LIVESTOCKANDPOULTRYINDUSTRYNO.214遗传育种
遗传距离分别为0.0557、0.0640和
0.0311,平均mtDNA多态度(或称核苷
酸差异均数)分别为5.7182%、6.5847%
和3.1860%。
5 mtDNA遗传多样性研究的前
景展望
分子生物学、分子遗传学基础理
论研究以及技术的不断进步,如从最
初的限制性内切酶酶切片段电泳到
RFLP分析研究,RAPD、AFLP等分子标
记技术的出现为mtDNA的比较研究带
来便利;差异展示技术的问世使大规
模筛选差异
达DNA成为可能。线粒
体基因的转基因研究因核编码线粒体
蛋白运输机理的阐明而得以实现;而
体外线粒体编辑系统的建立,推动了
线粒体基因表达和调控机理的研究。
近年来,mtDNA已经被作为研究物种
(或品种)的群体遗传结构,了解物种
(或品种)的种质特性,探索物种(或品
种)的起源、进化以及重建物种的系统
发育史的一个比较实用的遗传标记而
得到进一步深入的研究。
我国地域辽阔,自然气候、地形地
貌、农耕
、饲料资源和社会经济背
景千差万别,各地区选种要求也不一
样,遗传多样性的认识还停留在形态学
水平上,有关细胞遗传学和生化遗传学
方面的研究也不全面。至于分子水平
的遗传多样性研究,与发达国家相比才
刚刚起步。但是,随着社会经济的发展
和生物技术(如基因扩增、基因定位等)
的进步,研究家养动物起源和遗传分化
以及改善品种的遗传特性必将成为今
后一个十分活跃的研究领域,而线粒体
DNA所具有的独特特性就决定了今后
我国对家养动物遗传多样性的研究中
必将发挥其重要的作用。这对于推进
我国21世纪的畜牧业生产也具有广阔
的前景。
主要参考文献
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ES细胞研究,首先源于畸胎瘤干
细胞(teratocarcinomastemcel1)或胚胎
瘤细胞(embryoniccarcinomacell,EC细
胞)。1958年,Steven通过把小鼠早期胚
胎移植到“129品系”小鼠精巢或肾脏
被膜下得到了EC细胞 。
1981年,Evans和Kaufman首先在
EC细胞研究的基础上,对延迟着床的
小鼠早期胚胎进行体外培养,首次分
离得到小鼠胚 胎 干 细 胞(embryonic
stemcell,ES细胞),以2个人名字的开
头字母命名为EK细胞,并建立了ES细
胞系[1]。随后,人们相继建立了其它动
物的类ES细胞系。
l胚胎干细胞的概念
原始生殖细胞 (primordialgerm
cells,PGCs)是从早期胎儿生殖脊或胚
胎中分离出来的1种未分化细胞。它是
继胚胎癌细胞或畸胎瘤干细胞和胚胎
干细胞之后发现的又1种多能性干细
胞资源。早在70年代,Jeon和Brinster分
别对小鼠PGCs的形态结构和能量代谢
进行了研究。1982年,DeFelici用EDTA/
percoll法分离到小鼠PGCs[2];1990年,
Leichthammer分离到牛、猪、兔的PGCs
[3]。到1992年,Matsui和Pesnick等几乎同
时用小鼠PGCs建立了干细胞系(EG细
胞系)[4]从此揭开了哺乳动物的PGCs分
离多能干细胞的序幕。目前,把EC细
胞、ES细胞和EG细胞统称为胚胎干细
胞(ES细胞)。
2 ES细胞建系的技术要点
2.1 ES细胞的分离获取
现在许多学者都采取与Evans等
相同或相似的方法,用桑椹胚或囊胚分
离各种动物ES细胞。
以既保证ES细胞的全能性又要
有足够的数量为原则来确定ES细胞
分离获取的最佳时间。以ICM为ES细胞
来源时:小鼠取3~5d囊胚;猪取9~10d
囊胚;羊取7~8d囊胚;牛取6~7d桑堪
胚或早期囊胚。
以PGCs取ES细胞时:小鼠取12.5d
胎儿生殖嵴;大鼠可取10~15d尿囊,
中胚层组织块,12.5d背肠系膜或
13.5~14.5d生殖嵴;牛取29~35d胎儿
生殖嵴;分离的方法常为机械剪切与消
动物胚胎干细胞的建立与应用
王 星 (辽东学院动物科学系,辽宁 丹东 118003)
中图分类号:S814.8 文献标识码:A 文章编号:1008-0414(2007)02(X)-0004-03
