e血小板聚集率24小时节律变化规律研究

的方差分 析。P<0．05认为有显著统计学差异。 结 果 1．肾上腺素(10ug／mL)诱导的血小板聚集率的值于6： 00AM时最高(24．79±10．02ohms)，2：00AM时最低(20．34 ±9．09ohms)，P=0．007。显示早晨起床后血小板聚集率达 到高峰，然后下降，到夜间睡眠2：00AM时达到低谷(Fig．1 及Table1)。 2．胶原(2ug／mL)诱导的血小板聚集率的值于6：00AM 时最高(24．79±4．00ohms)，2：00AM时最低(22．83±3．26 ohms)，但各时间点差别无统计学意义(p=O．087)(Fig．2及 Table1)。 3．花生四烯酸(0．5mM)诱导的血小板聚集率的值于 10：00AM时最高(13．26±2．65ohms)，2：00AM时最低(11．64 ±2．06ohms)，但各时间点差别无统计学意义(P=O．304) (Fig．3及Table1)。 4．腺苷二磷酸(10uM)诱导的血小板聚集率的值于 10：00AM时最高(9．48±3．68ohms)，2：00AM时最低(8．91 ±3．20ohms)，但各时间点差别无统计学意义(P=O．183) (Fig．4及Table2、)。 5．腺苷二磷酸(20uM)诱导的血小板聚集率的值于 10：00AM时最高(10．56±3．02ohms)，2：00AM时最低(9．45 ±3．57ohms)，但各时间点差别无统计学意义(P=O．260) 研究论文 (Fig．5及Table2) 12 研究论文 40 35 30 25 }20 ∽ 一15 1O 5 O 附 图 2：OO 6：00 10：00 16：00 20：00 Fig．1Thecircadianvariationinplateletaggregabilityto epinephrine ，-、 o芎 誊 ∞ 、√ 30 25 20 15 10 5 O Fig．2Thecircadianvariationinplateletaggregabilityto collegan 13 研究论文 16 14 12 10 旦 8 26 4 2 0 2：OO 16：OO lO：00 1．6：00 20：00 Fig．3Thecircadianvariationinplateletaggregabilityto arachidonicacid 14 12 10 2 0 2：00 6：00 10：00 16：00 20：OO Fig．4ThecircadianvariationinplateletaggregabilitytoADP (10uM) 14 8 6 4 ^。≯In瞻v 研究论文 14 12 10 ，_、 o i8 们 6 4 2 0 2：00 6：00 10：OO 16：OO 20：OO Fig．5ThecircadianvariationinplateletaggregabilitytoADP (20uM) 15 研究论文 附 表 Table1 Comparisonamongdifferenttimein platelet aggregationtoepinephrine，colleganandarachidonicacid (Ohms，x±S) 撑Comparewith△,p<0．05 Table2 Comparisonamongdifferenttimeinplatelet aggregationtoADP(IOuM)andADP(20l-tM)(Ohms，z±S) 16 研究论文 讨 论 血小板聚集率检测方法血小板聚集率是一种反映血小 板聚集功能的指标。检测血小板聚集率有很多方法。目前最 常用的是光学比浊法和全血阻抗法。光学比浊法的原理是在 特定的搅拌条件下，在富血小板血浆中加入诱导剂后，由于 血小板发生聚集，悬液的浊度随之下降，光电池将光浊度的 信号转换为电信号，在记录仪上记录下电讯号的变化。根据 描记曲线予以计算血小板聚集的程度及速度。此实验需要制 备富血小板血浆(PRP)：将采集的静脉血放入含有枸橼酸钠 的抗凝管中，混匀，以1000rpm离心10分钟，取上层血浆， 即PRP。 本实验采用的是全血阻抗法，其原理是：在抗凝血液中 插入二电极，通微电流，测定二极之间的电阻值。当电阻与 血液接触时，电极上形成单层血小板，如果不加聚集剂，那 么在单层血小板上不再有血小板进一步聚集，这样二电极之 间的阻抗就恒定。