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动物胚胎干细胞的建立与应用

2011-11-18 3页 pdf 100KB 45阅读

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动物胚胎干细胞的建立与应用 LIVESTOCKANDPOULTRYINDUSTRYNO.214遗传育种 遗传距离分别为0.0557、0.0640和 0.0311,平均mtDNA多态度(或称核苷 酸差异均数)分别为5.7182%、6.5847% 和3.1860%。 5 mtDNA遗传多样性研究的前 景展望 分子生物学、分子遗传学基础理 论研究以及技术的不断进步,如从最 初的限制性内切酶酶切片段电泳到 RFLP分析研究,RAPD、AFLP等分子标 记技术的出现为mtDNA的比较研究带 来便利;差异展示技术的问世使大规 模筛选差异表...
动物胚胎干细胞的建立与应用
LIVESTOCKANDPOULTRYINDUSTRYNO.214遗传育种 遗传距离分别为0.0557、0.0640和 0.0311,平均mtDNA多态度(或称核苷 酸差异均数)分别为5.7182%、6.5847% 和3.1860%。 5 mtDNA遗传多样性研究的前 景展望 分子生物学、分子遗传学基础理 论研究以及技术的不断进步,如从最 初的限制性内切酶酶切片段电泳到 RFLP分析研究,RAPD、AFLP等分子标 记技术的出现为mtDNA的比较研究带 来便利;差异展示技术的问世使大规 模筛选差异达DNA成为可能。线粒 体基因的转基因研究因核编码线粒体 蛋白运输机理的阐明而得以实现;而 体外线粒体编辑系统的建立,推动了 线粒体基因表达和调控机理的研究。 近年来,mtDNA已经被作为研究物种 (或品种)的群体遗传结构,了解物种 (或品种)的种质特性,探索物种(或品 种)的起源、进化以及重建物种的系统 发育史的一个比较实用的遗传标记而 得到进一步深入的研究。 我国地域辽阔,自然气候、地形地 貌、农耕、饲料资源和社会经济背 景千差万别,各地区选种要求也不一 样,遗传多样性的认识还停留在形态学 水平上,有关细胞遗传学和生化遗传学 方面的研究也不全面。至于分子水平 的遗传多样性研究,与发达国家相比才 刚刚起步。但是,随着社会经济的发展 和生物技术(如基因扩增、基因定位等) 的进步,研究家养动物起源和遗传分化 以及改善品种的遗传特性必将成为今 后一个十分活跃的研究领域,而线粒体 DNA所具有的独特特性就决定了今后 我国对家养动物遗传多样性的研究中 必将发挥其重要的作用。这对于推进 我国21世纪的畜牧业生产也具有广阔 的前景。 主要参考文献 [1]涂正超,张亚平,邱怀.中国牦牛线粒体 DNA多态性及遗传分化.遗传学报,1998,25 (3):205~212 [2]TuZ.C,QIUH,ZhangY.P.Polymor- phisminmitochondrialDNA(mtDNA)ofyak (Bosgrunniens).BiochemGenet.,2002,40(5- 6):187~193 [3]雷初朝 .四个畜种mtDNA遗传多样性研 究.西北农林科技大学博士学位论文,2002 [4]刘延鑫.黄牛线粒体DNAD-环序列多态 性与系统发育关系研究.四川农业大学硕士 学位论文,2004 [5]赖松家.中国三个牛种遗传多样性和分 子系统进化研究.四川农业大学博士学位 论文,2004 [6]胡文平,连林生,刘爱华等.云南地方猪 种线粒体DNA多态性研究.畜牧兽医学报, 1998,29(1):94~97 [7]黄勇富,张亚平,邱祥聘,等.猪线粒体 DNA多态性与中国地方猪种起源分化的关 系.遗传学报,1998,25(4):322~329 [8]章胜乔,吴小秋,傅衍,等.浙江地方猪种 遗传多样性研究.浙江农业大学学报(农业 与生命科学版),1999,25(5):547~551 [9]刘中禄,魏泓,曾养志,等.中国三种实验 用小型猪mtDNAD-loop多态性分析.动物 学报,2001,47(4):425~430 [10]GiuffraE,KijasJM H,AmargerV, CarlborgO,JeonJT,AnderssonL.The origin ofthedomestic pig:independent domesticationandsubsequentintrogression. Genetics,2000,154:1785~1791 ES细胞研究,首先源于畸胎瘤干 细胞(teratocarcinomastemcel1)或胚胎 瘤细胞(embryoniccarcinomacell,EC细 胞)。