摘 要 胚胎干细胞 (Embryonicstemcells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞
团(innercellmassICM)或原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)经体外分化
抑制培养分离克隆的。本文介绍了胚胎干细胞的概念,对ES细胞分离、培养和鉴定
方法及在动物遗传育种中的应用进行了综述。
关键词 动物胚胎干细胞 分离 培养 鉴定 遗传育种
收稿日期:2006-11-28
作者简介:王星,(1972-)男,汉族,辽宁丹东人,讲师,沈阳农业大学在读硕士,研究方向动物
胚胎工程
4· ·
2007年2月 畜禽业总214期 遗传育种
化相结合法,即把采取的胚胎组织充分
剪碎,采用EDTA、EDTA/胰酶消化[5]。
2.2 ES细胞的分化抑制培养
在动物ES细胞的培养过程中,用
于分离和培养胚胎干细胞的体外培养
系统必须满足两方面的要求:一是促
进胚胎干细胞增殖,由基础培养基来解
决;二是保持胚胎干细胞处于未分化
状态,由分化抑制物来完成。
2.2.1基础培养基的选择:常用的基础
培养基有DMEM,TCM-199[6]和F-12。其
中,DMEM在ES细胞的体外培养中应
用最为普遍,并且研究发现,在DMEM中
适当多加葡萄糖对囊胚的附着和ICM
的增殖有好处;而少加或不加丙酮酸钠
对ES细胞的生长和形态鉴定有益[7]。
比较重要的添加剂有 [8]:(1)β-巯
基乙醇:是一种还原剂,可以形成促进
ES细胞增殖的谷胱甘肽。还可以消除
过氧化物的毒害作用,促进胚胎细胞的
贴壁;(2)血清:ES细胞培养过程中一
般都加入10%犊牛血清和10%胎牛血
清,也可只加入15%犊牛血清或15%胎
牛血清。血清除可供给细胞的营养外,
还可促进细胞合成DNA、中和培养液
的毒性;(3)生长因子:经常添加的生长
因子有表皮生长因子 (EGF)、胰岛
(insulin)与胰岛素样生长因子 (IGF)、
成纤维细胞生长因子 (FGF)和干细胞
因子(SCF)。EGF可促进细胞分裂、DNA
合成和mRNA转录,还可以缩短细胞周
期。胰岛素和IGF可促进滋养层与ICM
增殖,并对着床前的胚胎发生起发育调
节作用[9]。SCF则对ES细胞生长起调控
作用。诱导其进入细胞周期,并促进其
分裂。
2.2.2分化抑制物的选择:目前有3种
分化抑制物比较常用:饲养层(feeder
layer)、条件培养基(CM)和白血病抑制
因子(LIF)。(1)饲养层:是将选用的细胞
经γ射线照射或经丝裂霉素C(mitom-
ycinC)处理而阻断其有丝分裂所得到
的细胞层;(2)条件培养基:是将BRL(一
种大鼠肝细胞)等细胞培养一定时间
后,回收细胞培养液,经一系列处理后
制为贮存液,使用时以一定比例加到
ES细胞培养基中。许多实验室经常用
条件培养基取代饲养层来维持ES细
胞;(3)分化抑制因子:ES细胞在体外培
养时目前主要靠加入外源的LIF来抑
制其分化。
2.2.3早期胚胎和PGCs的培养条件及
ES细胞的分离传代:将早期胚胎和
PGCs置于饲养层上或条件培养基上
后,要求放入CO2培养箱中,饱和湿度,
5% CO2和37~39℃,培 养 液 一 般 是
DMEM+15%胎牛血清(FCS),培养液
中可添加LIF(重组白血病抑制因子)、
EGF(表皮生长因子)、IGF(胰岛素样
生长因子)及胰岛素等多种细胞因子
或分化抑制物,添加β—巯基乙醇可提
高胚胎活力和贴壁能力。
经体外培养待胚胎内细胞团ICM
增殖后,或PGCs出现ES样克隆后即
可传代。传代一般是用胰酶/EDTA消
化增殖后的ICM或ES细胞克隆,用微
吸管或拨针将其打碎使其成为单个细
胞或几个细胞粘连的小团块,然后移
入新的饲养层上,培养几天后,出现新
的克隆点,在其分化之前再如此传代。
3 ES细胞的鉴定和冻存
3.1 ES细胞的鉴定
建系前分离获取的细胞和建系培
养的细胞都要进行严格的科学的鉴定
以确定是否为真正的ES细胞。
3.1.1形态鉴定:ES细胞,胞体小,核大,
有1至多个核仁,细胞致密,细胞间无界
限,形似鸟巢,集落周边整齐,与饲养层
界限分明且色泽深亮[10]。
3.1.2核移植ES:细胞最重要的特性即
全能性。以待测细胞作核供体注射到
