分离纯化及体内外抗血小板聚集实验

广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶 (L-amino acid oxidase ) 的分离纯化及体内外抗血小板聚集实验 摘 要 目的:从广西眼镜蛇粗毒中分离纯化 L-氨基酸氧化酶 (L-amino acid oxidase )，并对其物理、生化性质及体内外抗血小板聚集作用进行研究。 方法:用Sephacryls-200凝胶过滤，DEAE-Sepharose CL-6B离子交换， CM- Sepharose CL-6B 71子交换层析法分离纯化广西眼镜蛇毒中的L-氨基 酸氧化酶，用 SDS -聚丙烯酞胺凝胶电泳在还原与非还原条件下测定其蛋 白分子量，等电聚焦法测定等电点，比浊法测 w`广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧 化酶对二磷酸腺普 (ADP)、胶原、凝血酶、花生四烯酸 (AA)引起的血 小板聚集率的影响，双抗夹心放免法测定GMP-140含量，并观察血小板超 微结构。 结果:从广西眼镜蛇毒中分离出的 L-氨基酸氧化酶。( L-amino acid oxidase )分子量约为55.2KD，等电点为7.6:生物活性发现，该蛋白 不具有磷脂酶A:和精氨酸酷酶活性，无纤溶及出血活性，能明显抑制二磷 酸腺昔 (ADP)、胶原、凝血酶、花生四烯酸 (AA)引起的血小板聚集， 并呈明显的正相关;明显降低凝血酶诱导的血浆GMP-140水平;减轻血小 板超微结构的损伤程度。 结论:广西眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶能抑制体内外血小板聚集、释放 功能，减轻血小板程度。 关健词:L-氨基酸氧化酶 分离纯化 血小板聚集 GMP-140超微结构 Purification and characterization of L-amino acid oxidase from Guan娜 cobra venom and its antiplatelet effect on human and rabbit Abstract Objective :To purify L-amino acid oxidase from Guangxi cobra venom and study the physical and biochemical characterization,as well as its effect on inhibitting the platelet Methods :By using aggregation in vitro and in of Sephacryls-200 gel vivo 。 filtration刀EAE- Sepharose CL-6B ion-exchange chromatography and CM- Sepharose CL-6B ion-exchange chromatography,a protein with L-amino acid oxidase activity was purified from Guangxi cobra venom and its properties were characterized .SDS- polyacrylamid gel electrphoresis(SDS-PAGE) was used to analyze its molecular weight at both reducing and non-reducing conditions.The isoelectric point was estimated by the isoelectricfocusing electrophoresis. The platelet aggregation induced by ADP ,thrombin,collagen and AA was measured by turbidinmetric method .The level of GMP-140 was measured by immunoradiometry .The ultrastructures of platelet were observed by the electron microscopy as well. Result:The purified