但加入聚集剂后，血液中的血小板就继续 往单层血小板上聚集，二电极之间的电阻就相应增加。仪器 通过检测电阻的变化来确定血小板的聚集率。大样本研究表 明全血阻抗法与光学比浊法有较好的关联性【7】o而且它与比 浊法相比有如下优点：(1)直接使用全血，离体后的血液不 必经过离心分离PRP，从而节省时间，可以在血液离体后立 即检测。减少因血液在体外时间过长导致的自发性血小板聚 集所致的实验误差。有报道指出血小板离体后15分钟即开始 活化。(2)避免因高速离心引起的血小板活化【8】o(3)全血 中的血细胞同时存在，从而真正模拟了体内的生理环境；而 研究论文 Marcus等【9】报告研究明确指出体内红细胞和白细胞都对血小 板的聚集有影响，其缓和或干扰聚集。(4)保存全部血小板， 避免部分血小板因体积太大而在制备PRP时丢失；(5)对于 脂血标本的检测，可以克服光学法检测时因过于浑浊而影响 结果；(6)与光学法相比，检测高凝状态时的血小板功能更 为敏感。(7)用血量少，每次0．5ml的血液即可。 另外，还有一种血小板功能分析仪，即能分析血小板粘 附、聚集功能的仪器PFA．100。该仪器模拟人体内血管损伤 后的初期止血过程。全血通过包被有血小板聚集诱导剂的硝 化纤维膜(后者中央有一直径约150um的小孔)，由于血小 板在诱导剂的作用下发生聚集反应使4,TL发生闭塞，通过测 定4,TL的闭合时间来反映血小板在诱导剂作用下的功能状 况。许多学者研究表明该仪器与血小板聚集仪分析结果具有 较好一致性【10l。 国外已有的研究结果最早研究是Toiler肭【11】对15个健 康人每隔3小时抽一次血(8：00起床)，检测ADP和肾上腺 素诱导的血小板聚集率。结果显示自6：00到9：00，血小板聚 集率持续升高到最高点。他们研究认为早晨血小板聚集率升 高的原因是晨起起床后体位的改变及活动的影响。同样的， Nubilet3】对5名健康男性进行试验，一天内每隔4小时检测 一次血小板聚集率，诱导剂为80mg／ml胶原和lmM／ml肾上 腺素。结果显示在早晨达到高峰，有统计学意义。Brezinskitl2J (n=16)亦研究得出ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集率 上午最高，肾上腺素变化更明显。Brezinski等人认为是早晨 起床体位的改变所致的此结果。 而Jafri[6】的研究结果与上述这些有所不同，Jafri等对9 研究论文 名健康人(51±10岁，男性4名，女性5名)进行实验，发 现ADP及肾上腺素诱导的血小板聚集率昼夜变化无统计学 意义，但肾上腺素诱导的PA显示变化趋势(P--0．16)：与 卧床休息时相比起床后PA开始升高，但高峰是在下午15：00， 他们认为是日间断续的运动导致了PA逐步升高，下午15- oo达到高峰。Fujimurat5】等对6名健康人以28小时为周期， 每隔4小时抽一次血，以ADP，胶原，肾上腺素，花生四烯 酸为诱导剂检测血小板聚集率，同时用玻璃珠法测血小板粘 附率。结果显示四个诱导剂诱导的血小板聚集率均显示两个 高峰，即早晨和下午。而血小板粘附率只在早晨达到高峰。 这些研究均采用PRP的比浊法，且样本量很小。1996 年Andrews等【1】对17名健康人使用全血阻抗法进行检测，于 早晨7点起床前采血，起床站立26±4分钟后再次采血检测， 结果显示ADP及胶原诱导的血小板聚集率显著升高。 Malyszko等【4】研究了10名健康人于7：30，11：30，17：00，23：00， 4：00and7：00时检测。结果显示健康组由胶原、ADP和肾上 腺素诱导的全血血小板聚集率，在7：30时最高，在23：00及 4：00时最低，但由花生四烯酸诱导的无意义。健康人富血小 板血浆由胶原诱导的的血小板聚集率7：30最高，23：00最低， 其他诱导剂无意义。 Dalby等【13】用PFA一100血小板功能分析仪对15名健康 志愿者进行试验，要求实验对象于8：00采血后起床，随后做 一些轻度运动(步行200m且爬两层楼梯)，分别检测8：00 起床前，起床后8：30，以及12：00，17：00的血小板聚集率。 诱导剂为ADP和肾上腺素。结果：ADP及肾上腺素诱导的 血小板聚集率均显示一个趋势，即PA在8：30起床后高于8：00 研究论文 (无统计学意义)，随后降低，在12：00及17：00时，均低于 8：30时，有显著性差异。 绝大多数研究显示早晨PA最高，个别显示下午升高。 