魏氏梭菌病诊断方法研究进展

动物医学进展 。2007，28(7)：88—93 Progress in Veterinary Medicine 魏氏梭茵病诊断方法研究进展 李云霄，金 鑫 ，张 营，单雪梅 ，于 丹 (延边 大学农学院 。吉林龙井 133400) 摘 要：魏氏梭茵病是 由魏氏梭茵引起的，可感染多种动物，以导致犊牛肠毒血症、绵羊羔痢疾、仔猪坏 死性肠炎以及兔肠炎等为主要特征的一种重要的人兽共患传染病。该茵通常感染 2月龄～10月龄且膘情 较好的牛、羊，在其消化道产生大量原毒素，经胰蛋白酶激活变为毒素，从而进入血液，引发的疾病发生非常 突然，与家畜“猝死症”有密切联系。病理变化以全身实质器官出血为突出特征，反刍动物以瓣胃、肠管最为 明显。目前，已成功研制出浓缩氢氧化铝灭活苗、类毒素疫苗来控制此病。文章综述了近年来针对魏氏梭茵 分型，病原、毒素及抗毒素的免疫学和分子生物学等方面诊断技术研究进展。 关键词：魏氏梭茵病；魏氏梭茵毒素；魏氏梭茵分型；诊断技术 中图分类号 ：$852．617 文献标识码 ：A 文章 编号 ：1007—5038(2007)07—0088—06 魏氏梭菌 (C2ostridium welchii)，也称产气荚 膜梭茵 (Bacillus perfringens)，是一种广泛分布于 自然界中的条件性致病菌[1]。此菌 1892年英国人 welchii最早从一个腐败人尸体中产生气泡的血管 中分离得到。我国于 1964年由湖北畜牧特产研究 所首次从患红痢仔猪中分离出魏氏梭菌。在我国， 2O世纪 8O年代末期，魏氏梭茵病仅在豫东地区零 星发生，1994年之后，在山东、宁夏、吉林、辽宁、新 疆等省市暴发了大规模的魏氏梭菌病[2]，并蔓延至 全国。目前该病已广泛分布于世界各地，呈全球流 行态势，严重危害各国畜禽业发展，成为动物传染病 学、兽医微生物学的研究热点。 魏氏梭菌与家畜“猝死症”有着密切的联系。自 20世纪 80年代中期以来，在我国大约 20多个省市 自治区的牛、羊、猪等多种动物 中出现 了一种发病 急、病程短、无任何前期征兆而突然死亡，致死率极 高的疾病。根据发病特征，人们将其称为“猝死症” (sudden death syndrom SDS)。因各地报道病因不 一 ，我国农业部专门成立了全国家畜“猝死症”研究 攻关课题组，经广泛调查与实验室检查，确定其主要 病原为魏氏梭菌。 目前，魏氏梭菌病的病原学检测主要采用动物 试验；抗原、抗体检测则主要针对各型魏氏梭菌所分 泌的毒素及其抗毒素，有各种免疫学试验、分子生物 学试验等；分型鉴定根据毒素中和试验、毒素分析及 ELISA、PCR分型等检测手段可确定各茵型。近几 年来，魏氏梭菌病流行 日趋严重，随着研究的深入， 各种诊断技术也被广泛地应用于本病的诊断之中。 1 主要毒素 魏氏梭菌能产生多种外毒素或酶类，致病因素 是其所产生的外毒素。到 目前为止，已发现的外毒 素有 12种(o【，p，7，占，￡，Tl，0 Jc， ， 和 v)，但以 o【、 p、￡和 c这 4种外毒素最重要[3]。根据魏氏梭茵所 合成分泌的主要毒素可将其分为 A、B、C、D及 E型 5个毒素型L4]。魏氏梭菌分泌的主要毒素如表 1。 表 1 各 型魏氏梭菌 及其分泌的主要毒素 Table 1 Toxin of aostridieum toelchii 注 ：“+”表不分 泌毒素 l“一”表示不分 泌毒素 。 Note：“+ ”means excrete toxinsl“一 ”means unexcrete tomns． 近年来，国外对于魏氏梭菌 4个主要外毒素的 组成、结构、作用机理、检测及分子遗传学等方面进 行了较 为深入的研究[5． ，并取得了很大进展 。国内 对魏氏梭菌的研究大多集中在 a和 8。