L-amino acid oxidase showed to be a single band on the SDS-PAGE with a molecular weight of 55.2KD.The isoelectric point of the purified L-amino acid oxidase was PH 7.6 .It was devoid of phospholipase AZ, fibrinogenolytic, fibrinolytic，esterase， haemorrhagenic activities.The puried L-amino acid oxidase dose-dependently inhibited the aggregation of Human platelet induced by ADP，thrombin， collagen and AA in vitro and dose-dependently inhibited the aggregation of rabbit platelet induced by ADP in vivo. The puried L-amino acid oxidase could decrease the level of GMP-140 in plasm ,inhibit the platelet aggregation,lighten the disruption of platelet ultastructure.Conclusion: The L-amino acid oxidase puried from Guangxi cobra venom could inhibit the aggregation and release of platelet in vitro and in vivo, lighten the disruption of platele ultastructure. Key Word: L-amino acid oxidase ,purification ,platelet ation， GMP-140，platelet ultastructure 前 言 L-氨基酸氧化酶 (EC 1.4.3.2 )是一种黄素类蛋白酶，其酶活性为立体 特异性催化L-氨基酸的氧化脱氨，生成q-酮酸，同时产生氨和过氧化氢。 酶广泛的存在于多种生物体种类中。蛇毒LAAO的分布是十分广泛的，但 是不同蛇毒中LAAO含量分布也不同，含量最为丰富的是响尾蛇，例如: 马来响尾蛇C.rhodostoma的毒液中该酶占到毒液干粉总重量30% [11，而蛙 科、眼镜蛇科蛇毒中，LAAO的含量也非常丰富，并且活性强。以前人们 认为海蛇中不存在这种酶，但1'991 Tan和 Ponnudural等也从海蛇中检测到 了LAAO的活性，只是活性很低[z1。目前，从蛇毒中分离的LAAO已有很 多种，被广泛地用于实验室合成4-酮酸以及甲状腺素，用于氨基酸手型结 构的鉴定[(31。关于这种蛋白质分子的一些物理和生化性质已经进行了很多研 究，但是关于它的生理和药理活性研究的还不是很清楚。除了具有酶活性 外，也有报道蛇毒LAAO对血小板聚集功能有影响，然而这种影响却具有 两种相反的结果。Nathan等[[41在1982年首次阐述了从蝗科的Echis colorata 蛇毒中分离纯化的LAAO能够剂量性的抑制由激动剂ADP引起的血小板聚 集.Li[51在1994年也报道了从O.Hananh目反镜王蛇中分离得到的LAAO能 在富含血小板的血浆中诱导血小板聚集，Ali[61等在 2000年报道从蛙科的 Eristocophis macmahoni蛇毒中分离得到的LAAO同样诱导人血小板发生聚 集。此外，不同的蛇毒中分离的LAAO还具有诱发凋亡[71，细胞毒性[81，出 血或溶血活性[[91，引起水肿或抗菌活性polo LAAO具有如此多的生物活性， 因此对其结构和功能间的相互关系的研究就显得格外重要。但是，目前这 方面的研究还很少。两种响尾蛇(Crotalus atrox和Crotalus adamanteus )的 LAAO全长cDNA序列已被克隆，并且确定了可能的FAD结合位点和N- 糖基化位点[.ll [.21o Pawelek等2000年提供了从马来西亚蝮蛇分离提纯的 LAAO的高解析度X一射线晶体衍射结构[131，表明其功能性结构是双体形式， 每一单体包括三个结构域:FAD结合结构域、底物结合结构域和螺旋结构 域。