骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较

中国组织工程研究与临床康复 第 ，2眷 笫 2， 2008—05—20出版 Journal ofClinical Rehabilitative Tissue Engineering Research May 20,2008 Vo1．12，No．21 骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较术 邹叶青’，贺文凤’，石庆之 ，刘 Jfl’ Biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells versus umbilical cord blood mesenchymal stem cells Zou Ye—qing’ ， He Wen．feng’ ， Shi Qing．zhi ，Liu Chuan’ Abstract AIM：To search a new source of mesenchymal stem cells(MSCs)，this study aimed to compare the growth speed．phenotype and differentiation function of umbilical cord blood(UCB)一MSCs and bone marrow(BM)一MSCs． M ETHoDS：The experiment was performed at the Molecular Laboratory of Second Affiliated Hospital of Medical College of Nanchang University from June 2OH06 to March 2OH07．A total of 30 samples of UCB and 30 samples of BM were collected from normal volunteers．The experiment was approved by Hospital’s Ethics Committee．Mononuclear cells fMNCs)were isolated from UCB and BM．UCB—MNCs and BM—MNCs were cultured in flask at l×l L 。and the IMDM liquid containing autologous serum of O．2O volume fraction and l mmo1／L cetacort was added．The culture liquid was replaced and suspension cells were removed after 7 days．and then the liquor was replaced every 3 or 4 days．After confluence of 90％．cells were treated with trypase—ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)and cultured，MSCs surface molecules of the third passage of cells were identified by t1ow cytometry to investigate the growth characteristics and difierentiation into adipocytes between UCB—MSCs versus BM—MSCs． RESULTS：BM—MSCs appeared spindle shape in an early phase．and no significant difierence was detected after the third passage of cells were harvested compared to the UCB—M SCs．Surface molecule detection demonstrated an increase in CDl66．CD29．CD54 expression and a decrease in CDl3．CD34．CD45 expression in third passage of cells compared to the UCB—MNCs．Success rate in UCB—MSCs was lower than in BM—M SCs．In an early period，UCB—MSC proliferation was faster than BM．MSCs：on the contrary． UCB—MSC proliferation was slower than BM —MSCs in the latter period．Two different MSCs could be induced into adipocytes． and there was no significant difference． CoNCLUSIoN：The growth speed is slower and culture success rate is lower in UCB—MSCs as a new resource of MSCs compared to the BM—MSCs．but no significant difierence was found in phenotype and difierentiation function． Zou YQ，He WF，Shi QZ，Liu C．Biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells versus umbilical cord blood mesenchymal stem cells．Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008；12(21)：4141—4143(China) [WWW．zglckf．com／zglckffejournal／upfiles／08—21／2lk一4141(ps)．pdfl 摘要 目的：为寻找最佳的间充质干细胞来源，比较脐带血来源间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞在生长、细胞表型及多项分 化功能方面的差别。 方法：实验于 2006—0612007—03在南昌大学医学院第二附属医院分子实验室、江西省医学分子重点实验室，省级重点实验室完 成。①实验材料：脐带血 3O份及正常骨髓 3O份均取自正常自愿捐献者，实验经医院伦理委员会批准。②实验方法：无菌条 件下采集脐血及骨髓，分离单个核细胞。将脐血及骨髓单个核细胞以 1×10 L。接种于培养瓶中，加入含体积分数0．20白体 血清、1 mmol／L氢化可的松的IMDM培养液，7 d后换液，去除悬浮细胞，以后每三四天换液 1次，待细胞 90％融合后，经 胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化，传代培养，取第 3代细胞，采用流式细胞术鉴定脐带血来源间充质干细胞表面分子，并 比较两种不同来源间充质干细胞的生长特点及向脂肪细胞分化能力的差别。 结果：①骨髓来源间充质干细胞在较早阶段形态即成长梭形，第3代后与脐带血来源间充质干细胞形态无明显差别。②培养 至第 3代的间充质干细胞表面分子检测与脐血单个核细胞比较结果显示，CD166、CD29、CD54表达增高，CD13、CD34、 CD45表达降低。③脐带血来源间充质干细胞培养的成功率低于骨髓来源间充质干细胞，在较早阶段脐带血来源『自j充质干细 胞增殖快于骨髓来源间充质干细胞，但后期培养过程中脐带血来源间充质干细胞增殖慢于骨髓来源间充质干细胞，两种来源 间充质干细胞均能分化为脂肪细胞，且分化能力无明显差别。 结论：脐血来源间充质干细胞作为一种新来源的间充质干细胞在生长速度、培养成功率上虽然低于骨髓来源间充质十细胞， 但在细胞表型及分化功能方面无明显差别。 关键词：间充质干细胞；骨髓；脐带血 邹叶青，贺文风，石庆之，刘川．骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较⋯．中国组织工程研究 与临床康复，2008 12(21)：4141—4143 [WWW．zglckf．comlzglckf／ejournal／upfiles／08—21／21k一4141(ps)．pdf] 0 引言 许多研究发现间充质干细胞通过细胞间 接触、分泌各种造血因子及生成骨髓基质而有 利于造血干细胞的体外扩增、造血干细胞移植 lssN l673．8225 cN 2l—l539／R coDEN：ZLKHAH 后的归巢及植入、可缩短移植后骨髓造血功能恢 复的时间【l4】；另外，间充质干细胞还可通过直接的 细胞接触、分泌细胞因子、诱导嵌合体形成、诱 导免疫耐受、调控机体免疫从而减少移植后移植 物抗宿主病的发生【5‘ 。骨髓已作为间充质干细胞 的主要来源，但骨髓标本的获取是一个痛苦、有 Molecule Labom~ry． Jian2xI Kev Laboratory of MedicaI M olecule． ‘Department of Haematology，Second A币 liated Hospita1． M edica1 College of Nanchang University， Nanchang 330006． Jiangxi Province， China Zou Ye—qing， Technician—in—charge， M olecule Laboratory， Jiangxi Key Labo ratory of M edica1 M olecule． Second Affiliated Hospita1． Medica1 College of Nanchang University，Nanchang 330O06． Jiangxi Province，China zyq741 2@ yahoo com cn Correspondence to： Shi Qing—zhi，Chief physician， Department of Haematology， Second A币 liated Hospital， M edical College of Nan chang University，Nanchang 330006， Jiangxi Province，China qingzhis@ hotmail com Supported by： the Key Program of Science and Technology De partment of Jian gxi Province* Received：2007一¨一10 Accepted：2008—-02—-15 4l4l 重庆维普 http://www.cqvip.com 邹叶青 等 骨髓s脐带血闻充质干缅瞻的生物学特性比较 ‘南昌大学医学院 第二附属 医院 分 子实验室、江西省 医学分子重点实 验 室， 南昌大学 医学院第二附属 医院血液科，江西 省南昌市 33O0Ol6 邹叶青，女，1974 年生，江西省南昌 市人 ，汉 族 ，2oo6 年 南 昌大学医学 院毕 业 ，主管技 师，主要从事细胞 及分子生物学研 究 zyq7412@yahoo． com ．