这 2种外毒 素上，且主要着眼于这 2种毒素基因的克隆与表达， 未见深入研究其致病机理的报道；8 毒素是牛致死 性肠炎、肠毒血症及其并发症主要致病因子[7]，国外 收稿 日期 ：2007-04—18 作者简介：李云霄(198O一)，男，吉林德惠人，主要从事动物传染病免疫学诊断及综合防制研究。*通讯作者 维普资讯 http://www.cqvip.com 李云霄 等 ：魏 氏梭菌病诊 断方法研究进展 89 已经进行了大量研究，而我 国对 Gz和 ￡毒素进行研 究的报道极少；对 c毒 素的研究几乎是一 片空 白，大 大落后于国外的研究[8]，这与魏 氏梭菌对我 国畜牧 业产生的巨大危害是很不相称的。 2 诊断方法 2．1 病原 学检测 2．1．1 小 鼠致死试验 于尾静 脉注射含魏 氏梭 菌 毒素的检样或其稀释液，10 min或数 min内发病、 死亡。可用魏氏梭菌 A、B、c、D、E抗毒素血清作毒 素中和试验，进行鉴别 。 2．1．2 兔泡沫肝试验 用魏 氏梭菌 给兔静 脉接种 后，兔肝肿胀成泡沫状，比正常肝大 2倍～3倍，且 肝组织成烂泥状 ，一 触即破。肠 腔 中也产生 大量的 气体，因而兔腹围显著增大。 2．1．3 豚鼠皮肤蓝斑试验 分点皮内注射魏氏梭 菌检样 0．05 mL～0．1 mL，经 2 h～3 h后静脉注射 10~／／o～25 伊文斯蓝 1．0 mL，30 min后观察局部毛 细血管渗透性呈亢进状态，一般于 l h后局部呈环 状蓝色反应 ，即为阳性 。 2．1．4 结扎肠绊试验 将魏氏梭菌接种于 DS培 养基，37-c培养 18 h～24 h，取检样于麻醉手术下注 入兔肠管结扎段内，90min后测量结扎肠管 的长度、 积液量，邻近肠管段内注入生理盐水做对照。回盲 结合部位上端 50 cm处不宜做试验，因其易呈非特 异性阳性反应，可用精制的 CPE对家兔做免疫注 射，可获得特异性抗 CPE血清，用于免疫学检测。 2．2 魏 氏梭 茵分型 魏氏梭菌血清型在世界各地分布均不同[g]。 Hagan W A等(1988年)指出 A型魏氏梭菌分布于 世界各地，能在土壤中生长繁殖，也能在人和动物肠 道生存，该血清型主要对人的伤 口感染，而 B、C、D 和 E型魏氏梭菌更适应 于动物肠 道 ，这些血清型不 能在土壤中存活，它们在肠道感染导致动物坏死性 肠炎和肠原毒血症。欧美等国对魏氏梭菌研究发现 C、D型魏氏梭菌是 引起感染 的主要血 清型[1。。。Ni— ilo L(1980年)和 Uzal F A(1996年)明确指 出，D型 魏氏梭菌是牛 、山羊 、绵羊肠 原毒血症 的病原体 ，B、 E型魏氏梭菌偶尔出现，但我国报道的与国际上菌 型不一致，多为 A型，各疫区是否全是 A型致病，是 值得深入研究的问题。 魏氏梭菌产生的不同毒素可以引起不同的临床 症状，正确识别并区分毒素类型可以为疾病的治疗 及预防提供科学依据。传统分型试验主要采用中和 保护试验来判断魏氏梭菌型别。SonserJ G等首次 利用蛋白质电泳技术表现不同型间菌体蛋白图谱差 异性和各菌 型的特异 性 ，来鉴 定细菌 不 同血 清型。 杨明凡等(2000年 )首次应用 SDS_PAGE电泳技术 对 A、B、C、D和 E 4个型魏 氏梭菌的菌体蛋 白和膜 蛋 白进行分析 ，进行 了该 菌的菌型鉴定 。结果表 明 菌体蛋 白图谱 中 A 型缺少 54．9 ku蛋白条带 ，C型 缺少 107．8 ku和 36．1 ku蛋 白条 带 ，D型 缺 少 107．8 ku和 66。6 ku蛋 白条 带。在膜蛋白图谱中仅 B型有 91．7 ku蛋 白条带 ，但缺少 51 ku蛋白条带 ，C 型缺少 74。2 ku蛋 白条 带 ，D型缺少 31 ku蛋白条 带 ，但 比其他 3个型 多 1个 24．3 ku蛋 白条带 ，且 38．1 ku蛋 白条带极弱 。 用 ELISA方法也可对分离到的魏氏梭菌进行 型别的鉴定。