一个底物结构结合域和螺旋结构域形成一个底物进入并与活性位点结 合的通道。这对于深一步研究LAAO的作用机制有重大意义。 近年来，随着社会人口的老龄化和生活水平的不断提高，各种血栓性 疾病的发病率逐年升高，死亡率己跃居首位。而血小板功能亢进是血栓性 疾病的直接危险因素。“抗血小板治疗是心脑血管疾病防治中的一个重要方 面”，目前临床上此类药物较少，且不良反应多，传统的抗血小板药物只作用 于血小板激活的某一特殊途径，血小板还可以经其它途径聚集。因此，许多 国家都在积极研制新型的抗血小板聚集药物。本研究经Sephacryls-200凝胶 过滤柱，DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱、CM- Sepharose CL-6B离子交 换柱从广西眼镜蛇粗毒中分离出LAAO，并测定了其一系列生化物理性质， 对其酶学活性及抗血小板聚集活性进行了分析研究，探讨广西眼镜蛇毒 LAAO作为一种抗血小板药物的运用前景。 材料和仪器 1.实验材料 1. 1广西眼镜蛇粗毒:由广西医科大学蛇毒研究所提供。 1. 2实验对象和动物 正常血浆:由广西医科大学第一附属医院检验科提供。 动物:家兔，体重1.7-2.4kg，雌雄兼用，由广西医科大学实验动物中 心提供。 1. 3试剂: 广西眼镜蛇粗毒由广西医科大学蛇毒研究所提供:Sephacryls-200, DEAErSepharose CL-6B, CM- Sepharose CL-6B层析柱为瑞典Pharmacia Biotech公司产品;凝血酶:河南中泰药业有限公司出品(批号:20040502); 冻干人纤维蛋白原:上海莱士血制品有限公司出品(批号:20031125);低 分子量蛋白质，透析袋(分子量8000)均为美国Sigma公司产品;标 准牛血清白蛋白、考马斯亮兰R-250均为美国BIORAD公司出品;三轻 基氨基甲烷(Tris )美国ROCHE公司出品，武汉中健公司分装;丙烯酞胺、 甲叉双丙烯酸胺、甘氨酸、过硫酸钱、十二烷基磺酸钠(SDS ),p一琉基乙 醇、TEMED,，上海生工公司分装;聚乙二醇 ((20000):为日本进口，广 州南方试剂公司分装 (批号:20030717);构椽酸钠:广东汕头市西陇化工 厂产品 (批号:20031102);甲醇:(AR)广东汕头市西陇化工厂 (批号: 040920);三氯醋酸(AR)国药集团化学试剂有限公司 (批号:F 20040715): 氯化钠:(AR)广东台山市化工厂 (批号20031201);盐酸:(AR)广 西师范学字化学试剂厂出品 (批号:020912);氢氧化钠:天津化学试剂三 厂 (批号:20020208);注射用水:广西医科大学制药厂自制，(批号: 20031004);生理盐水:广西浦北制药厂 (批号:20031105);醋酸钠:(AR 广东汕头市西陇化工厂(批号:0406013);冰醋酸:(AR)广东汕头市西 陇化I厂(批号:041024):硼酸:(AR)上海生工分装(批号20021126); 砷酸三钠:上海化工 (AR)试剂厂 (批号:19881009);胶原:(AR)美 国Sigma公司产品:前列腺素:(AR)美国Sigma公司产品:二磷酸腺昔 (ADP): (AR)美国Sigma公司产品;花生四烯酸(AA) : (AR)美国Sigma 公司产品;血浆GMP一140(granulmembrane protein一140)双抗夹心放免 测定试剂盒 2. 仪器 AKTA Primer蛋白层析系统:瑞典Pharmacia Biotech公司制造;YC- 1层析实验冷柜:北京埔医康技术公司制造;Lamb da Bio20双学束紫外分 光光度计:美国PE公司制造;AG245型电子分析天平:瑞士梅特勒公司制 造:MP230K精密酸度计:瑞士梅特勒公司制造;Mini Protein 3 cell小型 垂直电泳仪，Gel Dol 2000凝胶成像分析仪，均由美国Bio-Rad公司制造; Allegra64R台式高速离心机:美国Beckman公司制造;78HW-1型恒温 磁力搅拌器:杭州仪表电机厂制造;TYXN-%智能血小板凝集仪:上海通 用机电技术研究所生产;日本450酶标仪;日本JEM-1022EX透射电子显 微镜。 实验步骤与方法 1.广西眼镜毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化 1. 