多光子显微镜--奥林巴斯

2011年11月 1 多光子显微镜多光子显微镜多光子显微镜多光子显微镜 Think deep, Look deeper…… �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用; �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ 激光 激光激光 激光 物镜 物镜物镜 物镜 标本 标本标本 标本 共聚焦针孔 共聚焦针孔共聚焦针孔 共聚焦针孔 ( (( (Pinhole PinholePinhole Pinhole) )) ) 光电倍增管 光电倍增管光电倍增管 光电倍增管 (PMT) (PMT)(PMT) (PMT) 荧光滤光片 荧光滤光片荧光滤光片 荧光滤光片 ( (( (发射光滤色片 发射光滤色片发射光滤色片 发射光滤色片) )) ) 共聚焦原理共聚焦原理共聚焦原理共聚焦原理 宽场照明显微镜和共聚焦图像比较 宽场照明显微镜和共聚焦图像比较宽场照明显微镜和共聚焦图像比较 宽场照明显微镜和共聚焦图像比较 • LSCM存在的问题存在的问题存在的问题存在的问题 • 扫描深度 扫描深度扫描深度 扫描深度？？ ？？？？ ？？ • 光漂白 光漂白光漂白 光漂白？？ ？？？？ ？？ • 空间定点光刺激 空间定点光刺激空间定点光刺激 空间定点光刺激？？ ？？？？ ？？ • 紫外激发 紫外激发紫外激发 紫外激发？？ ？？？？ ？？ �一般 一般一般 一般< 80um �严重 严重严重 严重 �几乎整个 几乎整个几乎整个 几乎整个Z轴都受光 轴都受光轴都受光 轴都受光 �无纯紫外 无纯紫外无纯紫外 无纯紫外 •短波激发 短波激发短波激发 短波激发 •反复经过扫描振镜 反复经过扫描振镜反复经过扫描振镜 反复经过扫描振镜 •成像光路长 成像光路长成像光路长 成像光路长 •共聚焦针孔 共聚焦针孔共聚焦针孔 共聚焦针孔 深层图像深层图像深层图像深层图像? 50-120um 共聚焦原理回顾 共聚焦原理回顾共聚焦原理回顾 共聚焦原理回顾 物 物物 物镜 镜镜 镜 激光 激光激光 激光 2011年11月 2 Fluorescence Fluorescence Excitation light Excitation Light Ground state Excitation state 1 photon 2 photon 10-16 ~ -18sec内到达的两个光子 内到达的两个光子内到达的两个光子 内到达的两个光子！！ ！！！！ ！！ 因此多光子激发通常使用 因此多光子激发通常使用因此多光子激发通常使用 因此多光子激发通常使用飞秒 飞秒飞秒 飞秒(fs)超短脉冲激光和高 超短脉冲激光和高超短脉冲激光和高 超短脉冲激光和高NA物镜 物镜物镜 物镜 • 直接使用大功率激光 直接使用大功率激光直接使用大功率激光 直接使用大功率激光 • 2mW x 100,000,000 = 200,000W • 活细胞 活细胞活细胞 活细胞？？？ ？？？？？？ ？？？ • 使用超短脉冲激光 使用超短脉冲激光使用超短脉冲激光 使用超短脉冲激光 • 将高强度激光在压缩在极短的时间内发射 将高强度激光在压缩在极短的时间内发射将高强度激光在压缩在极短的时间内发射 将高强度激光在压缩在极短的时间内发射 多光子荧光的激发特点多光子荧光的激发特点多光子荧光的激发特点多光子荧光的激发特点 多光子荧光的成像特点多光子荧光的成像特点多光子荧光的成像特点多光子荧光的成像特点 Qidong OCN 多通道外置无 多通道外置无多通道外置无 多通道外置无pinhole多光子荧光器 多光子荧光检测器多光子荧光检测器 多光子荧光检测器（ （（ （NDD） ）） ） 2011年11月 3 多光子成像深度比LSCM深 小鼠脑片标本 小鼠脑片标本小鼠脑片标本 小鼠脑片标本 标本厚度 标本厚度标本厚度 标本厚度: 300um : 300um: 300um : 300um 测试地点清华大学 测试地点清华大学测试地点清华大学 测试地点清华大学 Qidong OCN LSCM和 和和 和MPE的光路特点比较 的光路特点比较的光路特点比较 的光路特点比较 Qidong ocn �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用： ：： ： »深层在体观察 深层在体观察深层在体观察 深层在体观察 »长时间在体 长时间在体长时间在体 长时间在体timelapse »光杀伤 光杀伤光杀伤 光杀伤 »光诱导 光诱导光诱导 光诱导 �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ Qidong OCN Qidong OCN 在体鼠脑观察 在体鼠脑观察在体鼠脑观察 在体鼠脑观察 xyz Dr. WB Gan, PKU Qidong ocn 在体斑马鱼 在体斑马鱼在体斑马鱼 在体斑马鱼xyz Dr. Luo LF 2011年11月 4 Qidong ocn 小鼠肾脏在体 小鼠肾脏在体小鼠肾脏在体 小鼠肾脏在体 xyz Dr. Dunn, Indiana University Qidong OCN �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用： ：： ： »深层在体观察 深层在体观察深层在体观察 深层在体观察 »长时间在体 长时间在体长时间在体 长时间在体timelapse »光杀伤 光杀伤光杀伤 光杀伤 »光诱导 光诱导光诱导 光诱导 �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ Qidong ocn 小鼠肾脏在体 小鼠肾脏在体小鼠肾脏在体 小鼠肾脏在体 xyt Qidong ocn 斑马鱼发育 斑马鱼发育斑马鱼发育 斑马鱼发育 xyzt Dr. Miyawaki, Riken 齐冬 OCN 在体小鼠免疫细胞迁移 在体小鼠免疫细胞迁移在体小鼠免疫细胞迁移 在体小鼠免疫细胞迁移 Dr. Qi Hai, TSU 齐冬 OCN NIBS Dr. Luo MM Neuron & Science IBP Dr. Liu L / Wang JH Science & JCS 在体鼠脑 在体鼠脑在体鼠脑 在体鼠脑 xyzt 2011年11月 5 Qidong ocn �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用： ：： ： »深层在体观察 深层在体观察深层在体观察 深层在体观察 »长时间在体 长时间在体长时间在体 长时间在体timelapse »光杀伤 光杀伤光杀伤 光杀伤 »光诱导 光诱导光诱导 光诱导 �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ Qidong OCN 多光子光漂白现象只发生在焦平面附近 多光子光漂白现象只发生在焦平面附近多光子光漂白现象只发生在焦平面附近 多光子光漂白现象只发生在焦平面附近 Qidong OCN 定点诱导细胞死亡实验 定点诱导细胞死亡实验定点诱导细胞死亡实验 定点诱导细胞死亡实验 植物根 植物根植物根 植物根 测试地点 测试地点测试地点 测试地点： ：： ：清华大学 清华大学清华大学 清华大学 齐冬 OCN 多种独有多光子配置 多种独有多光子配置多种独有多光子配置 多种独有多光子配置 多光子专用型 多光子专用型多光子专用型 多光子专用型 多光子刺激型 多光子刺激型多光子刺激型 多光子刺激型 （含VIS共聚焦、可兼顾多光子成像） 基本多光子成像型 基本多光子成像型基本多光子成像型 基本多光子成像型 （含VIS共聚焦） 多光子成像 多光子成像多光子成像 多光子成像+多光子刺激型 多光子刺激型多光子刺激型 多光子刺激型 （含VIS共聚焦、可兼顾多光子成像） 如何完成双 如何完成双如何完成双 如何完成双扫 扫扫 扫描 描描 描? 引入了一个独立的 引入了一个独立的引入了一个独立的 引入了一个独立的扫 扫扫 扫描 描描 描单 单单 单元 元元 元 “SIMS” 同 同同 同步 步步 步激光 激光激光 激光 扫 扫扫 扫描 描描 描 双扫描光诱导 双扫描光诱导双扫描光诱导 双扫描光诱导—— ———— ——快速 快速快速 快速、 、、 、同步光诱导 同步光诱导同步光诱导 同步光诱导 更简单 更简单更简单 更简单、 、、 、更快速的 更快速的更快速的 更快速的FRAP 细胞样品来自北京中医医院 2011年11月 6 齐冬 OCN �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用： ：： ： »深层在体观察 深层在体观察深层在体观察 深层在体观察 »长时间在体 长时间在体长时间在体 长时间在体timelapse »光杀伤 光杀伤光杀伤 光杀伤 »光诱导 光诱导光诱导 光诱导 �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ 光变色 光变色光变色 光变色 Keade 0’ 5’ 10’ 15’ 20’ LAMP1-RFP LAMP1-PAGFP