Aschfaik和 Laitinen(2002年)首次采 用敏感性和特异性均较 高的 PCR—ELISA方法的从 野生动物肠内容物中分离出魏氏梭菌并成功的进行 菌型鉴定 。柴 同杰 等 (2001年)所建立 的试 验可 以 区分魏氏梭 菌型别 ，且 0与 ￡毒素的鉴别得到 鼠中 和实验的验证。其测得犊牛舍空气悬载魏氏梭菌中 A型为最多，次者是 D型 ，再次为 C型 ，但 B型无法 证实。此与 Collee(1974年)和 Bisping(1988年)试 验的结果相吻合。 目前 ，在魏 氏梭菌的分型技术方面 ，研究者们做 了许多工作，PCR等技术已应用于该菌的分型。 Warren等(1999年 )应 用 PCR 对福 尔马林 固 定 、石蜡包埋 的山羊和绵羊组织 中的魏氏梭菌的 a、G 和 ￡毒素基因进行检测，结果分别扩增出247 bp(a 引物)、l 025 bp(0引物)和 403 bp(￡引物)DNA 片 段，并在 13个已知的魏氏梭菌感染阳性的样品中， 检出 11个阳性 ，而阴性对照则无一扩增 出 DNA片 段。Kadra等(1998年)应用 PCR对不同来源的魏 氏梭菌进行毒素分型，对试验的 90株菌株先用经 典的细菌学方法进行鉴定并用小 鼠血清中和试验定 型。然后采用了单基 因、双基因和三基因扩增法， 对 a、G和 ￡毒素基因，通过 PCR对所有的试验菌株 进行了分析。证 明 PCR用 于魏氏梭菌的分型是可 行的，其特异性和敏感性均优于经典的方法，因而 PCR有可能成为魏氏梭菌鉴定和分型的首选工具。 Miserez(1998年)等用特异性 PCR对分离至死 于肠 毒血症的绵羊和山羊及屠宰的健康动物的魏氏梭菌 进行 a、G和 ￡毒素基因的检测，结果从具有肠毒血 症病理变化的全部 52只动物分离的魏氏梭菌中均 检出了a、0和￡毒素基因，但未检出 B毒素基因，因 而将这些分离株鉴定为 D型魏氏梭菌。而从健康 动物分离的菌株仅检出 a毒素基因，确定为典型的 A型魏氏梭菌。PCR检测与经典的小鼠毒素致死 维普资讯 http://www.cqvip.com 90 动物医学进展 2007年 第 28卷 第 7期(总第 166期) 性测定之间具有 良好 的相关性 。 多重 PCR方法也可进行魏氏梭菌分型。Baums C G等嗍建立了能对魏氏梭菌进行分型的多重 PCR 方法，可直接从加热裂解的细菌上清中检测和区分 cpa(a)、cpb(61)、etx(￡)、iap(‘)、cpe(肠毒素)和 cpb2 ( )等毒素基因，并且具有很好的特异性和重复性。 A1一Khaldi等建立了可区分 cpb、etx、cpe、cpa和 lap等 毒素基因的DNA芯片技术，并对临床分离的 8株魏 氏梭茵进行了鉴定，认为与传统分型方法所得出的结 果相一致m]。张小荣等(2002年)首次将此方法应用 于羊猝死症的诊断研究，根据基因文库中已发表的魏 氏梭茵毒素基因序列，分别设计出针对 a、B、￡和 c4种 分型毒素基因及针对 CPE和 毒素基因序列的6对 特异性引物，进行了多重 PCR扩增和 PCR扩增产物 的鉴定，并首次在羊源魏氏梭茵分离株中发现 毒素 基因。 如上所述，P(’R作为一种特异敏感的检测方法在 魏氏梭茵的分型有着极其 良好的应用前景。 2．3 抗毒素检测 检测抗毒素虽有较好的敏感性和特异性，但制 备抗毒素过程十分繁琐，且需将其检测毒素抗原进 行纯化，故此项检测不常应用。 王云峰等(1995年)建立了可以定量测定血清 抗毒素效价的 Dot-ELISA检测魏氏梭茵毒素抗体 的诊断方法，对粗提毒素经过 Sephadex G-200进一 步纯化后，有效地去除了已糖、核酸、脂肪酸、磷脂等 物质，制备了用混合纤维素酯微孔滤膜作为固相载 体的检测兔魏氏梭茵毒素抗体的快速诊断膜，其 Dot—ELISA与 SPA-ELISA 对比差异不显著(P> 0．05)，两者阴、阳性符合率为 89．