1958年,Steven通过把小鼠早期胚 胎移植到“129品系”小鼠精巢或肾脏 被膜下得到了EC细胞 。 1981年,Evans和Kaufman首先在 EC细胞研究的基础上,对延迟着床的 小鼠早期胚胎进行体外培养,首次分 离得到小鼠胚 胎 干 细 胞(embryonic stemcell,ES细胞),以2个人名字的开 头字母命名为EK细胞,并建立了ES细 胞系[1]。随后,人们相继建立了其它动 物的类ES细胞系。 l胚胎干细胞的概念 原始生殖细胞 (primordialgerm cells,PGCs)是从早期胎儿生殖脊或胚 胎中分离出来的1种未分化细胞。它是 继胚胎癌细胞或畸胎瘤干细胞和胚胎 干细胞之后发现的又1种多能性干细 胞资源。早在70年代,Jeon和Brinster分 别对小鼠PGCs的形态结构和能量代谢 进行了研究。1982年,DeFelici用EDTA/ percoll法分离到小鼠PGCs[2];1990年, Leichthammer分离到牛、猪、兔的PGCs [3]。到1992年,Matsui和Pesnick等几乎同 时用小鼠PGCs建立了干细胞系(EG细 胞系)[4]从此揭开了哺乳动物的PGCs分 离多能干细胞的序幕。目前,把EC细 胞、ES细胞和EG细胞统称为胚胎干细 胞(ES细胞)。 2 ES细胞建系的技术要点 2.1 ES细胞的分离获取 现在许多学者都采取与Evans等 相同或相似的方法,用桑椹胚或囊胚分 离各种动物ES细胞。 以既保证ES细胞的全能性又要 有足够的数量为原则来确定ES细胞 分离获取的最佳时间。以ICM为ES细胞 来源时:小鼠取3~5d囊胚;猪取9~10d 囊胚;羊取7~8d囊胚;牛取6~7d桑堪 胚或早期囊胚。 以PGCs取ES细胞时:小鼠取12.5d 胎儿生殖嵴;大鼠可取10~15d尿囊, 中胚层组织块,12.5d背肠系膜或 13.5~14.5d生殖嵴;牛取29~35d胎儿 生殖嵴;分离的方法常为机械剪切与消 动物胚胎干细胞的建立与应用 王 星 (辽东学院动物科学系,辽宁 丹东 118003) 中图分类号:S814.8 文献标识码:A 文章编号:1008-0414(2007)02(X)-0004-03 摘 要 胚胎干细胞 (Embryonicstemcells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞 团(innercellmassICM)或原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)经体外分化 抑制培养分离克隆的。本文介绍了胚胎干细胞的概念,对ES细胞分离、培养和鉴定 方法及在动物遗传育种中的应用进行了综述。 关键词 动物胚胎干细胞 分离 培养 鉴定 遗传育种 收稿日期:2006-11-28 作者简介:王星,(1972-)男,汉族,辽宁丹东人,讲师,沈阳农业大学在读硕士,研究方向动物 胚胎工程 4· · 2007年2月 畜禽业总214期 遗传育种 化相结合法,即把采取的胚胎组织充分 剪碎,采用EDTA、EDTA/胰酶消化[5]。 2.2 ES细胞的分化抑制培养 在动物ES细胞的培养过程中,用 于分离和培养胚胎干细胞的体外培养 系统必须满足两方面的要求:一是促 进胚胎干细胞增殖,由基础培养基来解 决;二是保持胚胎干细胞处于未分化 状态,由分化抑制物来完成。 2.2.1基础培养基的选择:常用的基础 培养基有DMEM,TCM-199[6]和F-12。其 中,DMEM在ES细胞的体外培养中应 用最为普遍,并且研究发现,在DMEM中 适当多加葡萄糖对囊胚的附着和ICM 的增殖有好处;而少加或不加丙酮酸钠 对ES细胞的生长和形态鉴定有益[7]。 比较重要的添加剂有 [8]:(1)β-巯 基乙醇:是一种还原剂,可以形成促进 ES细胞增殖的谷胱甘肽。还可以消除 过氧化物的毒害作用,促进胚胎细胞的 贴壁;(2)血清:ES细胞培养过程中一 般都加入10%犊牛血清和10%胎牛血 清,也可只加入15%犊牛血清或15%胎 牛血清。