cn 通 讯作者 ：石庆 之，主任 医师，南 昌大学医学院第 二 附属 医院血液 科，江西省南昌市 330006 qingzhis@ hotmail． Com 江西省科 技厅 重 点项 目“骨髓间充 质 干细胞 对移植 后 免疫排 斥反应 的作用 中图分类号 R394 2 文献标识码：A 文章编号 1673—8225 (2008)21-04141—03 收稿 日期_20o7—11—10 修回 日期：20o8_o2-15 (07—50-11-6207／GW "03 4142 创伤、易污染的过程，获取所需的骨髓有一定的 困难，因此人们需要寻求一种更易获得的间充质 干细胞来源细胞。近年来许多人已将 目光投 向以 前被废弃的脐带血。本实验通过比较两种不同来 源的间充质干细胞的生物学特性，为寻找最佳的 间充质干细胞来源提供一定基础。 1 材料和方法 设计：对比观察实验。 单位：南昌大学医学院第二附属医院分子实 验室、江西省医学分子重点实验室，省级重点实 验室。 材料：实验于2006—06／2007—03在南昌大学 医学院第二附属医院分子实验室、江西省医学分 子重点实验室，省级重点实验室完成。正常骨髓 和脐带血各30份，取 自正常 自愿者，实验经医院 伦理委员会批准。 设计、实施、评估者：实验的设计、评估由 通讯作者完成，实验的实施由第一、二、四作者 完成。 方法： 脐血单个核细胞和骨髓单个核细胞制备：待 健康产妇娩出胎儿后，无菌条件下穿刺脐静脉， 收集脐带血 (肝素抗凝)，每份60～120 mL。沿 管壁将脐血缓慢加入装有比重为1．077淋 巴细胞 分离液的尖底离心管中，2 000 r／min，离,0 20 min， 吸取界面层细胞，加入培养液，用吸管打匀 ， 1 500 r／min、离心5 min，共洗涤3次。所得单个核 细胞用椎虫蓝染色、光学显微镜下计数，调整细胞 浓度1×10 L。备用。脐带血采集后须在4～12 h内制 备单个核细胞悬液。骨髓单个核细胞制备是在无 菌条件下采集正常人骨髓5～10 mL (肝素抗凝)， 其余步骤同脐带血单个核细胞制备。 脐带血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞 的培养：用含20％自体血清 、1 mmol／L氢化可的 松的IMDM培养液将脐带血单个核细胞或骨髓 单个核细胞以1×10 L。接种于培养瓶中，置饱 和湿度、体积分数为0．05的CO2、37℃培养箱中 进行培养。7 d后半量换液，去除悬浮细胞，细胞 完全贴壁时用含有10％新生牛血清的IMDM培 养液全量换液，以后每三四天换液1次。待细胞 90％融合后以吸管吹打贴壁细胞，以1：2或1：3 传代培养，取第3代细胞用于实验。在间充质干 细胞培养期间定期观察细胞生长情况。 脐带血间充质干细胞表面CD分子检测：用 2．5 g／U的胰蛋白酶和0．2 g／UEDTA混合液消化后 收集培养第3代脐带血间充质干细胞，PBS洗涤 计数后，分成每离心 (Eppendorf，EP)管 (1．5 mL)l×10 细胞，洗涤后 重悬 于20 L的 PBS，分别 加入小 鼠抗人直标PE或FITC单抗 CD13、CD45、CD29、CD54、CD34、CD166等 10 L，室温避光反应30 min，设立阴性对照。 PBS洗涤3次后，进行流式细胞术分析。 体外诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化： 取第3代的脐带血间充质干细胞或骨髓间充质 干细胞液100 L(1×10 L。)接种于事先放置 有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板 内制备细胞爬片，加入培养体系为10％4"牛血 清100 L、5 mmol地塞米松20 L、25 mmol 3一异丁基一1一甲基黄嘌啉50 L、5 mg／L胰岛素 50 L、5 g／L消炎痛50 L的IMDM脂肪细胞诱 导培养液1 mL进行诱导。每周换液1次，3周后 用脂肪 (苏丹III)染色液染色鉴定。被染为橘 红色或黄色的为阳性细胞。 主要观察指标：两种来源问充质干细胞的 形态学特征及多向分化潜能。 2 结果 2．1 间充质干细胞培养及鉴定 间充质干细 胞的形态学观察：脐血间充质干细胞培养：脐 带血离的单个核细胞用 台盼蓝染色 ，细胞活 性> 95％。用脐带血单个核细胞进行液体培 养，24 h后于倒置显微镜下观察，见部分细胞 沉于培养瓶的底部；72 h后大部分细胞贴壁， 但贴壁不牢。7 d后细胞已基本贴壁，且贴壁更 牢，贴壁细胞部分变大、形态不。原代及 第1、2代细胞10～15 d后90％融合，以大细胞居 多，细胞变大、且渐呈三角形、多角形、分枝 状、梭形。传至第3代细胞多呈长梭形，排列 有一定方 向性，见图1，7～13 d细胞可达90％融 合。骨髓间充质干细胞培养：与脐带血间充质 干细胞培养相比较，细胞贴壁时间短，变形旱， 增殖快。48 h后即有较多细胞贴壁，细胞变大， 出现分枝状、梭形细胞。原代细胞及第1、2代 细胞15～20 d 90％融合，有较多分枝状、梭形细 胞。传至第3代细胞多呈长梭形，排列有明显 方 向性，细胞排列成网状、辐射状，见图2， 4～7 d细胞增殖1代。两种来源问充质干细胞生 长特点见表1。 2．2 间充质干细胞表面cD分子检测 培养至 第3代的间充质干细胞表面分子检测与脐血单 个核细胞比较结果显示，CD166、CD29、CD54 P．O．Box 1200，Shenyang 110004 kf23385083@sina．com 重庆维普 http://www.cqvip.com 邹时青? 等 ． 骨髓 s脐带 血 向充质干 细 匏的生物学特性 tb较 疋死露w w m 职 k何 ⋯ 表达 增 高 ， C D l3 、 C D 34 、 C D 4 5表达 降低 。 结果见表2 。 2-3 体 外诱 导 间 充质 干 细 胞 向脂 肪 细 胞 分 化 骨髓 问 允质 十 细 胞 及 脐 带 血 『开J 允质 十 细 胞 均 具 有 多 向分化 能 力 ， 且 分化能 力无 明 显 差 别 。 诱导培养 3剧 后可 见有 部 分细胞梭形突起变短 ， 细胞体积 明显 变人 。 