O6 。郭明章等 (1985年)采用二次硫酸铵盐 析和一 次 Sephadex C-- 100柱层析，有效地纯化了 A型魏氏梭茵毒素，用纯 化的A型魏氏梭茵毒素包被酶联微量板，以葡萄球 菌 A蛋白(SPA)代替第 2抗体，建立了检测型魏氏 梭茵的 SPA介导的酶联免疫吸附试验(SP ELL— SA)。结果 表 明 SPA-ELISA 与 间 接 血凝 试 验 (IHA)检 测兔 血清 有很 高 的符 合 率。用 SPA- ELISA和 IHA检测，阳性率分别为 39．1 (18／46) 和 32．6 (15／46)。SPA-ELISA与 IHA检测兔血 清，符合率为 90．0 ，此法敏感性 比 IHA高约 2O 倍，可用于检测 A型魏氏梭茵抗毒素。 2．4 毒素检测 · 毒素检测对于诊断魏氏梭菌病极其重要m]。 经典方法包括动物致死性试验，毒素抗毒素中和试 验，卵磷脂水解试验等多种方法，其中以毒素抗毒 素中和试验最 为特异 ，但这些方法均费时费力 ，敏 感性较低。随着生物技术的不断发展，一些新的技 术在毒素的检测中得到了广泛的应用。 2．4．1 免疫学方法 2．4．1．1 火箭免疫电泳 Bch和 Buttery利用火箭 免疫电泳和反向间接血凝检测禽魏氏梭茵 e毒素的 样品，结果表明前者的敏感性并不比中和试验高， 而后者虽然敏感性相对高一些，但魏氏梭茵某些株 本身可产生凝集素，致敏红细胞的不稳定性，易于 造成假阳性结果，且操作较繁琐，故此法不常用。 2．4．1．2 微量法 Macfarlane等将卵磷脂酶活性 作为魏氏梭茵 a毒素测定的一个指标，Murata(1956 年)、Schemanovr等(1968年)、Ken-ichiro(1973年) 均报道过粗制 a毒素和精制 a毒素的卵磷脂酶活 性，并使用微量法。分别对精制魏氏梭茵 a毒素和 粗制 a毒素的卵磷脂酶活性作了测定。所有这些都 是以毒素为参考单位，如果在没有标准毒素的 情况下，以毒素蛋白与卵黄反应的最大反应滴度为 单位表示 a毒素，即微量法测定。我国吕存女等 (2000年)以魏氏梭茵培养滤液经硫酸铵分段盐析、 丙酮分段沉淀及凝胶过滤得到精制 a毒素。并在 96 孔细胞板上，经卵黄反应浊度(微量)法测定精制 a 毒素及培养滤液卵黄反应滴度分别为 1：32 768和 1：2 048，是魏氏梭茵 a毒素的一种快速、简便的检 测手段 。 2．4．1．3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 目前采用 较多是用 ELISA检测魏氏梭茵各种毒素，McCuane 和 Poxfton研究小组首先制备了魏氏梭茵 CPE的 单克隆抗体，并成功建立了单抗双抗体夹心 ELISA 测定魏 氏梭茵 ￡毒素的检测方法；Rosskopf、St— reicher U等利用针对魏氏梭茵 ￡毒素的单克隆抗 体，通过建立竞争 ELISA直接检测兔血清中的抗毒 素含量，同时还将这一方法在国际上几个不同实验 室之间加以验证，以确定不同的实验室都能得到相 一 致的结论。 ELISA亦可用于检测纯培养物中的c毒素，该方法 已应用于动物肠毒血症的诊断。Yongiu Kin等报道了 用 ELISA检测病人血清中的CPE抗体，ELISA读数高 的样本其对应的人可能是正患严重的魏氏梭茵食物中 毒或长期无症状的携带少量CPE的人。 Hale M L等[1。 提出了一种测定 a毒素的捕获 抗体 ELISA，该法能准确而特异性地定量测定魏氏 梭茵所产生的 a毒素，且与蜡样芽孢杆菌的磷脂酶 C以及包括双酶梭菌、诺唯氏梭茵等多种细菌的培 养物滤液均不发生交叉反应。其检测极限可低达 维普资讯 http://www.cqvip.com 李云霄等：魏氏梭菌病诊断方法研究进展 91 19 ng／mL，因而用这种方法检测 a毒素比磷脂酶 C 活性测定和小鼠致死性测定等方法更敏感。