1 Sephacryls-200凝胶过滤柱层析 选用的层析柱长为 100cm，直径 1.6cm。取 1克的眼镜蛇粗毒用 5m10.05mo1"L-'醋酸钠缓冲液(pH5.8 )溶解后2000转/分离心10分钟，取 上清液加到己用上述醋酸钠缓冲液平衡的Sephacryls-200凝胶过滤柱上，用 相同缓冲液洗脱，流速为0.2m1-nun' ，每管2ml收集蛋白峰，按Wellne尹4] 方法测定各蛋白峰活性，收集具有氨基酸氧化酶活性的蛋白峰 II?(见 Fig. l)。 1. 2 DEAFr,Sepharose CL-613离子交换柱层析 选用的层析柱柱长为30cm，直径2.6cm。取收集的Sephacryls-200凝胶 过滤柱的II?峰，上样于己用0.05mo1"L-'醋酸钠缓冲液(pH5.8 )平衡的 DEAE-Sepharose CL-613离子交换柱上，用相同缓冲液洗脱，流速为 0.3ml"min'，每管5ml收集蛋白峰，同法测定各蛋白峰的氨基酸氧化酶活性， 收集具有氨基酸氧化酶活性的IIB峰(见Fig.2)o 1. 3 CM- Sepharose CL-613离子交换柱层析 用的层析柱柱长为30cm,直径2.6cm。取收集的DEAE--Sepharose CL-613 离子交换柱的II。峰，上样于己用0.05mo1"L-‘醋酸钠缓冲液(pH5.8 )平衡 的CM- Sepharose CL-613离子交换柱上，以。一0.5mo1"L-' NaCl 340rnl进行 线性梯度洗脱，流速为0.4m1-min"' ，以每管5ml收集各蛋白峰，同法测定各 蛋白峰的氨基酸氧化酶活性，收集氨基酸氧化酶(见Fig.3)o 2. LAAO的生化性质 2. 1 LAAO的纯度鉴定和分子量测定 SDS -聚丙烯酞胺凝胶电泳 (PAGE): 参照Laemmli"S]方法进行，用Mini-protein 3 Cell系统 进行不连续电泳，凝胶厚度为1.0cm，分离胶T=12.5%, C (1310一RAD) 二2.6%:浓缩 胶T=5%, C=2.6%。将经上述分离纯化得到的LAAO冻干品，复溶后分 别取20闪，分别与10闪样品缓冲液 (3x)混合，再与处理过的低分子量标 准蛋白(14.2-66 KD)一起上样。l OmA恒流电泳20min，再改为15mA恒 流电泳80min。电泳后用12%三氯乙酸固定，0.1%考马斯亮兰R-250染 色，25%甲醇-10%冰乙酸脱色。 2. 2 LAAO的等电点测定 等电聚焦电泳:用Mini protein 3 Cell系统制胶，采用T=5%, C=2.6 %的凝胶浓度，并加入两性电解质Ampholine (PH范围是3-10)使其浓度 达到3%。上样量为10贝。700V电泳3小时后，按模板上的格子从阴极以 阳极切下0.5x lcm的凝胶，分别置装有lml去离子水试管中捣碎，再分别 测定pH,剩下的凝胶按SDS-PAGE的方法固定、染色、脱色。 3生物活性测定 3. 1 LAAO活性测定 参照Wellner[ 141方法，在同一试管中加入0.4M Tris-HCI PH7.8缓冲液 200pl,60units/ml过氧化氢酶50p1，待测样品100N1(空白管用蒸馏水代替)， 并加蒸馏水使其终体积为700川，混匀后加入100川0.04M L一苯丙氨酸即发生 反应。37℃水浴振荡(200次/分)15分钟，加入25%三氯醋酸200川终止反应， 混匀后2000转/分离心 10分钟，取上清0.5ml放入预先已有2.5ml的1M硼 酸一砷酸三钠缓冲液PH6.5试管中，室温静置30分钟后，用紫外分光光度仪读 取300nm的数值，空白管调零。其活力单位定义为:以L一苯丙氨酸为底物，它 被除数L-氨基酸氧化酶氧化成苯丙酮酸，其烯醇式与硼酸盐反应所得的化合 物在300nm吸收增加0.03为一酶活力单位。 3. 2磷脂酶A:活性检测 参照Novak" e〕的方法进行，底物配置按Kawauchil"I方法加以改良，测活 是取6m1新鲜配制的底物((1mM PC,1mM CaC1z,50mm NaC1,1mM脱氧胆酸 钠)，搅拌，加入待测样品后计时，用0.02M KOH中和水解产生的脂肪酸， 将PH维持在8.20。根据每毫克测定样品消耗的KOH的速度来计算磷脂酶 AZ的活力。 3. 3精氨酸酷酶活性检测 参照Du等[18〕方法进行，将BAEE溶于2.9m150mM的Tris-HCI溶液中， PH7.8，终浓度为0.8mM，然后加入100川的蛋白样品溶液。