白附子混悬液对H_22_荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫调节机制研究

天 津 中 医 药 Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 2011年 8月第 28卷第 4期 Aug． 2011,Vol．28 No．4 白附子混悬液对 H22 荷瘤小鼠 抗肿瘤作用的免疫调节机制研究 * 于晓红 1，宋 娜 1，胡艳文 2 （1.黑龙江中医药大学微生物学与免疫学教研室，哈尔滨 150040；2.天津市塘沽区妇幼保健院，天津 319000) 摘要：[目的]研究白附子混悬液对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用，探讨其抗肿瘤作用的免疫学机制。[方法]采用 H22荷瘤小鼠模型为研究对象，用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测小鼠血清中白介素-2（IL-2）和白介素-4（IL-4）水 平；用流式细胞术（FACS）法分析对 CD4+，CD8+T细胞的调节作用。[结果]白附子混悬液能够上调荷瘤小鼠血清 IL-2 细胞因子的表达，降低 IL-4水平，可以使 CD4+ T细胞表达升高，CD8+ T细胞表达降低。[结论]白附子混悬液能够通过 调节荷瘤机体异常免疫功能状态而发挥抗肿瘤作用。 关键词：白附子混悬液；H22细胞；免疫调节 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1519(2011)04-0326-03 *基金项目：黑龙江省科技攻关计划项目（GOOC201301）。 作者简介：于晓红（1958-），女，教授，硕士研究生导师，主要 从事中医药抗肿瘤的免疫学研究。 白附子，为天南星科多年生草本植物独角莲 （Typhonium giganteum Engl）的块茎。产于河南、甘 肃、湖北、黑龙江等地。味微辛，性温，有毒，归胃，肝 经。具有祛风痰、燥湿、定惊、散结止痛之功效，外用 治瘰疬痰核[1]。白附子的化学成分及药理作用近年 来已有报道，主要含有脂肪酸、甾体类化合物、挥发 油成分、氨基酸和微量元素等。白附子的药理学作 用主要有抗炎、镇静、抗惊厥、止痛，并对多种恶性 肿瘤具有一定的抑瘤效果[2－5]。白附子治疗各种肿瘤 在民间广为应用，但目前尚无对其抗肿瘤作用的免 疫调节机制的研究报道[6]。前期研究表明白附子混 悬液（SGTR）通过体内免疫调节抗肿瘤，抑瘤率可达 39.14%。在前期研究的基础上，本课题组进一步对 白附子混悬液抗肿瘤的免疫调节机制进行深入研 究分析，为研制一新型抗肿瘤辅助药物提供现代免 疫学资料。 1 实验材料和方法 1.1 动物 选用健康昆明种小鼠（KM），（20±2.0）g （6~8周龄），雌雄各半，购于黑龙江中医药大学动物 实验中心。许可证号：黑医实验动物单项准第 61号。 1.2 H22瘤株 由哈尔滨医科大学肿瘤研究所提供。 1.3 药物及试剂 1.3.1 药物 1）白附子鲜品购于黑龙江省五常市， 经黑龙江中医药大学生药实验室专家鉴定为天南 星科植物独角莲的块茎。去须、洗净、切成约 2 mm 的厚片，经 60 ℃烘干粉碎，过 80目筛，临用时以双 蒸馏水溶解成不同浓度（按倍比稀释法）。2）环磷酰 胺注射液（CTX），由江苏恒瑞医药股份有限公司生 产，产品批号：06111521。 1.3.2 试剂 抗 CD4-藻红蛋白（PE）和抗 CD8-异 硫氰酸荧光素（FITC）单抗，小鼠白介素-2（IL-2）试 剂盒和小鼠白介素-4（IL-4）试剂盒（为深圳晶美生物 工程有限公司产品）。 1.4 仪器 酶联免疫检测仪（anthos 2010 17750， Austria）；微量加样器（SOCOREX，瑞士）；FAC－ SCALIBUR 流式细胞仪（BD 公司,美国）；电热恒温 培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；低温超速离 心机（KDC-160HR，安徽，合肥）等。 