将盖玻片从 24 -／L板中取 出 以脂肪 染色液染色后 ， 镜下 可 见呈 桔黄色 的脂肪细胞 。 见 图3 。 fsS N i673 — 8225 cN 2 i— i539，R C o D E N ：zL K H A H 3 讨论 由 ¨ 司充质 T 细胞具有 自我更新及 多向分化 的能力 ， 该类细胞在 合适 的微环 境 中进 一 步分化从而 修复组织损 伤 。 近 年来人们还 发虮 问充质 T 细胞具有支持造血 和 免疫 调节功能 ， 冈此越来越受到重视 ， 但足 由于骨髓采集是有 创 的过程使得间充质 T 细胞 的获得受到 了 一 定的限制 。 目 6订对脐带血 中是否存在 『日J充质干细胞仍存在着争 议隅～ I， 国 内岗敦华等-】uJ 曾比较成人骨髓 、 胎儿骨髓 、 脐 血 3种来源 的问充质十 细胞 ， 认 为3种米源 的问允质干 细胞培养增殖 速度尢差别 。 本实验证 实脐带血 与骨髓 一 样在体外均可培 养 出问充质干细胞 。 脐带 帆问充质干 细胞培养的成功率低 于饲’髓 『HJ 充质干细胞 ， 在较早阶段脐带 札 问充质干 细胞增 殖快于骨髓 间充质干细胞 ， 但长期培养过程 中脐带 血 问充 质干细胞总数少于骨髓 问充质干 细胞 ， 两种不 同来源 的间 充质十 细胞均具有 自我更新及 多向分化 的能力 。 由 r脐带 血 较骨髓采集方便 、 来源广泛 ， 因此脐带血 作为 一 种新的 间充质干细胞米源必将有』 “ 阔的前景 。 4 参考 文 献 1 R obeA s R ，G allagher J ，S pooncer E ，elal H cparan sulphate bound gro w th factors： a m echanism for stro m aleellm ediated haem opoiesis N ature 1988： 332 (6162 ) ：376 2 C oom be D R ， W att S M ． P arish C R M ac一 1 (C D llb，C D l8) and C D 4 5 m ediate the adhesion of hem atopoietic progenitor cells tO strum al cell elem ents via recognition ofstro m alheparan sulfate B lood l994 ： 84 (3 )：739 3 M osca J D ． B uyaner D ． K niley J ． et alB iodistribution and bone m arrow “ hom ing “ ofcanine m esenchym alstem cells after culture expan sion an d re— infusion into a canine transplan tation m odel．B lood 1998： 92：664 a 4 K O c oN ．G erson S I。 ． C ooper B 、V etal R apid hem atopoietic recovery after coinfusion ofautologous． ． blood stem cells and culture． ． expanded m arrow m esenchym al stem cells in advanced breast can cer patients receiving hlgh— dose chem otherapyC lin oncol2(X)()： 18 (2 ) ：307 5 V an P ariis L ． A bbas A K H om eostasis and self- tolerance in the im m une system ：turning lym phocytes O 仃． S cience 1998： 280 (5361 ) ：24 3 6 C harlton B ． A uchincloss H J r, F athm an C G M echanism s of transD lantatiO n tolerance． A nnu R ev Im m un0 1 l994 ： l2：707 7 B artholom ew A ， S turgeon C ， S iatskas M ， eta1． M esenchym alstem cells suppress lym phocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo E xp H em at0 1 2002： 30 (1 ) ：4 2 8 W exler S A ． D onaldson C ． D enning． K endallP etal A dultbone nlarrow is a rich source ofhum an m esenchym al ’ stem 。 cells but um bilicalC O rd and m obilizedadultbloodare notB r J H aem atol2003 ： 121 (2 )： 368 9 L ee O K ． K U O T K ．C hen W M ，et alIsolation ofm ultipotent m esenchym al stem cells from um bilicalcordblood．B lood2004 ；103： 1669 10 Z hou D H ，H uang S L ，W u Y F eta1． Z honghua E rkexue Z azhj2003；4 l(8)：607 周敦华 ， 黄绍 良， 吴燕峰 ， 等 ． 人问充质干 细胞体外增 殖 及生物学特征 的研 究【J ] ． 中华儿 科学杂志 ， 2003 ， 4 1(8)：607 4 14 3 重庆维普 http://www.cqvip.com