血清除可供给细胞的营养外, 还可促进细胞合成DNA、中和培养液 的毒性;(3)生长因子:经常添加的生长 因子有表皮生长因子 (EGF)、胰岛 (insulin)与胰岛素样生长因子 (IGF)、 成纤维细胞生长因子 (FGF)和干细胞 因子(SCF)。EGF可促进细胞分裂、DNA 合成和mRNA转录,还可以缩短细胞周 期。胰岛素和IGF可促进滋养层与ICM 增殖,并对着床前的胚胎发生起发育调 节作用[9]。SCF则对ES细胞生长起调控 作用。诱导其进入细胞周期,并促进其 分裂。 2.2.2分化抑制物的选择:目前有3种 分化抑制物比较常用:饲养层(feeder layer)、条件培养基(CM)和白血病抑制 因子(LIF)。(1)饲养层:是将选用的细胞 经γ射线照射或经丝裂霉素C(mitom- ycinC)处理而阻断其有丝分裂所得到 的细胞层;(2)条件培养基:是将BRL(一 种大鼠肝细胞)等细胞培养一定时间 后,回收细胞培养液,经一系列处理后 制为贮存液,使用时以一定比例加到 ES细胞培养基中。许多实验室经常用 条件培养基取代饲养层来维持ES细 胞;(3)分化抑制因子:ES细胞在体外培 养时目前主要靠加入外源的LIF来抑 制其分化。 2.2.3早期胚胎和PGCs的培养条件及 ES细胞的分离传代:将早期胚胎和 PGCs置于饲养层上或条件培养基上 后,要求放入CO2培养箱中,饱和湿度, 5% CO2和37~39℃,培 养 液 一 般 是 DMEM+15%胎牛血清(FCS),培养液 中可添加LIF(重组白血病抑制因子)、 EGF(表皮生长因子)、IGF(胰岛素样 生长因子)及胰岛素等多种细胞因子 或分化抑制物,添加β—巯基乙醇可提 高胚胎活力和贴壁能力。 经体外培养待胚胎内细胞团ICM 增殖后,或PGCs出现ES样克隆后即 可传代。传代一般是用胰酶/EDTA消 化增殖后的ICM或ES细胞克隆,用微 吸管或拨针将其打碎使其成为单个细 胞或几个细胞粘连的小团块,然后移 入新的饲养层上,培养几天后,出现新 的克隆点,在其分化之前再如此传代。 3 ES细胞的鉴定和冻存 3.1 ES细胞的鉴定 建系前分离获取的细胞和建系培 养的细胞都要进行严格的科学的鉴定 以确定是否为真正的ES细胞。 3.1.1形态鉴定:ES细胞,胞体小,核大, 有1至多个核仁,细胞致密,细胞间无界 限,形似鸟巢,集落周边整齐,与饲养层 界限分明且色泽深亮[10]。 3.1.2核移植ES:细胞最重要的特性即 全能性。以待测细胞作核供体注射到 去核的卵母细胞中,观测该重构胚是否 能够正常发育并产生后代,进而确定是 否为ES细胞。这是一种最可靠的鉴定 方法。 3.1.3嵌合体:利用桑椹胚聚合法或囊 胚注射法将ES细胞注射到受体胚胎 中,经恢复培养,胚胎移植直至产生嵌 合体动物。当动物的嵌合体产生稳定 的ES种系嵌合后代时,该动物胚胎干 细胞的多能性就表现了出来。据此可 通过嵌合体实验进行ES细胞的鉴定。 3.1.4染色体G带技术:正常的ES细胞 具有二倍体核型。在体外增殖和传代, 所培养的细胞多能性若丧失染色体核 型必然发生变化。高分辨率分带技术 可精确地识别染色体,判断核型是否正 常,进而鉴定待测细胞是否为ES细胞。 3.1.5碱性磷酸酶 (AKP)活性检测:ES 细胞中APK具有较高的活性,用染色液 固兰RR或固绿B盐,荼酚AS-TR磷 酸盐进行鉴定,阳性染色细胞为红色, 阴性无色。 3.1.6oct-4活性检测:POU结构域的 转录因于Oct-4基因所表达的蛋白是 细胞具有全能性的标志。ES细胞中含 有Oct-4基因,经Oct-4基因产物的免 疫荧光检测可呈阳性。此外,还有胚胎 阶段特异性细胞表面抗原(SSEA-1)法、 葡萄糖磷酸异构酶(GPI)检测法、体内 外分化实验均可用来鉴定ES细胞。 3.2 ES细胞冷冻保存 一般冷冻保护液为DMEM+30%~ 50%NBCS(新生牛血清)+10%DMSO。 冷冻程序为室温下平衡10min,然后 放入-10℃冰箱3~5h,再放入-70℃ 冰箱中过夜,第二天放入液氮中长期 保存。也可在-70℃冰箱中存放数月。 解冻一般在37℃水浴中进行,解冻后 立即用新的培养液替换冷冻保护液, 然后再放入CO2培养箱中培养。 4 ES细胞在动物遗传育种中 的应用展望 ES细胞与胚胎嵌合体和ES细胞核 移植技术可使1头良种家畜在短期内 生产较多的有遗传同质型的动物。这 不但可以充分发挥良种动物的生产潜 力,而且可以加速动物良种化进程。利 用ES细胞技术,可在细胞水平对胚胎 进行早期选择。