1.5 动物模型的制备 无菌取第 8 天转移癌 H22 腹水（计活细胞大于 95%），用 0.9％生理盐水稀释成 2×106个/mL，取健康纯系昆明种小鼠 40只，18~22 g （6周龄），雌雄各半，每只鼠右侧腋部皮下接种 0.2 mL 瘤细胞悬液，然后将荷瘤鼠按照随机数字表法随机 分为 4组，每组 10只（雌雄各半），分别为模型组、 实验组、环磷酰胺组和联合用药组，另取 10只未接 种荷瘤的小鼠（雌雄各半）作为正常对照组。 1.6 动物分组及给药方法 正常对照组：生理盐水灌胃 0.02 mL/（g·d），腹腔注射生理盐水 0.2 mL；模型组： 生理盐水灌胃 0.02 mL/（g·d），腹腔注射生理盐水 0.2 mL；实验组：白附子混悬液[825 mg/（kg·d）]灌胃 0.02 mL/（g·d），腹腔注射生理盐水 0.2 mL；环磷酰 326 2011年 8月第 28卷第 4期 Aug． 2011,Vol．28 No．4 天 津 中 医 药 Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 表 2 白附子混悬液对 H22荷瘤小鼠外周血 CD4+、CD8+ 细胞的影响（x±s） Tab.2 Effects of SGTR on blood CD4+，CD8+ cells in H22 tumor bearing mice（x±s） CD4+细胞 CD8+细胞 CD4+/CD8+ 46.09±2.07 22.62±1.68 2.05±0.22 40.00±1.65** 28.86±1.58** 1.39±0.09 45.19±0.90▲▲ 24.00±1.24▲▲ 1.92±0.11 37.17±1.52**▲▲ 17.92±1.22**▲▲ 2.08±0.15 40.62±1.89** 22.64±2.31▲▲ 1.81±0.23 组别 n 正常对照组 10 模型组 10 实验组 10 环磷酰胺组 10 联合用药组 10 注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，▲▲P<0.01。 注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，▲▲P<0.01。 表 1 白附子混悬液对 H22荷瘤小鼠血清 IL-2，IL-4的影响（x±s） Tab.1 Effects of SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearing mice（x±s） IL-2（ng/L） IL-4（ng/L） 164.47±10.95 101.36± 6.21 114.68±11.09** 133.21±10.22** 158.10± 8.66▲▲ 99.80± 7.56▲▲ 112.48±11.25** 93.97± 4.77▲▲ 130.95±15.11**▲▲ 94.88± 6.69▲▲ 组别 n 正常对照组 10 模型组 10 实验组 10 环磷酰胺组 10 联合用药组 10 胺组：生理盐水灌胃 0.02 mL/（g·d），腹腔注射 CTX [30 mg/(g·d)] 0.2 mL；联合用药组：白附子混悬液 [825 mg/（kg·d）]灌胃 0.02 mL/（g·d），腹腔注射 CTX [30 mg/（kg·d）] 0.2 mL。 以上各组均从实验第 2天开始给药，每日 1次， 连续 10 d。称质量后，眼球取血，颈椎脱臼处死，以 75%乙醇浸泡消毒后剥离瘤组织。 1.7 测定方法 1.7.1 小鼠外周血 IL-2水平的测定 原理：酶标双 抗体夹心法。1）小鼠眼球取血，置于离心管中，分离 血清（3 000 r/min，离心 5 min）。2）从密封袋中取出 所需板条，平衡至室温。3）除空白孔外，分别将标本 或不同浓度品（每孔 100 μL）加入相应孔中，用 封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵箱孵育 90 min，洗板 4次。4）除空白孔外，加入生物素化抗体工作液（每 孔 100 μL）。封住板孔，37 ℃孵箱孵育 60 min，洗板 4 次。5）除空白孔外，加入酶结合物工作液（每孔 100 μL）。