Layana J E等n。 利用特征性 的捕获 ELISA检 测了肠 内容 物与体液中 D型菌的￡毒素。对 15只绵羊的十二 指肠、结肠 、回肠内容物和心包积液、腹水、尿液中的 ￡毒进行检测。￡毒素在回肠检测率达 92 ，在十二 指肠检测率达 64 ，在结肠检测率 达 57 ；在心包 积液中为 7 ，在感染羊 与阴性对 照羊腹水、尿液 中 均没有检测到 ￡毒素。结果表 明使用特征性的捕获 ELISA适用 于检测肠 内容物 的 D型毒素。 Uzal F A 等n 比较 了多克隆 的捕获 ELISA (PC-ELISA)、单克隆的捕获 ELISA(MC—ELISA)、 中和试验(MNT)、对流免疫 电泳(CIEP)4种方法检 测肠内容物和体液的 ￡毒素。利用人工穿刺方法获 取绵 羊 肠 内容 物 ，其 中 PC—ELISA 检 测 0．075 MLD5o／mL，MC-ELISA检测 25 MLD5。／mL，人工 穿刺测心包积液毒 素 PC-ELISA、MC-ELISA分 别 为 0．075、0．75 MLD 。／mL。51份绵羊和 山羊样本 (MNT检 测结 果 32阳性 19阴 性 )通 过其 中 PC- ELISA和 MC-ELISA分析其相对灵敏度分别为 93．75 和 84．37％ ，相对 特异性分别为 31．57％和 57．89 ；绝对灵敏度分别 为 90．90 和 69．69 ， 绝对特异性为 100 ，Uzal F A 等分析结 果显示 4 种方法比较检测 ￡毒素显著不一致，并同时指出PC- ELISA方法比其他 3种要好 ，因为 PC-ELISA具有 较高的灵敏度和特异性，能够测出在机体中存在而 未致病 ￡毒素的浓度 2．5 分子生物学方法 2．5．1 PCR方法 Fach等 (1993年)首先报道 了 ，应用聚合酶链反应(PCR)检测魏氏梭菌 a毒素，通 过对 a毒素基因进行扩增 ，基 因片段经过 限制性内 切酶分析，特异性非常高，且在扩增后 2 h内即可获 得结果，此方法还可以对粪便样品中的细菌进行检 测，其敏感度可达 2．95×10。个菌／g，当用套式 PCR 检测时，对细菌 的检测极 限更 可低 至 1个 ～6个 菌 体。 Kanakara(1998年)提出检测魏氏梭菌 a毒素 和肠毒素基因的复合 PCR方法，用此方法鉴定分离 自猪粪便和肠内容物及饲料中的魏氏梭菌的肠毒原 性分离株。先将细菌在胰蛋白一亚硫酸盐一环丝氨酸 酸(TSC)琼脂、无卵黄 TSC琼脂、绵羊血琼脂上或 脑心浸液肉汤或熟肉培养基中进行培养，然后煮沸 抽提 DNA进行 PCR，扩增 出 319 bp的 a毒素基因 片段和 364 bp肠毒素基因片段 。对 97个粪便和肠 内容物分离株进行检测，其中 89株扩增出a毒素基 因片段 ，所有样品均未扩增 出肠毒 素基 因。具有魏 氏梭菌表型的分离株中 ，91．8 为 a毒素基 因阳性。 饲料样 品，43 为细 菌培养 阳性 ，48．3 为 PCR检 测 a毒素基 因阳性 。表明 PCR可用于快速检测饲 料中的魏氏梭菌和验证其他方法的鉴定结果。 Amimoto K 等口 首次发现了在 C型魏氏梭菌 上清液中的细胞毒素 TpeL，并采用 PCR检测了 18 份样品的 TpeL基 因，其 中 B型检 出 1份，C型检出 5份 ，而余下 A型 12份没有检出。但通过斑点印迹 却在 B型 中没 有检 出，Amimoto K 推断 细胞毒素 TpeL可能类似于梭菌大毒素。此外 ，另有数据显示 细胞毒素 TpeL是 由 C型产生的。 2．5．2 多重 PCR Me Fernandez等(2003年)建立 了测定 山羊粪便 中 4种不 同魏 氏梭菌毒素的多重 PCR技术，每克粪便可检 出 2×10 个魏 氏梭菌。 Heikinheimo A等n。]