但有一共同点：均在夜间休息时达到低谷。学者均认为PA 的变化或与体位改变有关，或与活动有关，或与两者都有关， 而与单独时间因素无关。 本研究结果提示本研究要求实验对象于早晨5：50起 床，并保持直立位直至6：00采血。结果显示肾上腺素诱导的 PA在早晨6：00起床后达到高峰，此后逐渐降低，夜间睡眠 中达到低谷，P<0．01。胶原诱导的血小板聚集率变化虽无统 计学意义，但已有一较明显的趋势，在早晨6：00最高，凌晨 2：00时最低俨=0．087)。同样的，ADP(101．tM)，ADP(20 uM)及花生四烯酸诱导的血小板聚集率节律变化形成一个 趋势，凌晨2：00时最低，晨起后开始升高，上午10：00值最 高，但差别亦无统计学意义。 可能机制讨论本研究进一步证实了晨起直立位对PA 的影响。早晨血小板聚集率升高的机制推测有以下三点：(1) 早晨起床后体内肾上腺素水平升高，预先诱导一定程度的血 小板活化，因而外来的肾上腺素(即肾上腺素诱导剂)诱导 的PA增加【13】。Undar等【14】亦认为早晨体位的改变激活了血 小板，其报道自早晨6：00到9：00血小板活化标志物CD62P (GMPl40)处于升高趋势，随后降低，到午夜达到最低。 Andrews[15】亦研究表明晨起体位的改变刺激身体内儿茶酚胺 的释放，而儿茶酚胺通过血小板膜上Q受体引起了血小板的 活化。(2)NEIL等研究显示体位的改变并未使血小板活化 标志物GPIIb／IIIa和CD62P升高，意即并未激活血小板， 20 研究论文 而是引起血小板数量增加，和血小板容积增大【11。推测是因 为直立位使体内肾上腺素水平升高【16】，导致脾内贮存的成熟 的体积较大的，聚集能力更强的血小板释放，使血小板聚集 率升高【17，18】。(3)晨起体位的改变使体内血管紧张素II水 平升高，Ding掣19】发现血管紧张素II增强了血小板对诱导剂 ADP的敏感性。但Brezinski[12】研究表明在PA与血管紧张素 II间并无有统计学意义的相关性，推测可能血管紧张素II与 肾上腺素协同作用，增强了ADP诱导的血小板聚集。 ADP，胶原，花生四烯酸诱导的血小板聚集率24小时 节律变化规律虽显示一个趋势，但无统计学意义。考虑有以 下原因： (1)这些诱导剂诱导的PA变化本身就不尽明显。 Malyszkot4】等人研究显示健康组由肾上腺素、胶原和ADP诱 导的全血血小板聚集率，在7：30时最高，在23：00及4：00 时最低，但由花生四烯酸诱导的无意义。由胶原诱导的富血 小板血浆的血小板聚集率7：30最高，23：00最低，其他诱导 剂无意义。亦有许多学者研究肾上腺素比ADP诱导的PA节 律变化更加明显【6，11,121。(2)24小时节律变化存在个体差 异。增加实验的样本量可增加实验的准确度。 (3)本研究 于晨起10分钟后采血，不除外PA尚未升高达到最高峰的可 能。增加时间点，如晨起后30分钟和60分钟，可能会使实 验更完善。 限制与不足本实验由于一些客观原因，尚存在以下不 足：1．实验对象均为20～30岁的年轻人，年龄构成单一。而 血小板聚集率有随着年龄的增加而升高的趋势【201，所以中年 人或老年人节律变化亦可能有所不同。2．每次检测均采用5 种诱导剂，但血小板聚集仪只有四个通道，导致检测ADP 研究论文 (201．tM)诱导的血小板聚集率时，血液标本已于体外放置 过长时间(>40分钟)，影响实验结果。3．样本量偏小。 结 论 本研究通过全血阻抗法检测血小板聚集率，发现肾上腺 素诱导的健康人群血小板聚集率存在24小时昼夜节律变化， 早晨6：00起床后达到高峰，此后逐渐降低，夜间睡眠中达到 低谷。胶原诱导的血小板聚集率变化虽无统计学意义，但已 有一较明显的趋势，在早晨6：00最高，凌晨2：00时最低。 ADP及花生四烯酸诱导的血小板聚集率节律变化没有显著 性意义，但显示一趋势，均在夜间睡眠中达到低谷。 研究论文 1 2 3 4 5 6 1’ 参考文献 AndrewsNP， GralnickHR，MerrymanP， et a1． Mechanismsunderlyingthemorningincreaseinplatelet aggregation：aflowcytometrystudy[J]．JAmCoilCardiol， 1996，28(7)：1789—1795 AldemirH，KilicN．