25℃下测定3 分钟内OD253 的变化，每分钟OD13上升0.001被定义为一个活力单位。 3. 4纤溶酶活性检测 参照Astrup1191方法改良进行，将100mg纤维蛋白原溶于5ml缓冲液 (50Mm Tris-HC1,PH7.4 )中，然后加入等体积融化的2%琼脂，摇匀混合， 再加入20u/ml凝血酶I ml，摇匀后迅速倒入板，等凝胶后用打孔器打孔， 将待测样品点入加样孔(每孔20川)，37℃恒温孵育18小时后观察活性。 3. 5纤维蛋白原溶解活性’ 参照欧阳等[[20]的方法改良进行，将人纤维蛋白原按0.4% (w/v)的浓 度溶于 1m10.9% (w/v)的NaCl溶液中，然后加入一定量的待测蛋白质样 品，在37℃下观察溶液是否出现凝聚现象。 3. 6出血活性检测 将100p1不同浓度的LAAO溶液从背部注射到小白鼠体内(20-25g)， 24小时后杀死老鼠，观察出血情况。 4蛋白含量测定 分别取IIA, III, LAAO，用Bio-Rad Protein Assay测定蛋白浓度。以牛 血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，配制一系列不同浓度的BSA，分别加 入显色剂后，在595nm处测定。以BSA的浓度为横坐标，以作O.D.5。纵 坐标，绘制BSA的标准曲线。用同样的方法测定待测样品，根据标准曲线 计算每个纯化步骤所到的蛋白含量。 5.稳定性实验 5.1酸碱稳定性实验 配制pH为3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0的缓冲液， 取LAAO使原始活性为1000U-ml" ’用该系列缓冲液透析，20℃左右，分别 于Id, 2d, 3d, 7d, 30d, 180d取样测活，测前用pH7.5的Tris-HC1缓冲 液稀释10倍用Wellner方法[141测活，观察活性变化情况。 5.2 热稳定性实验 取LAAO冻干品，用pH5.8缓冲液复溶，使成1 OOOU-m1-1，分别控制 温度为-4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 900C，各温度下于恒温l0min, 30min取样，冷却至室温下用Wellner方法p41测活，观察活性变化情况。 6.抑制血小板聚集活性的测定 6. 1 体外抑制血小板聚集活性的测定 血样采自健康志愿者，且在采样前两周内未服用任何药物。血样中按9: 1体积r匕加入构栋酸钠 (3.8%). 1000转/分室温离心10分钟，上清液即为 富血小板血浆PRP (Platelet Rich Plasma)，下层物3000转1分再次离心10 分钟，所得上清夜即为贫血小板血浆 (Platelet Poor Plasma).在实验前将待 测样品溶于pH7.4的PBS中，参照Bom氏法[211取PRP200LL，分别加入 LAAO,置于智能血小板聚集仪上，37℃预温5min后，分别加入4种诱聚剂: ADP,thrombin, Collage和AA，在血小板聚集仪上绘制5分钟内的聚集曲线。 通过比较加入LAAO后与对照时的最大聚集率来计算聚集抑制率，并计算 IC5o。所有实验重复三次。 6. 2 体内抑制血小板聚集活性的测定 家兔18只，随机分为3组，每组6只，兔耳缘静脉注射，LAAO分为 高中低三个剂量组 (高剂量组 4000u-kg，中剂量组 3000u-kg，低剂量组 2000u-kg)。于给药前、药后5, 15, 30, 45, 60min，从兔颈动脉抽血，制 备PRP和PPP,(方法同上)，将PRP预热5分钟，然后加入ADP，在血小 板聚集仪上绘制5分钟内的聚集曲线。通过比较加入LAAO后与对照时的 最大聚集率来计算聚集抑制率，并计算IC5o。所有实验重复三次。 抑制率 (%)= (空白对照值一待测样品值)x100/空白对照值 7、血小板电镜标本制作及观察 血样采自健康志愿者，且在采样前两周内未服用任何药物。血样中按9: 1体积比加入构椽酸钠 (3.8%), 1000转/分室温离心10分钟，上清液即为 富血小板血浆PRP (Platelet Rich Plasma).取PRP 1 mL，加入50匹提取物， 混匀后再加入诱导剂并37℃水浴5分钟，加2. 5%戊二醛固定液1 ML,混 匀，静置30 min, 2 000转/分离心巧min，弃上清液。再加入2. 5 戊二 醛固定液1 mLa 20 min后，0. 