设计 了一对 cpa引物 ，检测 了 从雏鸡 分离 出 的魏 氏梭 菌 的 cpa(a)、cpb(G)、etx (￡)、iap(t)、cpe(肠毒素)的编码基因，结果检测出魏 氏梭菌 cpa毒素基因的存在，没有 cpb，etx，iap和 cpe基 因 ，表 明鸡群是 由 A型魏 氏梭菌感染。YO0 等于 1997年建立了测定魏 氏梭 菌所 产 4种毒素的 多重 PCR，比Uza1．FA等的方法好一些，但是 Yoo 等的方法也存在不足，即需要提取 DNA。为克服 PCR的不足，2004年龚玉梅等[173建立了简单、具有 型特异性的魏氏梭菌的多重 PCR方法。将 A、B、C 和 D型魏氏梭菌和其他几种对照菌制备成后， 多重 PCR产物的电泳结果显示 ，A、B、C和 D型魏 氏梭菌均扩增出与相应引物大小相 同的片段 ，其他 菌均为阴性 ，敏感性 为含 菌量 4．2×10 cfu／mL，单 个菌落即在 10倍稀释后也能够被检测出。Crespo R等 印研究采用多重 PCR回顾分析了 1997年一 2005年的 31个来 自鸡、火鸡、鹌鹑和鹦鹉等鸟类的 坏死性和溃疡型肠炎病例和案例，并用没有分离到 魏氏梭菌的患病的鸟类作对比，发现不管是病例还 是案例均是由 A型魏氏梭菌引起，均发现了 8。毒 素，但 90 健康鸟类同样可以分离到 』3。毒素，表明 I3。毒素和鸟类坏死性肠炎之间没有必然的联系。 2．5．3 Real—time quantitive PCR技术 1996年 由 美 国 Applied Biosystems公 司 推 出，不仅 实 现 了 PCR从定性 到定 量 的飞 跃 ，而且 采 用全 密 闭管检 测 ，不需 PCR后处理 ，避免 了交叉污染 ，具有特异性 更强、可有效解决 PCR污染问题，且 自动化程度高 等特点，与其他分子生物学技术的联合应用，可以对 微生物进行定性和定量研究 。 Wise M G口 利 用荧 光 发生 素通 过 Real—time 维普资讯 http://www.cqvip.com 92 动物 医学进展 2007年 第 28卷 第 7期(总第 166期 ) quantitive PCR定量的检测 了鸡盲肠 中的魏 氏梭菌 的样本 ，以魏 氏梭菌 16 S rRNA基 因片段作标准模 板在荧光定量 PCR仪上作实时 ，检测并绘出标准曲 线。结果表明 ，标 准 品 DNA 的拷 贝数与 循环 阈值 的相关值为 0．956，该定量 PCR法 检测的魏氏梭菌 目的基 因 片 段 的 最 小 检 出 量 小 于 1O个 拷 贝。 Skanseng B等[2妇分离 了来 自于挪威鸡 群肠道 内包 含 a毒素基因的魏氏梭菌，采用一种 自动高流量 DNA纯化方法提取了致病毒素基因，结果 a毒素在 鸡的盲肠部位显示了正相关(P一0．009)，在低于表 现值(P一0．008)时，也依然能够检测出较高浓度的 a毒素。Wise M G等[2妇用荧光发生素、水解探针两 种 quantitative real-time PCR方法 ，检 测 了经食 源 性感染的呈现坏死性肠炎鸡的盲肠和回肠病料。引 物和探针的选择是经 由 16 S rDNA，并 证明具有其 特异性。能检测出约 5O fg魏氏梭菌基因组 DNA， 在纯培养物中能检测到大约 2O个细胞 ，与采用穿刺 检测回肠病料 的结果相 一致。并指 出 Real—time quantitative PCR方法与定量标准平板计数之间有 密切的关系。 3 展望 检测魏氏梭菌的最经典、最准确的检测方法是毒 素中和试验，但同时也存在着试验中会出现非特异性 死亡，造成误判，且试验周期较长等缺陷。近 1O余年 来各国研究者相继研制出了一些替代方法，如凝集试 验、沉淀试验、放射性免疫试验等。但是有些方法易 出现非特异性反应或需制备魏氏梭菌毒素和抗毒素 等。