Theeffectoftimeofdayandexercise onplateletfunctionsandplatelet—neutrophilaggregatesin healthymalesubjects[J]．MolCellBiochem，2005， 280(1·-2)：119··124 NubileG，D’AlonzoL，ConsoliA，eta1．Circadianrhythm ofplateletaggregationinducedbyadrenalineandcollagen inman[J]．BollSocItalBiolSper，1982，58(15)：947—950 MalyszkoJ，UranoT，KnoflerR，eta1．Dailyvariationsof plateletaggregationinrelationtobloodandplasma serotoninindiabetes[J]．ThrombRes，1994，75(5)：569—576 FujimuraA，OhashiK，EbiharaA．Dailyvariationsin plateletaggregationandadhesioninhealthysubjects[J]． LifeSci，1992，50(14)：1043-1047 JafriSM，VanRollinsM，OzawaT，eta1．Circadian variationinplateletfunctioninhealthyvolunteers[J]．AmJ Cardiol，1992，69(9)：951-954 SharpDS，BeswickAD，O’BrienJR，eta1．Theassociation ofplateletandredcellcountwithplateletimpedance changesinwholebloodandlight—scatteringchangesin plateletrichplasma：evidencefromtheCaerphilly 23 研究论文 CollaborativeHeartDiseaseStudy[J]．ThrombHaemost， 1990，64(2)：211-215 AursnesI，VikholmV．Onapossibleinteractionbetween ADPandmechanicalstimulationinplateletactivation[J]． ThrombHaemost，1984，51(1)：54—56 MarcusAJ，SailerLB．Thromboregulation：multicellular modulationofplateletreactivityinhemostasisand thrombosis[J]．FASEBJ，1993，7(6)：516-522 王学锋，王鸿利，等．血栓与止血的检测应用．上海：上海世 界图书出版公司(第一版)(M)．2002，78 ToilerGH，BrezinskiD，SchaferAI，eta1．Concurrent morningincreaseinplateletaggregabilityandtheriskof myocardialinfarctionandsuddencardiacdeath[J]．NEngl JMed，1987，316(24)：1514-1518 BrezinskiDA，ToilerGH，MullerJE，eta1．Morning increasein plateletaggregability．Associationwith assumptionoftheuprightposture[J]．Circulation，1988， 78(1)：35—40 DalbyMC，DavidsonSJ，BurmanJF，eta1．Diurnal variationinplateletaggregationiwththePFA一100platelet functionanalyser[J]．Platelets，2000，11(6)：320—324 UndarL，AkkocN，AlakavuklarMN，eta1．Flow cytometricanalysisofcircadianchangesinplatelet activationusinganti—GMP一140monoclonalantibody[J]． ChronobiolInt，1999，16(3)：335—342 AndrewsNP，GoldsteinDS，QuyyumiAA．