PA-GFP for Proto-lysosomes Dr. Yu L Pre 5” 10” PAGFP-LC3 0” Dr. Yu L In cellular phase-chase: Monitor the half life of Autophagosome 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Time after pulse labeling (min) 0 min 10 min 20 min 3 30min PAGFP-LC3 Number of autophagosomes Dr. Yu L 2011年11月 7 解笼锁 解笼锁解笼锁 解笼锁 Qidong OCN 多光子在体解笼锁 多光子在体解笼锁多光子在体解笼锁 多光子在体解笼锁 Dr. Kasai 齐冬 OCN ChR2ChR2 Depolarization⇒Action Potential Blue laser K+ Ca2+ Na+ Cl- NpHR Yellow laser Cl- NNpHRpHR hyperpolarization ⇒ suppress action potential Opticalgenesis “Method for 2010” 齐冬 OCN None 照明光 照明光照明光 照明光 None 控制神经细胞活性状态 控制神经细胞活性状态 ChR2ChR2ChR2ChR2ChR2ChR2ChR2ChR2////////NNNNNNNNpHRpHRpHRpHRpHRpHRpHRpHR spine Cell body 光诱导 光诱导光诱导 光诱导+电生理 电生理电生理 电生理 MMASW 10pA 1msec A/D 图像灰度 MMASW —— map扫描扫描扫描扫描 • 在细胞上连续区域进行光成像或刺激 在细胞上连续区域进行光成像或刺激在细胞上连续区域进行光成像或刺激 在细胞上连续区域进行光成像或刺激 • 配合膜片钳 配合膜片钳配合膜片钳 配合膜片钳， ，， ，定位细胞上的功能受体分布区域 定位细胞上的功能受体分布区域定位细胞上的功能受体分布区域 定位细胞上的功能受体分布区域。 。。 。 2011年11月 8 Qidong OCN �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用; �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ »激光 激光激光 激光 »检测器 检测器检测器 检测器 »制片方法 制片方法制片方法 制片方法 »物镜 物镜物镜 物镜 Qidong OCN 激光器发出飞秒脉冲到达标本的实际情况 激光器发出飞秒脉冲到达标本的实际情况激光器发出飞秒脉冲到达标本的实际情况 激光器发出飞秒脉冲到达标本的实际情况？ ？？ ？ AOM 、 、、 、物 物物 物镜 镜镜 镜、 、、 、扩 扩扩 扩束 束束 束镜 镜镜 镜等 等等 等， ，， ，尤其 尤其尤其 尤其AOM会明 会明会明 会明显 显显 显展 展展 展宽 宽宽 宽脉 脉脉 脉宽 宽宽 宽 需要更高强度的激光来维持焦点光密度 需要更高强度的激光来维持焦点光密度需要更高强度的激光来维持焦点光密度 需要更高强度的激光来维持焦点光密度 —— ———— ——灼伤标本 灼伤标本灼伤标本 灼伤标本 Qidong OCN DeepSee补偿光路 补偿光路补偿光路 补偿光路 Negative Chirp光路使出物镜激光脉宽足够窄 光路使出物镜激光脉宽足够窄光路使出物镜激光脉宽足够窄 光路使出物镜激光脉宽足够窄 Qidong OCN 含 含含 含DeepSee系统 系统系统 系统 无 无无 无DeepSee系统 系统系统 系统 Qidong OCN �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用; �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ »激光 激光激光 激光 »检测器 检测器检测器 检测器 »制片方法 制片方法制片方法 制片方法 »物镜 物镜物镜 物镜 GaAsP NDD检测器检测器检测器检测器 2011年11月 9 GaAsP External PMT. GaAsPGaAsPGaAsPGaAsP detection detection detection detection surfacesurfacesurfacesurface electron Multiplier Surface