另外，免疫学试验均是直接检测毒素或抗毒素， 而最近研究发现有些魏氏梭菌在体内或常规培养基 生长时毒素基因根本不表达，不产生特定毒素。 为了改进现有 的检验方法 ，Rosskopf Streieher U等[2。]利用针对魏氏梭菌 e毒素的单克隆抗体，通 过建立竞争 ELISA直接检测兔血清中的抗毒素含 量，同时还将这一方法在国际上几个不 同实验室之 间加以验证，以确定不同的实验室都能得到相一致 的结论，为最终以血清学方法代替毒素中和试验提 供了一个较满意的。 随着分子生物学技术的发展，人们较多采用核 酸探针方法来快速诊断和基因分型。它可以避免使 用细胞培养毒性试验和常规免疫学试验。以往检测 CPE阳性 A型魏氏梭菌，首先必须在体外用特殊的 培养基诱导该菌型呈芽孢，然后再用免疫学方法检 测，而核酸探针技术却不需要。目前世界上几个著 名实验室已相继建立起 了核酸探 针检测方法 ，并证 明采用核酸探针方法比常规免疫学方法更为灵敏、 可靠。在几项研究中，根据魏氏梭菌毒素基因成功 制备 了各种核酸探针 ，以核酸杂交方法检测 a、 、e、c 毒素均获得成功。在比利时，已有人用核酸探针方 法对 750株牛源性的肠毒血症分离株进行试验，发 现 95 以上的菌株都为 A型魏氏梭菌，证明核酸探 针方法可快速区别不同类型的魏氏梭菌。 参考文献 ： [1] Cole A R，Gibert M，Popoff M．Clostridium perfringens epsi— Ion toxin shows structural similarity to the pore2forming toxin aerolysin[J]．Nat Struct Mol Biol，2004，11(8)l 797—798． [2] 张红英，卢中华，杨 霞，等．我国魏氏梭菌病的流行特点[J]． 中国畜牧兽医，2004，31(1)l 39-41． [3] 文其乙，刘秀梵．产气荚膜梭菌的肠毒索的致病机理研究进展 [J]．动物医学进展，2002，23(02)；17—18． [4] Nagahama M，Yamaguchi A，Hagiyama T，et a1．Binding and internalization of Clostridium perfringens iota toxin in lip id rafts[J]．Infect Immunology，2004，72(6)l3267—3275． [5] Fernandez-Miyakawa M E．Fisher D J，POOh R，et a1．Both ep— silon-toxin and beta-toxin are important for the lethal proper- ties of Clostridium perfringens 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ruminate anima1 ． Cur— rently，inactivated vaccine and toxoid vaccine has been developed to control the disease．This paper mainly reviewed the progress in serotype of the pathogen and in immunological and molecular biological diagnosis on the toxin and antitoxin． Key words：Clostridieum welchii disease；Clostridieum welchii toxin；Clostridieum welchii grouping；diag— nostic technique 维普资讯 http://www.cqvip.com