1 mo1-L磷酸缓冲液洗3次，饿酸固定，乙 醇系列脱水，丙酮置换，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双重染色，透射 电镜下观察细胞超微结构。 8. GMP-140含量测定 PRP制备同上。分别取相同体积PRP加入相同体积不同浓度的LAAO, 混匀后加入诱导剂并37℃水浴5分钟，然后3000转/分离心10分钟，收集上层 液(血浆、黄色)。将标准品作倍比稀释得浓度为80, 40, 20, 10, 5, 2.5ng/nil六个标准点。每孔加不同浓度标准品或待测样血浆100111,空白对 照孔中加入稀释液100p1, 370C孵育90分钟。弃去反应孔内液体，用洗涤液 注满各孔静置三秒甩干，反复三次。每孔加显色液100川, 370C孵育20分钟 后每孔加终止液50川。在酶标仪上492nm处。以空白孔调零，测定各孔A值。 以A42为横坐标 ，GMP-140标准品(ng/ml)为纵坐标作标准曲线，待测标 本GMP-140含量 (ng/ml)可从标准曲线上查出。 9.统计学处理 所有实验数据均以又1S表示用PEMS软件进行统计处理，并根据相应 的资料分别进行方差分析、t检验等统计分析，P<0.05视为统计学上有差异。 讨 论 蛇毒LAAO的分布是十分广泛的，但是不同蛇毒中LAAO含量分布也 不同，含量最为丰富的是响尾蛇，例如:马来响尾蛇C. rhodostoma的毒液 中该酶占到毒液干粉总重量30% "1，而蛙科、眼镜蛇科蛇毒中，LAAO的 含量也非常丰富，并且活性强。以前人们认为海蛇中不存在这种酶，但1991 Tan和Ponnudural等也从海蛇中检测到了LAAO的活性，只是活性很低[21 目前，从蛇毒中分离的LAAO已有很多种，被广泛地用于实验室合成 q-酮 酸以及甲状腺素，用于氨基酸手型结构的鉴定[31。蛇毒LAAO通常是含黄 素 (FAD)辅基的糖蛋白同源二聚体，自然状态下凝胶过滤测定其分子量 为110-150KDa，还原和非还原SDS聚炳烯酞胺凝胶电泳分析，其分子量为 50-70KDa，表明蛇毒LAAO为非共价结合的同源二聚体。蛇毒LAAO的等 电点PI值变化很大，从4.5[221-8.12[231均有分布。有时一种蛇毒就包含了一 种以上的LAAO[241，我们从l000mg广西眼镜蛇粗毒经过三步柱层析大约得 到7.5mg的LAAO。经还原和非还原SDS聚炳烯酞胺凝胶电泳分析其分子 量约为55.2 Kda，等电聚焦法测得其等电点约为7.6. 蛇毒LAAO对氨基酸的氧化具有手性选择性，特异性的催化L型氨基 酸。不同种属来源的LAAO底物的特异性也有所不同。但通常来说，最适 底物多为L一色氨酸、L一蛋氨酸、L一异亮氨酸等【251。蛇毒LAAO每个酶分子 含有两个FMN或FAD辅基，这些辅酶分子的存在使得此类蛋白外观表现 为蛋黄色，而且在275. 390. 462nm波长具有吸收峰【261。当将LAAO反复 冻融或者放于极端pH条件下，此类蛋白质的光吸收谱会发生变化，表明 FMN/FAD辅酶因子所处的微环境发生了变化，这种变化会导致酶活力的下 降甚至丧失。本实验中，广西眼镜蛇LAAO在温度为20土3℃的条件下，PH4 -9之间稳定程度高，随着PH的下降(pH<4)或升高(pH >9),稳定性下 降。在pH为5.8的条件下，60℃以下相对稳定，大于600C，随温度升高， 活性大幅下降，70℃活性完全丧失。 近年来，随着社会人口的老龄化和生活水平的不断提高，各种血栓性 疾病的发病率逐年升高，死亡率己跃居首位。而血小板功能亢进是血栓性 疾病的直接危险因素。血小板具有薪附，变形，释放，聚集功能，各种诱 导剂与血小板膜上相应受体结合，通过G蛋白偶联激活磷脂酶C，后者将4, 5一二磷酸磷脂酞肌醇 (PI几)裂解为三磷酸肌醇 (IP3)及二酞甘油 (DG). IP3进入胞内促使血小板致密系统释放C扩+，使胞内游离的Ca 2+浓度上升， 引起微丝收缩，产生血小板变形及血小板颗粒内容物如:ADP. TXA2, 5-HT 等释放。DG留在膜上激活蛋白激酶C，使血小板蛋白磷酸化，致使膜上受 体GPIIB/IIIa变构活化，与纤维蛋白原及血管性血友病因子 (vWF)结合， 导致血小板聚集【27]。而释放出的ADP和5-HT又可作用于膜上相应的受体， 引起血小板进一步聚集[(281。本实验从广西眼镜蛇分离出的LAAO在体外对 ADP、胶原、凝血酶、花生四烯酸诱导的血小板聚集有明显的抑制作用且 与剂量呈正相关。