Electronic signal output + GaAsP NDD PMT. BXD GaAsP Qidong OCN �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用; �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ »激光 激光激光 激光 »检测器 检测器检测器 检测器 »制片方法 制片方法制片方法 制片方法 »物镜 物镜物镜 物镜 Qidong OCN 标本的固定和透明的方法 标本的固定和透明的方法标本的固定和透明的方法 标本的固定和透明的方法 物理切片 物理切片物理切片 物理切片 BABB, Focus clear…… SCALEVIEW-A2 Qidong OCN Qidong OCN �多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介多光子显微镜原理简介 多光子显微镜原理简介； ；； ； �多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用多光子技术在生物学上的应用 多光子技术在生物学上的应用; �如何做得更深 如何做得更深如何做得更深 如何做得更深？ ？？ ？ »激光 激光激光 激光 »检测器 检测器检测器 检测器 »制片方法 制片方法制片方法 制片方法 »物镜 物镜物镜 物镜 2011年11月 10 Qidong OCN Stick Objective Lenses 纤细物镜纤细物镜纤细物镜纤细物镜 Qidong OCN Stick Objective Lens 20X/0.5 Stick objective lens Diameter 1.3mm, F.N. 4mm, Working Distance 0.2mm IV-OB13F20W20 27X/0.7 Stick objective lens. Diameter 3.5mm F.N. 6.3, Working Distance 0.2mm IV-OB35F22W20 DescriptionProduct Name Qidong OCN Rat Blood flow 20x Rat brain NADH 20x Qidong OCN � 高 高高 高NA： ：： ：1.05 – 高分辨率 高分辨率高分辨率 高分辨率， ，， ，足够小的会聚焦 足够小的会聚焦足够小的会聚焦 足够小的会聚焦 点 点点 点 � 大视场 大视场大视场 大视场： ：： ：FN27.5 – 充分收集散射荧光 充分收集散射荧光充分收集散射荧光 充分收集散射荧光 � 工作距离 工作距离工作距离 工作距离: 2mm � IR校正 校正校正 校正： ：： ： 600-1100nm � 高透过率 高透过率高透过率 高透过率： ：： ：400-1100nm � 有 有有 有/无玻片校正 无玻片校正无玻片校正 无玻片校正 � 注射夹角 注射夹角注射夹角 注射夹角: 35o 专用物镜 专用物镜专用物镜 专用物镜 齐冬 OCN 校对红外色差校对红外色差校对红外色差校对红外色差！！！！！！！！！！！！ 常规复消色差 常规复消色差常规复消色差 常规复消色差（ （（ （APO） ）） ）物镜 物镜物镜 物镜 – 437-657nm Qidong OCN 2011年11月 11 齐冬 OCN Deep Imaging! 20x NA0.95 No coverglass correction 25x NA1.05 No coverglass correction 25x NA1.05 coverglass correction 植物固定制片的自发荧光 植物固定制片的自发荧光植物固定制片的自发荧光 植物固定制片的自发荧光 测试地点 测试地点测试地点 测试地点： ：： ：清华大学 清华大学清华大学 清华大学 63 纵深成像比较 纵深成像比较纵深成像比较 纵深成像比较 XLPLN25XWMP + 传统透明方法 传统透明方法传统透明方法 传统透明方法 XLPLN25XWMP + SCALEVIEW-A2 0mm 1mm 0mm 750um 2mm 64 XLPLN25XSVMP + SCALEVIEW-A2 非常感谢您的参与非常感谢您的参与非常感谢您的参与非常感谢您的参与 !!!! http://http://cn.olympus.comcn.olympus.com// http://http://www.olympusmicro.comwww.olympusmicro.com//