脂肪氧化酶在啤酒酿造中的研究

1O．11 硼 究 申 通 集 团 r( 拓璞 ∞2 税漫膏 I液态 超临界) 玉门拓璞科技开发有限责任公司 出品 · 39 · 黄淑霞 余俊红 黄树丽 刘明丽 青岛啤酒股份有限公司科研中心 266061 [摘 要】啤酒酿造的原辅料中含有大量脂肪酸，而脂肪氧化酶会分解脂肪酸生成反一2一壬烯 醛等老化物质，严重影响啤酒的风味及质量。从脂肪氧,fJ6~ 氧化途径、酿造过程中变化机 理、对啤酒老化风味的影响及改进措施等多方面进行了研究现状的阐述。 [关键词】脂肪氧化酶 啤酒 氧化 脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)，又称脂肪 氧合酶(Lipoxidase)或胡萝 卜素氧化酶(Carotene Oxidase)，专一催化分子中含顺，顺一1，4一戊二烯 结构的多不饱和脂肪酸。脂肪氧化酶的底物主要 是不饱和脂肪酸中的亚油酸和亚麻酸，最终的分 解产物羧基(羰酰)类化合物会使啤酒产生氧化 味。 多年来 ，关于脂肪氧化酶的研究已经成为国 内外众多研究机构和酿酒师的重要课题。但是由 于大麦、麦芽等原辅料带来的脂肪的降解途径及 其对啤酒老化风味的影响仍然存在争议，脂肪氧 化酶LOX仍然是一大研究热点和难点。 1脂类的氧化机理 1．1 LOX的作用途径 LOX在动植物界广泛存在 ，1947年Theorell 等人首次从大豆中提取了LOX的结晶。1953年 Franke和Freshe首次进行了大麦 LOX的研究报 道。目前普遍认为大麦中存在LOX1和LOX2两 种同工酶 ，LOX1主要存在于大麦的胚芽中，而 LOX2是在大麦发芽后产生的。日本的Araki认为 麦芽中至少存在三种同工酶：LOX1、LOX2和 LOX3。 多数研究学者认为，脂肪的降解步骤是这样， 第一步：脂肪会在脂肪酶的作用下生成脂肪酸；第 二步：LOX开始作用。LOX1会将亚油酸等不饱 和脂肪酸首先降解为9一氢过氧化物(9一HPOD)， 9一HPOD在氢过氧化物裂解酶(HPL)的作用下生 成反一2一壬烯醛(T2N)，同时9-HPOD在环化酶的 收稿 日期：2010—08—26 作用下也会生成具有涩味的三羟基十八碳烯酸 (THOD)，THOD这种物质既不利于啤酒泡沫稳定 性又会对啤酒风味产生负面影响；而LOX2先将 亚油酸等不饱和脂肪酸降解为 13一氢过氧化物 (13一HPOD)，再在非酶作用下降解成己醛。 葡萄牙Porto大学的Guido等 1认为在早期的 焙焦阶段(凋萎阶段)，LOX1和LOX2是遵循上面 的降解原理。但在糖化过程中，13一HPOD的降解 路线是自氧化形成的，而不是LOX2作用的；同时 亚油酸也可以自氧化生产T2N。 日本札幌酿造研究室Hisao Kuroda等通过对 脂肪氢过氧化物和脂肪酸氢过氧化物的分析 ，得 出结论，在公认的降解途径的同时，还存在另一种 途径。第一步：脂肪首先会在LOX作用或自动氧 化下，变为脂肪氢过氧化物；第二步：脂肪氢过氧 化物再被脂肪酶降解为脂肪酸氢过氧化物。这也 解释了为什么LOX失活一段时间后，脂肪酸氢过 氧化物才显示出最大值。 Hisao Kuroda等也认为亚油酸通过 自氧化生 成 13-HPOD，然后在非酶解条件下生成 己醛。 9-HPOD除了在 9一HPL作用下生成T2N外 ，还会 通过竞争途径生成二羟基和三羟基十八碳烯酸， 最后生成4一羟基一反2壬烯醛。 1_2 中间产物氢过氧化物 日本札幌酿造研究室 Naoyuki Kobayashi等 用化学发光一HPLC测定了脂肪酸氢过氧化物。 在糖化过程中，脂肪酸氢过氧化物先增加后降低， 过滤后几乎为零。这表明氢过氧化物的生成，是 在制麦过程或者糖化前阶段发生的。与自氧化途 · 40 · 申 通 集 团 SU卜 r( E 拓璞 ∞2酒花漫膏 (液态、趣陆界) 玉门拓璞科技开发有限责任公司 出品 径相比，脂肪氧合酶氧化作用明显占主导地位。 往麦汁中通人 CO：实验的结果表明，氢过氧 化物的量减少到33％，证实氧的吸收对脂肪氧化 来说非常重要。 对比了三种不同LOX活力的麦芽，麦芽B的 LOX活力为麦芽A的2．5倍，麦芽C的LOX活力几 乎为零。发现麦芽B产生的氢过氧化物大于麦芽 A，麦芽c产生的非常少。