这样可以提高选择的 准确性,缩短育种时间。还可以进行动 物抗病育种。 利用ES细胞克隆动物技术,一方 面可以繁殖大量的濒危动物,迅速扩 大濒危动物的群体数量;另一方面可 以用冷冻的全能性细胞作供体进行细 胞核移植克降稀有动物。 用异种动物细胞核移植和异种动 物胚胎嵌合的方法可获得具有新性状 的克隆动物或异种动物的嵌合体,这 样可能克服种间繁殖障碍,创造新物 种.获得用传统交配方法无法得到的新 性状。 利用细胞核移植技术可以同时克 隆遗传基础完全相同的生物个体。这 些生物个体可用于遗传参数的估测, 饲料营养价值的评定以及环境与动物 关系的研究等领域。 可以从转基因动物血浆和乳汁中 获取外源药用蛋白质。转基因动物乳 腺成为公认的生产重组蛋白质的理想 器官。 用ES细胞生产转基因动物,可以 进行定向变异和育种,打破了物种的 界限,突破了亲缘关系的限制,加快了 动物群体遗传变异程度。 5 存在的问题 在ES细胞的建系中,研究人员还没 有找到分离获取各种动物ES细胞的最 5· · LIVESTOCKANDPOULTRYINDUSTRYNO.214 收稿日期:2006-12-10 作者简介:袁小远(1980.01-)女,硕士,研究方向:基因工程与畜禽传染病防治 兽医研究 佳时期;也未能保证ES细胞高效增殖和 有效抑制其分化,因此往往出现非整倍 体核型。在ES细胞的应用研究中,目前 仅仅局限于用ES细胞分化特定细胞以 期望修复替代坏损组织细胞,而且常常 存在着免疫排斥问题。 主要参考文献 [1]Evans,M.,Kaufman,M.Establishmentin cultureofpluripotentialcellsfrom Mouse embryos.Nature,1981,292:154~156 [2]DeFeliciM ,M clarenA.Isolationof Mouseprimordialgermcells.Exp.CellRes., 1982,142:427~476 [3]LeichthammerF,BaunackE,BremG. Behaviorsoflivingprimordialgermcellsof livestockinvitro.Theriogenology,1990,33 (6):1221~1230 [4]MariaP.DeMiguel,LinzhaoCheng,Eric C.Holland,etal,DissectionoftheC—Kit signalingpathwayinmouseprimordialgerm cellsbyretroviral—mediatedgenetransfer. NailAcadSciUSA,2002,99(16):10458~ 10463 [5]韩建永,桑润滋.哺乳动物PGCs用于胚 胎干细胞培养的研究,黄牛杂志,2001,27 (6):43~46 [6]DeFeliciM,MclarenA.Invitrocultureof mousePGCs.Cell.Res.1991,144:417~427 [7]AmitMCarpenterMK,InokumaMS,et al.Clonallyderivedhumanembryonicstem cell lines maintain pluripotential and proliferativepotentialforprolongedperiodsof culture.DevBiol,2000,227,271~278 [8]王廷华 羊惠君 JohnW.Mcdonald,干细胞 理论与技术,科学出版社,2005,(1),7~8 [9]ShiCZ,DhirRN,KesavanP,etal.Mol ReprodDev,1995,42(2):173~179 [10]董晓,冯书堂,郑行.胚胎干细胞的研究 进展.国外畜牧科技,2000,27(4):24~26 19世纪50年代,新城疫病毒使农 场主晚期胃癌的转移受到抑制的情况 引起人们的关注。在随后的研究中发 现新城疫病毒在肿瘤细胞中的复制是 在正常细胞中复制的1万倍[1];而且仅 特异性地杀伤肿瘤细胞,对正常的细 胞没有毒副作用。而目前国内外针对 癌症肿瘤的治疗还多数依赖于放疗、 化疗等手段,这些治疗方法副作用大、 对正常的组织器官有所损伤、容易复 发、花费高等缺点,故针对新城疫病毒 抗肿瘤作用的研究成为目前肿瘤治疗 研究的新热点之一。