Effectof O 1 2 3 4 5 8 9 加 n 心 乃 H 蝤 研究论文 systemicalpha．2adrenergicblockadeonthemorning increaseinplateletaggregationinnormalsubjects[J]．AmJ Cardiol，1999，84(3)：316-320 16WintherK，HillegassW，ToilerGH，eta1．Effectson plateletaggregationandfibrinolyticactivityduringupright postureandexerciseinhealthymen[J]．AmJCardiol，1992， 70(11)：1051—1055 17ThompsonCB。JakubowskiJA，QuinnPG，eta1．Platelet sizeasadeterminantofplateletfunction[J]．JLabClin Med，1983，101(2)：205—213 18ThompsonCB，EatonKA，PrinciottaSM，eta1．Size dependentplateletsubpopulations：relationshipofplatelet volumeto ultrastructure，enzymaticactivity，and function[J]．BrJHaematol，1982，50(3)：509-519 19DingYA，MacIntyreDE，KenyonCJ，eta1．Potentiationof adrenaline．．inducedplateletaggregationbyangiotensinII[J]． ThrombHaemost，1985，54(3)：717-720 20JovicicA，MandicS．Circadianvariationsofplatelet aggregabilityandfibrinolyticactivityinhealthysubjects[J]． ThrombRes，1991，62(1—2)：65—74 25 综 述 综述 血小板聚集率的研究进展 血小板是血液的重要组成成分之一。其在生理性止血过 程中起着非常重要的作用，也是血栓性疾病的发生机制中一 个重要的环节。正常情况下，血小板以静息状态存在于血液 循环中。当血流改变，血管损伤，或受到化学物质刺激时， 血小板被活化而发生一系列改变，包括血小板变形、粘附、 聚集和释放反应。其中血小板与血小板之间相互粘附形成血 小板团的现象称为血小板聚集。而血小板聚集率是检测血小 板聚集功能的指标。本文从检测血小板聚集率的诱导剂，与 血小板聚集率有关的血小板膜糖蛋白，血小板异质性，健康 人群血小板聚集率的昼夜变化规律对血小板聚集率做一综 述。 l检测血小板聚集率的诱导剂 血小板聚集可由两类不同的机制诱发：一类为各种化学 诱导剂；一类由流动状态下的剪切应变力所致【1】。血小板聚 集诱导剂按其在正常体内存在与否可划分为两类：生理性诱 导剂如花生四烯酸、腺苷二磷酸(ADP)、胶原、肾上腺素 及凝血酶等；非生理性诱导剂如细菌、病毒、免疫复合物、 某些药物如奎尼丁等。大多数的诱导剂协同作用，加深了彼 此的作用【21。在体外的血小板聚集仪测定中，常用的诱导剂 有花生四烯酸、腺苷二磷酸(ADP)、胶原、肾上腺素。以 下分别论述。 1．1花生四烯酸 综 述 花生四烯酸是一类有20个碳原子的不饱和脂肪酸。血 小板及机体绝大多数细胞都有花生四烯酸代谢过程，在不同 的生理和病理状态下起着重要的作用。细胞中的花生四烯酸 一般不游离存在，而是以磷脂的形式酯化在细胞膜中。多种 刺激因子、激素、血氧张力过低或组织损伤都可激活磷脂酶 A2，使花生四烯酸从膜磷脂中游离出来。一部分游离的花生 四烯酸在环氧化酶的作用下转变成过氧化物(PGG2，PGH2)， 再在内过氧化物异构酶的作用下进一步转变成PGD2，PGE2 与PGF2。。在血小板中有血栓素A2(TXA2)合成酶，将内 过氧化物转变成TXA2。这种产物非常不稳定，在体液的寿 命仅30秒，而迅速变成稳定产物TXB2。 前列腺素类物质主要是通过对血小板与血管壁的作用 调节止血与血栓形成过程。在某种程度上PGG2，PGH2， TXA2，与PGE2是血小板激活剂。其中TX．A2是目前己发现 的最强的缩血管物质与最强的血小板聚集剂之一。 