封住板孔，37 ℃孵箱孵育 30 min，洗板 4次。6）加入显色剂（每孔 100 μL），避光 37 ℃孵箱 显色 15 min，加入终止液（每孔 100 μL），混匀后即 刻测量 OD492值（5 min内）。 1.7.2 小鼠外周血 IL-4水平的测定 实验原理、方 法基本同于 IL-2测定。 1.7.3 流式细胞术（FACS）法测定 T淋巴细胞 CD4+ 和 CD8+细胞亚群 取抗凝血 100 μL放于试管中， 分别加入抗 CD4-藻红蛋白（PE）和抗 CD8-异硫氰酸 荧光素（FITC）单抗各 10 μL，置室温避光 20 min，加 入红细胞裂解液 2 mL，离心弃上清液，加磷酸盐缓 冲液（PBS）洗液 2 mL混匀，离心后弃上清液，加入固 定液 600 μL，4 ℃存放至少 30 min后，流式细胞仪 测定。 1.8 统计学方法 计量资料用均数±标准差（x±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差 异有统计学意义。 2 实验结果 2.1 白附子混悬液对 H22荷瘤小鼠血清 IL-2，IL-4 的影响 见表 1。模型组与正常对照组比较差异有 统计学意义（P<0.01）。实验组与模型组比较差异有 统计学意义（P<0.01），结果接近正常对照组水平 （P>0.05）。环磷酰胺组的 IL-2水平与模型组比较无 统计学意义（P>0.05），与正常组比较差异有统计学 意义（P<0.01）；而 IL-4 水平低于模型组（P<0.01）， 表明 CTX（环磷酰胺注射液）对荷瘤小鼠 IL-2的表 达无明显调节作用，且有较强的抑制作用。联合用 药组 IL-2 水平与模型组比较差异有统计学意义 （P<0.01），与正常对照组比较差异有统计学意义 （P<0.01），说明两药合用后能够调节机体的免疫状 态，降低 CTX(环磷酰胺注射液)的免疫抑制作用， 但尚不能使 IL-2 水平得以完全纠正。 2.2 白附子混县液对 H22荷瘤小鼠外周血 CD4+、 CD8+细胞的影响 见表 2。模型组与正常对照组比 较差异有统计学意义（P<0.01）。实验组与模型组比 较差异，有统计学意义（P<0.01），结果接近正常对照 组水平（P>0.05），能够使 CD4+细胞回升，CD8+细胞有 所回落，明显改善 CD4+/CD8+的失衡状态。环磷酰胺 组与正常对照组和模型组比较差异均有统计学意 义（P<0.01），CD4+细胞、CD8+细胞均明显降低。联合用 药组的 CD8+细胞水平接近正常对照组（P>0.05），CD4+ 细胞水平与正常对照组比较差异有统计学意义（P< 0.01），说明两药合用能够部分改善环磷酰胺的抑制 作用，调节机体 CD4+/CD8+失衡状态。 3 讨论 荷瘤小鼠外周血 T细胞亚群比例出现异常，表 327 天 津 中 医 药 Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine 2011年 8月第 28卷第 4期 Aug． 2011,Vol．28 No．4 现为 CD4+T细胞减少，CD8+T细胞增多，这些变化可 以通过 CD4+/CD8+比值得到更敏感的反映。即荷瘤机 体 CD4+/CD8+比值下降，小鼠机体免疫功能减弱。CD4+T 细胞可分化为 TH1细胞和 TH2细胞，其诱导因素 有：由感染引发的细胞因子[主要是干扰素（IFN）-γ、 IL-12和 IL-4]、启动免疫应答的协同刺激信号以及 肽-主要组织相容性复合物（MHC）的性质。IL-4可促 进 CD4+T细胞分化成 TH2。模型组荷瘤小鼠 IL-2 水平明显下降，IL-4水平明显升高，说明荷瘤小鼠 免疫功能处于紊乱状态，TH2细胞相对处于优势地 位，抑制了抗肿瘤特异性免疫应答 TH1细胞的优势 状态。 用白附子混悬液治疗后，能使荷瘤小鼠 CD4+ T 细胞表达增加，CD8+ T细胞表达降低，可以明显改善 CD4+/CD8+比值的失衡状态，恢复机体正常的免疫状 态，从而发挥抗肿瘤的作用。同时白附子混悬液能 够促进荷瘤小鼠 IL-2的表达，使 IL-4水平有所下降， 使荷瘤小鼠的 IL-2、IL-4水平接近正常对照组，说 明白附子混悬液能够促进荷瘤小鼠 TH1型细胞因 子的表达，使荷瘤小鼠由 TH2型细胞因子优势状态 向 TH1型逆转，纠正 TH1/TH2漂移，从而增强荷瘤 机体的细胞免疫功能，提高荷瘤机体的抗肿瘤能力。 