去核的卵母细胞中,观测该重构胚是否
能够正常发育并产生后代,进而确定是
否为ES细胞。这是一种最可靠的鉴定
方法。
3.1.3嵌合体:利用桑椹胚聚合法或囊
胚注射法将ES细胞注射到受体胚胎
中,经恢复培养,胚胎移植直至产生嵌
合体动物。当动物的嵌合体产生稳定
的ES种系嵌合后代时,该动物胚胎干
细胞的多能性就表现了出来。据此可
通过嵌合体实验进行ES细胞的鉴定。
3.1.4染色体G带技术:正常的ES细胞
具有二倍体核型。在体外增殖和传代,
所培养的细胞多能性若丧失染色体核
型必然发生变化。高分辨率分带技术
可精确地识别染色体,判断核型是否正
常,进而鉴定待测细胞是否为ES细胞。
3.1.5碱性磷酸酶 (AKP)活性检测:ES
细胞中APK具有较高的活性,用染色液
固兰RR或固绿B盐,荼酚AS-TR磷
酸盐进行鉴定,阳性染色细胞为红色,
阴性无色。
3.1.6oct-4活性检测:POU结构域的
转录因于Oct-4基因所表达的蛋白是
细胞具有全能性的标志。ES细胞中含
有Oct-4基因,经Oct-4基因产物的免
疫荧光检测可呈阳性。此外,还有胚胎
阶段特异性细胞表面抗原(SSEA-1)法、
葡萄糖磷酸异构酶(GPI)检测法、体内
外分化实验均可用来鉴定ES细胞。
3.2 ES细胞冷冻保存
一般冷冻保护液为DMEM+30%~
50%NBCS(新生牛血清)+10%DMSO。
冷冻程序为室温下平衡10min,然后
放入-10℃冰箱3~5h,再放入-70℃
冰箱中过夜,第二天放入液氮中长期
保存。也可在-70℃冰箱中存放数月。
解冻一般在37℃水浴中进行,解冻后
立即用新的培养液替换冷冻保护液,
然后再放入CO2培养箱中培养。
4 ES细胞在动物遗传育种中
的应用展望
ES细胞与胚胎嵌合体和ES细胞核
移植技术可使1头良种家畜在短期内
生产较多的有遗传同质型的动物。这
不但可以充分发挥良种动物的生产潜
力,而且可以加速动物良种化进程。利
用ES细胞技术,可在细胞水平对胚胎
进行早期选择。这样可以提高选择的
准确性,缩短育种时间。还可以进行动
物抗病育种。
利用ES细胞克隆动物技术,一方
面可以繁殖大量的濒危动物,迅速扩
大濒危动物的群体数量;另一方面可
以用冷冻的全能性细胞作供体进行细
胞核移植克降稀有动物。
用异种动物细胞核移植和异种动
物胚胎嵌合的方法可获得具有新性状
的克隆动物或异种动物的嵌合体,这
样可能克服种间繁殖障碍,创造新物
种.获得用传统交配方法无法得到的新
性状。
利用细胞核移植技术可以同时克
隆遗传基础完全相同的生物个体。这
些生物个体可用于遗传参数的估测,
饲料营养价值的评定以及环境与动物
关系的研究等领域。
可以从转基因动物血浆和乳汁中
获取外源药用蛋白质。转基因动物乳
腺成为公认的生产重组蛋白质的理想
器官。
用ES细胞生产转基因动物,可以
进行定向变异和育种,打破了物种的
界限,突破了亲缘关系的限制,加快了
动物群体遗传变异程度。
5 存在的问题
在ES细胞的建系中,研究人员还没
有找到分离获取各种动物ES细胞的最
5· ·
LIVESTOCKANDPOULTRYINDUSTRYNO.214
收稿日期:2006-12-10
作者简介:袁小远(1980.01-)女,硕士,研究方向:基因工程与畜禽传染病防治
兽医研究
佳时期;也未能保证ES细胞高效增殖和
有效抑制其分化,因此往往出现非整倍
体核型。在ES细胞的应用研究中,目前
仅仅局限于用ES细胞分化特定细胞以
期望修复替代坏损组织细胞,而且常常
存在着免疫排斥问题。
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19世纪50年代,新城疫病毒使农
场主晚期胃癌的转移受到抑制的情况
引起人们的关注。在随后的研究中发
现新城疫病毒在肿瘤细胞中的复制是
在正常细胞中复制的1万倍[1];而且仅
特异性地杀伤肿瘤细胞,对正常的细
胞没有毒副作用。而目前国内外针对
癌症肿瘤的治疗还多数依赖于放疗、
化疗等手段,这些治疗方法副作用大、
对正常的组织器官有所损伤、容易复
发、花费高等缺点,故针对新城疫病毒
抗肿瘤作用的研究成为目前肿瘤治疗
研究的新热点之一。本文就新城疫病
毒抗肿瘤的作用基础、抗肿瘤作用的
机制以及国内外的相关研究概况进行
综述。
1 新城疫病毒概况
