制成阴性样 品，按 2. 2. 2 项下方法操作，制备阴性对照溶液。 2. 3 专属性试验 分别精密吸取上述对照品溶液、 供试品溶液和阴性对照溶液各 10 μL，注入液相色 谱仪，记录色谱图。供试品中芍药苷、栀子苷和丹皮 酚色谱峰与相应对照品色谱峰保留时间一致，其他 组分对测定无干扰(图 1)。 A．对照品;B．样品;C．阴性对照; 1. 栀子苷;2. 芍药苷;3. 丹皮酚 图 1 柴芍丸高效液相色谱 2. 4 线性关系考察 精密吸取 2. 2. 1 项下对照品 溶液 1，5，10，15，20，25 μL，以 2. 1 项下色谱条件 进样，测定峰面积。以对照品量 X 为自变量，峰面积 Y 为因变量，得芍药苷回归方程 Y = 1 × 106X － 73 338(r = 1) ;栀子苷回归方程 Y = 1 × 106X － 39 564(r = 0. 999 9) ;丹皮酚回归方程 Y = 3 × 106 X + 4 162(r = 0. 999 9)。表明芍药苷、栀子苷和丹 皮酚分别在 0. 494 4 ～ 12. 36，0. 492 2 ～ 12. 305， 0. 260 2 ～ 6. 505 μg，线性关系良好。 2. 5 精密度试验 分别精密吸取 2. 2. 1 项下对照 品溶液 10 μL，连续进样 6 次，计算芍药苷、栀子苷和 丹皮酚峰 面 积 的 RSD 分 别 为 0. 21%，0. 26%， 0. 30%。表明仪器精密度良好。 2. 6 重复性试验 取同一批(20100414)供试品 6 份，分别按 2. 2. 2 项下方法制备，以 2. 1 项下色谱条 件进样 10 μL，结果芍药苷平均质量分数为2. 192 7 mg·g － 1，RSD 0. 58%;栀子苷平均质量分数为 2. 212 6 mg·g － 1，RSD 1. 2%;丹皮酚平均质量分数 为1. 328 0 mg·g － 1，RSD 0. 55%。表明本法重复性 良好。 2. 7 稳定性试验 取同一供试品溶液，按 2. 2. 2 项 下方法制备，以 2. 1 项下色谱条件分别在 0，2，4， 6，8，10，12 h 进样 10 μL，测定芍药苷、栀子苷和丹 皮酚的峰面积，RSD 分别为 0. 43%，1. 1%，0. 79%。 表明供试品溶液在 12 h 内稳定。 2. 8 加样回收试验 取同一批(批号 20100414，芍 ·37· 孟宪波，等:HPLC 测定柴芍丸中芍药苷、栀子苷及丹皮酚的含量 药苷、栀子苷和丹皮酚质量分数分别为2. 185 5 mg· g － 1，2. 218 1 mg·g － 1，1. 324 0 mg·g － 1)供试品适量， 精密称定，共 6 份，分别精密加入对照品溶液 5 mL 及甲醇 25 mL，按 2. 2. 2 项下方法制备，以 2. 1 项下 色谱条件进样 20 μL，测定芍药苷、栀子苷和丹皮酚 的含量。结果表明，本法的准确度较好(表 1)。 表 1 柴芍丸加样回收试验 化合物 样品中 含量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均值 /% RSD /% 芍药苷 2． 633 1 2． 472 0 5． 055 7 98． 00 98． 77 2． 1 2． 645 8 2． 472 0 5． 147 4 101． 20 2． 619 8 2． 472 0 4． 986 6 95． 74 2． 600 5 2． 472 0 5． 009 8 97． 46 2． 667 0 2． 472 0 5． 148 3 100． 35 2． 666 1 2． 472 0 5． 134 3 99． 85 栀子苷 2． 672 4 2． 461 0 5． 176 5 101． 75 101． 64 1． 9 2． 685 2 2． 461 0 5． 165 5 100． 78 2． 658 8 2． 461 0 5． 184 3 102． 62 2． 639 3 2． 461 0 5． 179 9 103． 23 2． 707 4 2． 461 0 5． 245 8 103． 15 2． 705 9 2． 461 0 5． 126 1 98． 34 丹皮酚 1． 