白附子混悬液与 CTX合用后，CD4+细胞、CD8+细 胞均有所回升 CD8+细胞水平接近正常对照组，说明 两药合用能够部分改善 CTX对荷瘤小鼠的细胞免 疫抑制作用，调节机体 CD4+/CD8+的失衡状态。同时 能使 IL-2表达水平提高，说明两药合用后能够调节 荷瘤机体的免疫状态，降低 CTX对荷瘤小鼠细胞免 疫的抑制作用，但尚不能使 IL-2水平得以完全纠正。 综上，白附子混悬液可以改善荷瘤机体 CD4+/ CD8+的失衡状态，促进 IL-2等 TH1型细胞因子的 表达，纠正荷瘤机体 TH1/TH2漂移，提高荷瘤机体 的细胞免疫功能而发挥抗肿瘤效应。 参考文献： [1] 孙 燕，赵 平．临床肿瘤学进展[M] .北京：中国协和医科大学 出版社，2005：3－8． [2] 詹启敏.分子肿瘤学[M] .北京：人民卫生出版社，2005：66－104． [3] 姜文奇，张晓实，朱孝峰．肿瘤生物治疗学[M] .广州：广东科学技 术出版社，2006：4－7． [4] 陈丙英，陈子兴．分子生物学基础与临床[M] .福州：东南大学出 版社，2000：15-30. [5] 张天泽，徐光炜．肿瘤学[M].天津：天津科学技术出版社，2005:825. [6] 于晓红，梅 蕾，颜培宇，等．山核桃树枝水煎剂对荷瘤鼠 P53和 PCNA基因表达的影响[J].天津中医药，2007，24（5）：399－401． （收稿日期：2011-04-26） The immune adjustment mechanism of anti-tumor efficacy of SGTR on H22 tumor bearing mice YU Xiao-hong1, SONG Na1, HU Yan-wen2 (1. Department of Microbiology and Immunology, Heilongjiang University of TCM, Harbin 150040, China; 2. Maternal and Child Health Hospital of Tianjin Tanggu District, Tianjin 319000, China) Abstract: [Objective] Study the adjustment function of SGTR on the immune system of tumor-bearing mice and investigate the immuno- logical mechanism of the inhibition function of SGTR on tumor’s growth. [Methods] H22 tumor bearing mice were as the research object. We measured the levels of IL-2 and IL-4 in serum with ELISA method, and the influence of SGTR on CD4+、CD8+ T cell with FACS method. [Results] SGTR can improve the expression of IL-2 cytokines in H22 tumor bearing mice's serum, lower the level of IL-4, increase the expression of CD4+ T cells, and reduce the expression of CD8+ T cells in H22 tumor bearing mice. [Conclusion] SGTR could play a role of anti-tumor activity by regulating the body’s abnormal immune function in tumor-bearing state. Key words：SGTR; H22 cells; immune regulation 328