诱导剂花生四烯酸代谢分解成TXA2，与血小板膜上的 血栓素A2受体(TXA2R)结合，引起快速的不可逆的血小 板聚集及ADP的释放【3】o 作为诱导剂花生四烯酸常用的浓度是O．5mg／mll41。用比 浊法测定健康人血小板聚集率时，如果结果小于50％，就应 该重做实验，并且确定在再次实验之前确保实验对象没有服 用任何处方或非处方药品【51。 1．2腺苷二磷酸(ADP) 血小板中80％的ADP贮存在致密颗粒中。ADP是比较 弱的诱导剂，它诱导血小板聚集的机制主要是通过TXA2的 形成及颗粒中ADP的释放【7】o而ADP又可进一步引起血小 综 述 板活化和聚集。这是一个级联反应。 低浓度的ADP(O．1～11．tmol／1)诱导的血小板聚集反应 是可逆的(第一相聚集)，聚集后很快解聚。在中等阈值浓 度的ADP(1～21．tmol／L)诱导的血小板聚集反应则为不可逆。 在此浓度下，可见到两个时相的聚集曲线，第二相聚集为释 放反应的产物所致。在高浓度的ADP(5lamol／L)作用下， 聚集反应是不可逆的，由于第一相反应和第二相反应相继发 生，因而形成单一的聚集波。 临床及实验室常采用51．tmol／L、10umol／L及20lamol／L 的浓度来检测血小板聚集率【4，6】。 ADP易受血浆PH值、抑制物及标本温度的影响。 1．3肾上腺素 肾上腺素通过13和Q．肾上腺素能受体的介导可引起双 相血小板聚集，其机制也是通过TXA2的形成及颗粒内容物 的释放【71。其作用浓度为0．1～10lamol／L。肾上腺素可促进细 胞外的钙内流，磷脂酶A的轻度活化及胞质“碱性化”，还 能增强其他诱导剂的血小板作用。 肾上腺素的作用浓度为0．1～10lamol／L。其有较强的温度 依赖性，O．51．tmol／L的肾上腺素在25℃只能诱导一相聚集。 在20％～30％的健康人中，发现由。肾上腺素诱导的血小 板聚集率是降低的【8】o因此如果发现肾上腺素诱导的血小板 聚集率降低，而其他诱导剂诱导的结果正常，则应该结合临 床来评定实验结果。 1．4胶原 血管壁有多种胶原成分，包括I、III、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅷ 和XIII型。血管壁、血小板与胶原间作用是一个复杂的过程， 综 述 因为胶原不仅是很强的强诱导剂，也是粘附蛋白。胶原诱导 的血小板聚集呈不可逆聚集，在聚集出现前有一个延缓期， 至少20一30秒，随后形成一个单相聚集波，在外形改变后聚 集和释放反应同时发生。胶原诱导的聚集是通过ADP的释 放和前列腺素．血栓素系统的代谢产物形成的【9，10】。这可以由 以下证明：环氧化酶抑制剂如阿司匹林，ADP受体拮抗剂如 氯吡格雷，这些药物很好的抑制了胶原诱导的血小板聚集 【11】。致密颗粒中缺乏ADP的贮水池疾病的患者，其胶原诱 导的血小板聚集率明显减弱。 当血小板被胶原刺激后，70％。90％的Q颗粒和致密颗粒 内容物释放。其中致密颗粒释放的产物如ADP可进一步引 起血小板活化和聚集；Q颗粒释放的产物如FN、vWF、TSP 和纤维蛋白原则参与粘附聚集反应。 2与血小板聚集率有关的血小板膜糖蛋白 血小板膜含有多种蛋白质，这些蛋白质往往连接有大量 碳水化合物支链而成为糖蛋白。这些糖蛋白不但对维持血小 板形态及完整性至关重要，并且构成了血小板的各种受体， 使血小板发挥止血及有关的功能。 2．1血小板膜糖蛋白IIb／IIIa(GPIIb／IIIa) 2．1．1GPIIb／IIIa是血小板膜上最丰富的受体，静息血小板中 其分子数为8000～100000个／plt，另有20000～40000个存在于 血小板内，包括Q颗粒，致密颗粒和OCS(开放管道系统) 膜上。当血小板被激活时，这些细胞内受体能在血小板膜表 面表达。GPIIb和GPIIIa在膜上以1：1构成复合物。该复 合物为一完整的功能单位，如复合物解离，其受体功能则丧 失。同时GPIIb／IIIa复合物的空间构型改变而暴露纤维蛋白 综 述 原受体结合部位，导致纤维蛋白原与GPIIb／IIIa相互识别， 导致GPIIb／IIIa进一步的构象改变，而纤维蛋白原的构象亦 发生改变，使纤维蛋白原与GPIIb／IIIa亲和力加强，并引起 跨膜信息传递，血小板进一步活化。 GPIIb／IIIa受体的特异性不强，可与多种配体结合，包 括纤维蛋白原、懈、FN、VN及蛇毒蛋白、凝血酶原等。 GPIIb／IIIa