595 2 1． 301 0 2． 898 1 100． 15 100． 92 1． 7 1． 602 8 1． 301 0 2． 941 0 102． 86 1． 587 1 1． 301 0 2． 865 0 98． 22 1． 575 4 1． 301 0 2． 887 5 100． 85 1． 616 1 1． 301 0 2． 945 4 102． 17 1． 615 1 1． 301 0 2． 932 8 101． 28 2. 9 样品测定 取不同批号的样品，分别按 2. 2. 2 项下方法制备供试品溶液，按 2. 1 项下色谱条件进 样测定(表 2)。 表 2 柴芍丸样品成分测定 批号 芍药苷 栀子苷 丹皮酚 20100414 2. 185 5 2. 218 1 1. 324 0 20100520 2. 170 8 2. 427 6 1. 363 3 20100608 2. 147 2 2. 234 5 1. 328 2 3 讨论 本实验中曾以乙腈-水为流动相以同比例进行 试验，但因丹皮酚与芍药苷、栀子苷的极性相差较 大，无法获得较好的分离效果。后采用以乙腈-水为 流动相进行梯度洗脱，获得了较好的分离效果。 参考有关文献［8-10］，芍药苷、栀子苷和丹皮酚的 测定波长多分别采用 230，238，274 nm。试验中发 现，在 274 nm 波长处，芍药苷和栀子苷吸收强度较 弱，故采用 230 nm 作为测定波长，3 者的吸收峰均 较好。 试验中采用甲醇作为提取溶媒，对不同超声处 理时间进行了对比，试验结果表明超声处理 30 min 已提取完全，因此选择超声处理 30 min 用于供试品 溶液的提取。 ［参考文献］ ［1］ Liu D F，Wei W， Song L H． Protective effect of paeoniflorin on immunological liver injury induced by bacillus Calmette-Guerin plus lipopolysaccharide modulation of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6MRNA［J］． Clin Exp Pharmacol Physiol， 2006，33(4) :332． ［2］ 郭平，王继峰，王升启 ． 芍药苷对放射线致血虚证小 鼠骨髓 Epo 和 G-CSF 基因表达的影响［J］． 山东中医 药大学学报，2005，29(3) :239． ［3］ 张立明，何开泽，任治军，等 ． 栀子中京尼平甙对 CCl4 急性小鼠肝损伤保护作用的生化机理研究［J］． 应用与环境微生物学报，2005，11(6) :669． ［4］ Suzuki Y，Kondo K， Ikeda Y， et al． Antithrombotic effect of geniposide and genipin in the mouse thrombosis model［J］． Phanta Med，2001，67(9) :807． ［5］ 刘春云，武廷章，周大喜，等 ． 凤丹丹皮酚抗菌作用 研究［J］． 生物学杂志，2000，17(3) :23． ［6］ 巫冠中，杭秉倩，杭静霞，等 ． 丹皮酚的抗炎作用及 其机制［J］． 中国药科大学学报，1989，20(3) :147． ［7］ 李薇，王远亮，蔡绍皙，等 ． 丹皮酚和阿司匹林对大 鼠血液流变性影响的比较［J］． 中草药，2000，31 (1) :29． ［8］ 中国药典 ． 一部［S］． 2010:96，160，231． ［9］ 杨海宏，杨桂玲，符同浩，等 ． 高效液相色谱法测定 苏南山肚痛丸中芍药苷的含量［J］． 药物分析杂志， 2011，31(2) :251． ［10］ 蓝小玉，林华 ． HPLC 法同时测定清火栀麦片中三种 成分的含量［J］． 药物分析杂志，2011，31(2) :228． ［责任编辑 蔡仲德］ ·47· 第 17 卷第 17 期 2011 年 9 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol． 17，No． 17 Sep．，2011