说明LOX在脂肪降解 中起着重要作用。 在糖化前加入脂肪氧化酶抑制因子ETYA， 或将糖化醪pH从5．5降到5．0，都明显抑制了氢过 氧化物的生成，前者降低了80％，后者几乎减半。 2酿造过程对LOX活力的影响 大麦品种：Asahi酿造实验室的Osamu Araki 等 研究了基因和环境对澳大利亚大麦品种中 LOX活 力 的 影 响 。 他 们 对 比 了 Flagship、 Gairdner、0Schooner、Sloop四个澳大利亚麦芽品种 的LOX活力，发现 Flagship、Gairdner的LOX活力 较低，Schooner、Sloop中较高。对三个种植地的同 一 麦芽品种进行LOX分析，发现Cummins的麦芽 LOX活力低于Brentwood和Streaky Bay两地的。 在同一酿造工艺下，研究Harrington、Robust、 Morex三种不同品种麦芽的总LOX活力 ，结果表 明，Harrington、Morex两种麦芽在浸麦时LOX活力 是不断上升的趋势，而Robust麦芽的LOX活力是 先减少后上升的趋势。在浸麦过程中，LOX活力 的变化可能与大麦的种类、生长环境等因素有关 系。 发芽过程：LOX1存在于原料大麦和麦芽中， 而LOX2仅存在于麦芽中。在大麦发芽过程中， LOX总活力和LOX1、LOX2两种同工酶的活力均 有较大增加，且LOX的总酶活力及两种同工酶酶 活力的增加比例均随大麦品种 、基因、环境的不同 而有所不同。比较了Robust大麦分别在发芽温 度为 l6℃和21℃时，大麦发芽4天后的总LOX活 力。结果表明，低温发芽的麦芽LOX活性低于高 温发芽的麦芽，可能是高温加速发芽的同时也导 致LOX活力上升。 干燥过程 ：随着干燥温度的上升，LOX活力 逐步失活。在干燥过程结束后，仅有0．5％～3％ 的LOX残 留在麦芽 中。在干燥初期的4h内 ， LOX1失活的速率较快，4h后，两种同工酶失活的 速率相差不大。干燥结束后，LOX1在Harrington 和Morex两种麦芽中占优势。相反，对于Robust 大麦，在制麦结束后 ，LOX1的含量没有被检测 出，LOX2占优势。决定麦芽中哪一种同工酶占 优势的因素很多，一般与大麦品种、发芽条件、干 燥条件等因素密切相关。 Osamu Araki等[41研究了制麦过程对LOX活力 的影响。首先，将同一种大麦按照不同的浸麦、发 芽工艺处理得到四种绿麦芽(湿度为45％)。将这 四种绿麦芽的干燥过程分为起始低温一结束低 温、起始低温一结束高温和起始高温一结束低温 三种不同干燥工艺参数，分别研究了四种绿麦芽 在不同干燥条件下的LOX活力 ，在起始低温一结 束高温这一干燥工艺条件下 ，四种绿麦芽的LOX 活力均较低；在起始高温一结束低温这一干燥工 艺条件下，麦芽的LOX活力最高。因为在于燥初 期，麦芽中还含有较高的水分，在适合的温度下会 促使LOX的活性增加，所以干燥初期的温度不宜 过高。 芬兰的A．Kaukovirta—Norja等吲研究了制麦和 麦芽储存期LOX的变化。他们认为在浸麦过程 中LOX降低，整个发芽过程中维持在一个低水平 状态，在焙焦早期开始增加，到高温焙焦时降低。 根据麦芽类型的不同，室温下储存 110天，LOX下 降了50％～75％。在低温储存时，LOX活力降低明 显减慢。 成品麦芽的储藏条件对 LOX活力也有一定 影响。温度越高，LOX失活速率越快，室温 20℃ 储藏与低温4℃储藏相比较，室温储藏 ，LOX活力 下降较为明显。 LOX在糖化过程中是逐渐降低的过程。日 本札幌酿造研究室 Naoyuki Kobayashi研究发现， 不同麦芽的LOX降低程度不同。LOX活力低的 麦芽其LOX在65℃时几乎完全失活，而LOX活力 高的麦芽其 LOX在 65℃时还保存 了30％，20rain 后才完全消失。 3 LOX对啤酒老化风昧的影响 LOX的最终降解产物T2N会产生不愉快的纸 板味，是一直以来公认的啤酒典型老化指示剂。 葡萄牙Porto大学的Guido等认为在制麦过程中 生成的T2N会挥发损失掉大部分，但仍然会有一 部分与氨基化合物结合为加成物，而加成物会作 为麦芽的残余壬烯醛潜力T2N—P，一直存在于成 品麦芽中。