家兔体内实验也证明该蛋白能剂量依赖性的抑制由ADP 引起的血小板聚集。体外实验与体内实验相比较，体内实验的给药剂量要 明显大于体外实验的给药剂量，体内实验的低剂量组为 1000u/kg，明显高 于体外实验的给药剂量，且体内实验的个体差异要比体外实验明显。 分子生物学研究表明血小板 a颗粒膜蛋白 (GMP-140 )，是分子量为 140KD的膜蛋白，属粘附分子选择素家族[[29,301，其分子由5个不同结构域 组成，从肤链N端开始依次为植物凝集素区，皮生长因子区，体调节蛋白 重复序列，膜区和胞质区[311a GMP-140存在于血小板a颗粒膜 ，巨核细胞 及血管内皮Weibel-palade小体膜上。正常时不在血小板表面显露，当血小板 或内皮细胞受刺激活化时GMP-140随颗粒内容物释放与质膜融合，且随血 小板活化程度的升高，其膜GMP-140分子数也增加，能持久存在于活化血小 板质膜表面涸此GMP-140是分泌依赖性的，是目前所知反映血小板活化与 释放的最具特异性的分子标志物[[32]。血小板在体内外受到刺激或药物作用 后发生粘附、聚集及释放反应，血小板表面GMP-140为血小板a颗粒的释 放产物之一，作为中性粒细胞的粘附受体，其介导粘附的功能区域位于其 分子N末端植物凝集素区和表皮生长因区，通过 Ca 2+参与来调节细胞粘附 过程[33]o GMP-140介导活化血小板或内皮细胞与中性粒细胞或单核细胞粘 附后由这些细胞促进纤维沉积，在血栓形成过程中发挥重要作[34]。不但如此 GMP-140还促进组织因子释放，放大整个反应加速血栓形成。Parmentier 用抗GMP-140单抗LYP- 2 0能抑制胶原和凝血酶诱导的血小板聚集[351 GMP-140可能参与血小板聚集过程。实验表明诱导剂凝血酶能够增加血浆 GMP-140含量，本实验分离出的LAAO能够剂量依赖性的降低诱导剂凝血 酶引起的血浆GMP-140含量，与该LAAO能剂量依赖性的抑制体内外血小 板聚集相一致。说明广西蛇毒中 LAAO可能通过降低诱导剂引起的 GMP-140含量来抑制血小板活化从而降低血小板聚集率。而血小板活化作 用是引起动脉粥样硬化、动脉血栓形成的关键因素，该LAAO能降低诱导剂 引起的GMP-140含量增加，而GMP-140可能参与血小板聚集过程，因此 我们在下阶段的实验中将会探讨广西眼镜蛇LAAO对动脉粥样硬化以及动 脉血栓形成的影响。 血小板形态与功能密切相关，在许多疾病中存在着血小板形态变化。 心脑血管疾病如偏头痛[361疲血症[371、肝病癖血症[381、脑梗死[391、肺心病 [401、心律失常1411. Budd-Chiari综合征[[421、克山病[431、高血压[44]等都会引 起血小板超微结构的变化，使正常盘状血小板减少，伪足变动增多，a颗粒和 致密颗粒减少，管道系统扩张和增生，从而引起血小板聚集，释放反应增强和 活性增高，促使血栓形成，导致缺血性心、脑血管疾病的发生。“抗血小板治 疗是心脑血管疾病防治中的一个重要方面”，目前临床上此类药物较少，且不 良反应多，因此，许多国家都在积极研制新型的抗血小板聚集药物。血小板 是多功能敏感的无核细胞，主要功能是参与体内止血与血栓形成【46,461生理 状态下，血小板呈两面微凸的圆盘状，它在体内外受到刺激或药物作用后， 血小板会出现一系列的形态和代谢变化如会立即发生变形、释放反应，由 静止状态转向活化，激活后血小板出现聚集。其形态变化的不同反映出血小 板的不同功能状态。正常对照组血小板表面光滑，较少有伪足样突起，颗 粒成分和两种管道系统均匀的分布在细胞质中，说明血小板处于在相对静 止的状态，LAAO组血小板的超微结构变化相似，只有轻微的变形反应， 而胞质内的细胞器与正常对照组无明显变化，而诱导剂组血小板超微结构 损伤严重，说明广西眼镜蛇LAAO对血小板超微结构具有保护作用，提示 LAAO也可以通过保护血小板超微结构，抑制颗粒释放达到抗血小板聚集 作用。 血小板聚集实质是一个依赖于Ca'的纤维蛋白原桥连过程[471。当聚集 诱导剂ADP、胶原等与血小板受体结合，释放出Ca'，除促进花生四烯酸等 调节因子产生外，还刺激致密体释放ADP，并可抑制腺昔酸环化酶激活，从 而诱导和促进血小板聚集和释放。传统的抗血小板药物只作用于血小板激 活的某一特殊途径，如:阿司匹林抑制TXA:介导的血小板聚集;抵克力得 和氯毗格雷则抑制ADP诱发的血小板聚集，血小板还可以经其它途径聚集。 