新城疫 病 毒 (Newcastledisease
virus,NDV)属副粘病毒科副粘病毒亚
科腮腺炎病毒属的禽副粘病毒。 NDV
一般呈球形,直径100~500nm,基因组
为负链单股RNA,大小为15~16kb。病
毒具有囊膜,内含有一长螺旋状核衣
壳,囊膜外有长约8~12nm的糖蛋白纤
突。病毒的基因组包括6种基因,分别
用于编码6种病毒结构蛋白。其中3种
与病毒的脂质膜有关,即覆盖在病毒
囊膜表面的血凝素和神经氨酸酶活性
的(HN)糖蛋白、融合(F)糖蛋白以及
脂膜内的非糖基化内膜蛋白(M)。其中
HN蛋白和F糖蛋白是2种主要的功能
蛋白,F蛋白具有使病毒囊膜与宿主细
胞膜融合、使病毒穿过细胞膜进入细
胞的作用。HN糖蛋白在病毒脂质囊膜
上形成纤突,具有血凝素和神经氨酸
酶活性,在病毒侵染过程中识别细胞
受体、介导病毒吸附细胞膜。另外3种
与基因组RNA有关,它们是核壳蛋白
(NP)、磷蛋白(P)、高分子量蛋白(L)。
2 新城疫病毒抗肿瘤的作用机理
新城疫病毒的抗肿瘤反应是多方
面的,其可以促使机体产生非特异性
免疫和特异性免疫等有效的抗肿瘤反
应。NDV能改变肿瘤细胞的免疫原性,
增强免疫细胞识别肿瘤细胞和杀伤肿
瘤细胞的能力,提高机体免疫监视功
能,促进机体的排斥肿瘤反应的能力。
究其原因,主要有以下几个方面[2]:(1)
NDV诱导细胞因子的产生:NDV感染
机体可诱导干扰素(Interferon,IFN)、肿
瘤 坏 死 因 子 (Tumornecrosisfactor,
TNF)、白细胞介素(Interleukin,IL)、单
核细胞集落刺激因子 (Granulocyte-
macrophagecolonystimulatingfactor,
GM-CSF)等细胞因子的产生;(2)NDV
对免疫细胞的调节作用:NDV可激活
患瘤机体的免疫细胞,而活化的免疫
细胞对肿瘤细胞的毒性作用主要通过
CTL杀伤肿瘤细胞作用、巨噬细胞对肿
瘤的破坏作用、NK细胞选择杀伤肿瘤
细胞作用、抗体依赖的淋巴细胞介导
细胞毒性作用等而发挥效应;(3)NDV
的HN蛋白的抗肿瘤作用:HN蛋白具有
神经氨酸酶活性,神经氨酸酶具有去
除糖蛋白末端唾液酸功能,从而使肿
瘤细胞的抗原暴露出来,使免疫监视
细胞容易识别和杀伤肿瘤细胞;(4)
NDV对肿瘤细胞的选择性杀伤作用:
体外实验已证实弱毒NDV能选择性杀
伤人颈部癌细胞系(KB8511)、成神经纤
维瘤细胞系(IMR32)、Wilim肿瘤细胞系
(G104)、纤维肉瘤细胞系(HT1080)、膀
胱癌细胞系 (HCV29)、骨肉瘤细胞系
(KHOS)的细胞,而对人的正常的成纤
维细胞系无作用。
鸡新城疫病毒的抗肿瘤作用
袁小远1 李 俊2 张 倩3
(1.山东省农业科学院家禽研究所,山东 济南 250023;
2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所;3.黄岛出入境检验检疫局)
中图分类号:S852.65+9.5文献标识码:B文章编号:1008-0414(2007)02(X)-0006-02
动物胚胎干细胞的概念与应用
胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ES
细胞)是从早期胚胎内细胞团 (Innercell
mass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgerm
cells,PGCs)经体外分化、抑制培养、分离和
克隆得到的具有发育全能性的细胞。其在体
外抑制培养时,可以增殖、冷冻、操作和筛
选,又可通过胚胎嵌合和细胞核移植参与各
种组织的发育,形成克隆动物。ES细胞作为
一种新型的实验材料,广泛应用于动物克
隆、转基因动物的生产、真核细胞基因的表
达与调控、人类遗传病动物模型的创建,人
类器官移植材料的生产以及细胞分化机制
的研究等领域。ES细胞分离与克隆技术、遗
传工程和胚胎工程相结合,对于阐明动物生
长的基本规律、抢救和保护濒危动物遗传资
源、建立先进的动物育种技术体系具有重大
的理论意义和实践价值。
●相关链接
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