也就是说壬烯醛加成物最早形成于制 hltp：／／www,kond cn 康迪 日用化工 有限公 司 ·41 · 麦过程，在糖化时会有损失，最后存在于冷麦汁中 的大约还剩余25％。 比利时的Sophie Noel等 认为T2N—P是啤酒 贮存期生成T2N的指示因子。他们对T2N进行重 氢标记，添加到小试麦汁中，发现在糖化和过滤 后，T2N含量急剧降低。重氢标记T2N显示：大部 分的T2N都损失在麦糟中，标记的T2N在麦汁中 形成T2N—P，经过煮沸后减少 ；发酵过程T2N大量 减少，在鲜啤酒中检测不到。T2N一直存在于麦 汁中，部分形成T2N—P，又会在啤酒老化中释放出 T2N。他们还对比了不同LOX麦芽，发现低 LOX 麦芽跟踪测定的T2N和T2N—P都低， 比利 时 的 A．De Buck等[61认 为综 合考 虑 LOX1、还原力 、T2N—P对于老化风味稳定性的研 究是非常重要的。他们将 LOX的两种同工酶进 行分离得到LOX一1和LOX一2，证明在绿麦芽和成 品麦芽中，总LOX酶活和LOX一1之间都是线性关 系。成品酒的T2N与老化得分成线性关系，总 LOX和LOX一1高的两种麦芽酿造的啤酒老化得 分最差。 日本札幌 Hisao Kuroda等测定了20个市售 麦 芽 的 LOX、9-HPL—like活 性 和 T2N—P， 9一HPL—like活性 会 把 9一氢 过氧 化 物 转化 为 T2N。从发芽的大麦中纯化9一HPL—like活性，发 现9-HPL—like活性包括脂肪酸裂解酶(9一HPL) 和3z：2E的异构酶 。9一HPL—like活性和T2N—P 有显著的相关性。他们也认为T2N—P是预测啤 酒老化的指标。 日本朝 日的Miho Auzuki等 研究发现，T2N 和 一壬内酯之间有老化协同作用。同时添加两 种物质的啤酒老化得分为4．4，而单独添加T2N的 啤酒老化得分是3．0(得分越高说明老化程度越严 重)。在 25~C下保存 4周后的啤酒老化得分是 6．3。 4降低LO×或减少T2N的相关研究 目前，降低或者去除LOX活力的途径主要有 四条，第一条是通过基因技术来获得低 LOX活力 的大麦 ，甚至是无LOX活力的大麦。嘉士伯实验 室2001年的国际专利《低LOX1大麦》嘲，主要内容 是通过基因突变方式，提供了具有低LOX一1酶活 的大麦品种，用于具有提高风味稳定性和降低 T2N潜力的麦芽和啤酒的生产。在酿酒过程中使 用突变型lox一1基因的大麦 ，进行30hL规模酿造 试验，啤酒装入棕色瓶中5~C保存。由经过培训 的、对T2N敏感的特定品尝小组品尝。与对照相 比，试验明显降低了T2N含量，改善了啤酒的风味 稳定性，提高了啤酒的质量，延长了货架期。日本 札幌 Hisao Kuroda等选用不含LOX1基因的大麦 酿造啤酒 ，与20种普通大麦相 比较 ，选用不含 LOX1基因的大麦酿造的啤酒T2N含量低，新鲜度 和风味稳定性、泡持较好。 第二条是将麦芽进行热处理。既然 LOX是 热敏感酶，因此可以通过热处理来降低LOX酶活 力。三得利公司对成品麦芽进行各种不同条件的 热处理(温度／湿度／隔氧)，经过热处理后，降低了 麦芽LOX活力和T2N含量 ，而且对淀粉酶、蛋白 酶等酶活力影响较小。 第三条是对麦芽进行抛光，获得低老化前体 的麦芽(LPM)，三得利公司对抛光处理前后的麦 芽进行 100L中试试验，结果表明抛光后的麦芽与 对照相比，麦汁浓度与酒精度都没有变化，而且酒 液新鲜度品评得分较高，酒体更加柔和、干净。 第四是通过工艺改进，如制麦或酿造过程来 降低LOX活力，减少T2N的产生。丹麦Alfred Jcgensen实验室的Olav Vind Larsen等 通过降低 T2N提高了啤酒的风味稳定性。选取来 自不同啤 酒厂的三种啤酒 ，新鲜酒O℃贮存7天，强制老化 酒38℃贮存7天，由专业品评小组对两种酒打分， 发现得分与T2N有很好的相关性 ，R 为0．93。啤 酒1的得分很低、T2N很高，通过工艺对比发现其 喷淋水pH偏高，糖化温度较低。于是分别将酿造 水pH调低为5．5，糖化温度增加到65~C，结果品评 得分提高，T2N降低，风味得到改善。 