我们分离的广西眼镜蛇LAAO能够抑制多种诱导剂如:ADP、胶原、凝血 酶、花生四烯酸诱导的血小板聚集，降低血浆GMP-140含量，减轻血小板 超微结构的损伤。另在Li的报道中，广西眼镜蛇LAAO通过增加血小板膜 表面腺普酸环化酶及降低游离 61+来抗血小板聚集。联系临床应用，我们 应该寻找更多的作用于血小板不同激活途径药物，这样可以针对不同血小 板激活途径采用相应的药物，或联合用药以期用较小的剂量达到最大的疗 效。 LAAO是人们被某些毒蛇咬伤后血流不止的一个重要因素。研究表明， 蛇毒 LAAO对于血小板的作用有两种相互矛盾的结果。例如:蝗科的 Eristocophis macmahoni蛇毒中分离的LAAO能够剂量依赖性地抑制由激动 剂引起的血小板聚集[61;但是从蛙科的Echis coloratah蛇毒[[41以及眼镜王蛇 Ophiophagus hannah蛇毒[51中中分离到的LAAO，却能够诱导血小板发生聚 集。在血小板聚集作用方面存在作用相反的两类蛇毒 LAAO。如此矛盾的 结论似乎是由实验过程以及血样的准备的不同所致。然而，H2O:究竟是抑 制还是诱导血小板聚集依然存在争议，究竟为什么这两类LAAO具有相反 的作用，在这两类LAAO蛋白质结构搞清楚之前，我们尚不能作出准确的 解释。但是有一点是肯定的，H2O:在这两种相反的作用中都发挥了重要的 作用。有报道认为[13,241，较低浓度的H202 (pmo1.L，的水平)，在有激动剂 (ADP)存在的情况下抑制血小板的聚集;高浓度(mmo1-L-，的水平)的H202 可以作为一种激动剂促进血小板聚集。因此，联系到蛇毒 LAAO，可认为 不同蛇毒LAAO对于血小板聚集的两种不同效果，只是由于它们酶活性的 高低不同导致了反应性血小板聚集。但是，目前还没有人对这几种蛇毒的 LAAO酶活性作出统一比较，因此这种观点的正确性还有待检验。近来也 有人认为，LAAO能够通过血小板表面的受体影响其聚集。这些也从另一个 方面说明了加快对于蛇毒LAAO蛋白质结构功能研究的重要性。 蛇毒LAAO不但在影响血小板聚集和公认的毒性作用方面担当非常重 要的角色，其越来越多的生物学特性被人们发现，例如:引起水肿和溶血[6]s 杀灭利什曼原虫等细胞内寄生虫[48]，抗菌作用[6,10,49]，甚至具有抗爱滋病 毒的作用[50] . LAAO具有多种生物学功能，这些功能与其酶学活性密切相 关，但又不是完全依赖于酶活性，其结构与功能之间的相互关系，还有待 于进一步深入研究。目前，人们向着纯化蛇毒制品，明确作用机制，联系 临床应用，提高疗效的方向，从不同的角度、不同途径研究、开发更多能 有效的蛇毒成分。 参考文献 [1] PonnuduraiQchung MC,Tan NHm Purification and properties of the L-amino acidoxidaxse from Malayan pit viper(Calloselasma) venom .Arch.Biochem.Biophs.1994 313,373-378. [2] Tan NH, Ponnudurai G. A comparative study of the biological properties of some sea snake venoms .Comp.Biochem.Physiol.B1991 99,351-354. [3] Ponnudurai G,Chung M.C.M,and Tan N.Purification and properties of the L-amino acid oxidase from Malayan pit viper (Calloswlasma rhodostoma) venom .Arch.Biochem.Biophys.1994,313;373-378. [4] Nathan 1, Dilansky A, YirmiyahuT, Aharon M, Livene A . Impqirment of platelet aggregation by Echis colorata venom mediated by L-aminoacidoxidase or H202 .Thromb.Haemost.1982,48,277-282. [5] Li ZY, Yu TF, Lian EC. 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