本文就新城疫病 毒抗肿瘤的作用基础、抗肿瘤作用的 机制以及国内外的相关研究概况进行 综述。 1 新城疫病毒概况 新城疫 病 毒 (Newcastledisease virus,NDV)属副粘病毒科副粘病毒亚 科腮腺炎病毒属的禽副粘病毒。 NDV 一般呈球形,直径100~500nm,基因组 为负链单股RNA,大小为15~16kb。病 毒具有囊膜,内含有一长螺旋状核衣 壳,囊膜外有长约8~12nm的糖蛋白纤 突。病毒的基因组包括6种基因,分别 用于编码6种病毒结构蛋白。其中3种 与病毒的脂质膜有关,即覆盖在病毒 囊膜表面的血凝素和神经氨酸酶活性 的(HN)糖蛋白、融合(F)糖蛋白以及 脂膜内的非糖基化内膜蛋白(M)。其中 HN蛋白和F糖蛋白是2种主要的功能 蛋白,F蛋白具有使病毒囊膜与宿主细 胞膜融合、使病毒穿过细胞膜进入细 胞的作用。HN糖蛋白在病毒脂质囊膜 上形成纤突,具有血凝素和神经氨酸 酶活性,在病毒侵染过程中识别细胞 受体、介导病毒吸附细胞膜。另外3种 与基因组RNA有关,它们是核壳蛋白 (NP)、磷蛋白(P)、高分子量蛋白(L)。 2 新城疫病毒抗肿瘤的作用机理 新城疫病毒的抗肿瘤反应是多方 面的,其可以促使机体产生非特异性 免疫和特异性免疫等有效的抗肿瘤反 应。NDV能改变肿瘤细胞的免疫原性, 增强免疫细胞识别肿瘤细胞和杀伤肿 瘤细胞的能力,提高机体免疫监视功 能,促进机体的排斥肿瘤反应的能力。 究其原因,主要有以下几个方面[2]:(1) NDV诱导细胞因子的产生:NDV感染 机体可诱导干扰素(Interferon,IFN)、肿 瘤 坏 死 因 子 (Tumornecrosisfactor, TNF)、白细胞介素(Interleukin,IL)、单 核细胞集落刺激因子 (Granulocyte- macrophagecolonystimulatingfactor, GM-CSF)等细胞因子的产生;(2)NDV 对免疫细胞的调节作用:NDV可激活 患瘤机体的免疫细胞,而活化的免疫 细胞对肿瘤细胞的毒性作用主要通过 CTL杀伤肿瘤细胞作用、巨噬细胞对肿 瘤的破坏作用、NK细胞选择杀伤肿瘤 细胞作用、抗体依赖的淋巴细胞介导 细胞毒性作用等而发挥效应;(3)NDV 的HN蛋白的抗肿瘤作用:HN蛋白具有 神经氨酸酶活性,神经氨酸酶具有去 除糖蛋白末端唾液酸功能,从而使肿 瘤细胞的抗原暴露出来,使免疫监视 细胞容易识别和杀伤肿瘤细胞;(4) NDV对肿瘤细胞的选择性杀伤作用: 体外实验已证实弱毒NDV能选择性杀 伤人颈部癌细胞系(KB8511)、成神经纤 维瘤细胞系(IMR32)、Wilim肿瘤细胞系 (G104)、纤维肉瘤细胞系(HT1080)、膀 胱癌细胞系 (HCV29)、骨肉瘤细胞系 (KHOS)的细胞,而对人的正常的成纤 维细胞系无作用。 鸡新城疫病毒的抗肿瘤作用 袁小远1 李 俊2 张 倩3 (1.山东省农业科学院家禽研究所,山东 济南 250023; 2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所;3.黄岛出入境检验检疫局) 中图分类号:S852.65+9.5文献标识码:B文章编号:1008-0414(2007)02(X)-0006-02 动物胚胎干细胞的概念与应用 胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ES 细胞)是从早期胚胎内细胞团 (Innercell mass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgerm cells,PGCs)经体外分化、抑制培养、分离和 克隆得到的具有发育全能性的细胞。其在体 外抑制培养时,可以增殖、冷冻、操作和筛 选,又可通过胚胎嵌合和细胞核移植参与各 种组织的发育,形成克隆动物。ES细胞作为 一种新型的实验材料,广泛应用于动物克 隆、转基因动物的生产、真核细胞基因的表 达与调控、人类遗传病动物模型的创建,人 类器官移植材料的生产以及细胞分化机制 的研究等领域。ES细胞分离与克隆技术、遗 传工程和胚胎工程相结合,对于阐明动物生 长的基本规律、抢救和保护濒危动物遗传资 源、建立先进的动物育种技术体系具有重大 的理论意义和实践价值。 ●相关链接 6· ·
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