据芬兰Wilhelmson的研究报道，通过在制麦 干燥过程使用 N ，可以减少LOX活力 ，而且提高 了界限糊精酶活力，对麦汁的其它指标影响不大。 有研究表明，糖化过程的工艺参数对啤酒质 量有很大影响，糖化隔氧、提高糖化温度 、降低醪 液的pH值都可以降低麦汁中的T2N、三羟基十八 碳烯酸，提高啤酒的风味稳定性和泡沫稳定性。 在糖化过程中，麦芽中约有30％LOX析出进 人麦汁中，其余的仍存在于麦糟中。当蛋白休止 温度为45o【二，休止30min后，麦汁和麦糟中约有 35％的LOX失活。此后 ，温度每升高 lcc，LOX的 活性就会急剧下降。当糖化温度为70cc时，糖化 15min后 ，麦汁中残留的LOX即失去活力，但麦糟 ． 康迪，消毒专家 总机：~,3341786EO 3164147传真：3178661 htIp：／~ ,w．kondy．cn E-ma~：kondy97@163∞m 康迪 日用 化工有 限公司 中的LOX具有较强的耐热性，糖化20rain后，还会 有约10％的LOX存在活性，当延长糖化时间至 30min时，麦糟中LOX完全失活。 5展望 脂肪酸降解是啤酒老化的主要途径之一。l3 种老化醛类物质有三种来源：7种来 自脂肪酸降 解，5种来 自氨基酸Streek降解，1种(糠醛)来自 Maillard反应。风味稳定性也是世界研究的热点 和难点。不可否认，目前老化机理众多，不仅是醛 类，还有很多物质共同造成了啤酒的老化。这些 老化物质相互作用，相互协同，共同推动了啤酒老 化的进程。具体到每个品牌、每个工厂来说，造成 老化的原因和物质各种各样。因此，对老化原因 的分析和鉴定非常重要 ，而这需要强大的仪器分 析和品评来共同确定。 其次，从脂肪酸降解产生老化物质的角度来 说，深人研究脂肪酸降解途径，了解其关键控制 点 ，对于控制LOX酶活力 以及产物是非常重要 的，而这也正是国外研究者的热点。这也属于基 础的理论研究，但由于其影响因素众多，尚没有统 一 结论。预计这方面的研究仍将继续。 第三，从实用角度来说，控制LOX活力的途径 前三种都非常昂贵，1二艺改进尽管效果不如前三 种，但切实可行，在工艺改进的同时提高了工厂的 11 究 1二艺控制水平，因此值得投入精力进行研究。从 现有文献来看，国外也仍在此领域进行深入研究。 参考文献 【1】L．F．Guido etc．，An early development of the nonenal potential in the malting process．EBC，2005，691-703． 【2】Naoyuki Kobayashi etc．，Lipid oxidation during wort production．EBC 1993，405-412． [3]Osamu Araki etc．， The influence of genotype and enviromnent on lipoxygenase activity in Australian malting barley varieties． [4】A．Kaukovirta—Norja etc．，Lipoxygenase activity during malting and storage of malt．EBC，193-200． 【5]Sophie Noel etc．，Release of deuterated nonenal during beer aging from labeled precursors synthesized in the boiling kettle． J． Agile． Food． Chem． 1999， 47， 4323—4326． 【6】 A． De Buck etc．， Rapid evaluation of the two lipoxygenase isoenzyme activities 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2009，2 f4】王憬等．啤酒醛类化合物的测定及其老化味研究中的 应用．啤酒科技 ，2009，12 【5]靳纪培等．啤酒风味老化评价的研究进展．食品工业科 技 ，2008，07 【6]刘景等．啤酒老化综合评价指标的初步研究．食品与发 酵工、 2008．08