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小板凳社区收集 xiaobandeng.com 项目摘要 项目名称：基于生物信息的药靶高通量筛选及功能研究 主要建议人姓名： 院 士 院 士 教 授 教 授 研究员 建议首席科学家姓名、年龄、单位： 40 岁 37 岁 经费预算金额：2800 万元 摘要正文： 疾病对人类的健康和生存构成重大威胁，是世界各国面临的最重要的社会问 题之一。当前和今后相当长的时期内药物将是疾病治疗的最主要手段，但由于历 史、经济及观念等原因，与发达国家相比我国在药学相关基础研究，特别是创新 药物的的基础研究和开发领域比较落后，导致医药产业基础较差，药品来源长期 依赖于仿制和进口，每年进口药品达 40 亿美元以上。在中国加入 WTO 以后， 一方面，由于知识产权保护的限制，药品仿制不可能再成为我国医药产业的中长 期目标；另一方面，由于成员国之间的低关税，国外药品将会更多地进入中国市 场。这不仅严重影响到我国人民的用药和健康问题，同时也将威胁我国医药产业 的生存和发展，进而影响我国医药产业对国民经济的贡献度。因而，建立和发展 我国自主的创新药物基础研究和开发体系成为当务之急，缺乏疾病特异性药靶是 当前新药研究和开发的瓶颈。同时，对现有药物与机体相互作用机理认识的局限 性是造成药物毒副作用的主要原因。因此，药靶的研究是新药研究和开发及临床 合理用药中急需解决的重大科学问题。 当前比较成熟的药靶仅 500 个左右，远不能满足新药研究和开发的需求。估 计人类基因中应该有 3000-5000 个可以作为药物的靶标。由此看来，药物靶标的 研究不仅是必须的，而且有很大的探索空间。充分利用有效的靶标发现和功能验 证技术，从现有大量的基因组学等信息资源中寻找重大疾病治疗药物的关键靶分 子并其多态性对药物疗效和毒副作用的影响，为新药研究和开发提供靶标， 并为临床安全用药提供理论依据是完全可能的。药靶的研究不仅具有重大的社会 1 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 和经济效益，而且具有重要的科学意义。该项研究对保证我国人民的健康和生存、 用药安全和有效、促进我国医药产业的国际竞争力、推动我国药物学、生物信息 学等相关学科的发展具有重要的意义。 预期目标： z 建立一系列药靶筛选和功能研究技术平台：建立以生物信息学和生物芯片、 化学基因组学和病毒感染基因组学为基础的药靶高通量筛选技术平台；在分 子、细胞、动物及人体水平上，建立以生物芯片、反义核酸/RNAi、转基因 和基因敲除等技术为核心的系统的药靶验证技术平台。 z 建立“组合药靶”的发现策略：基于生命是一个复杂的过程和体系，疾病是 由多个彼此之间存在着相互作用和动态变化的分子引起的这些基本生理和 病理现象，提出“组合药靶”的药靶发现策略，验证并完善组合药靶策略的 可行性。这一策略的核心思想是：从基因功能网络中筛选疾病特异相关的基 因组合，并验证以这些特异性基因组合为靶进行药物筛选的可行性及机理， 如果被证明可行，则这些特异性分子组合即称为“组合药靶”。 z 建立药靶发现的生物信息学知识系统：整合结构生物学和功能基因组学的信 息资源，建立相应的药靶发现生物信息系统学知识系统，包括数据库、药靶 筛选和验证的新算法、新理论等。完成具自有知识产权的人类蛋白组电子字 典 1 项(human protein dictionary)、二级数据库 3－5 个和新算法 2－3 个； z 发现若干新型药靶:(1)通过生物信息学手段分析，初步筛选出 1000－3000 个 潜在药靶，300-500 个可供进一步实验验证的候选药靶；(2)通过系统筛选和 功能验证，获得 3-5 个（组）可供抗肿瘤或抗病毒药物筛选的药靶和“组合 药靶”；(3)发现 2－3 个与疗效和毒副作用有关的功能多态性 SNP。 研究内容及课题设置： 特异性和可药性(drugability)是一个药靶必须具备的最基本的性质，如何发现 特异性和可药性药靶并分析其特点和作用机理是本项目要解决的关键科学问题。 针对上述问题，首先拟建立一个药靶发现的技术平台，并将其应用于抗肿瘤和抗 乙型肝炎病毒药靶的发现，探索特异性和可药性药靶的特点和规律，为新药靶的 发现奠定技术和理论基础。 技术平台的建立拟根据药靶发现的需要，结合国际前沿及我国的研究基础、 科研、人员和技术条件，首先基于现有生物信息资源，通过生物信息学、化学基 因组学，结合表达谱分析等技术手段，筛选系列候选药靶，然后通过 RNAi 和反 义核酸、生物芯片、酵母双杂交、转基因和基因敲除及生物信息分析等技术，结 合肿瘤细胞和裸鼠移植瘤模型对发现的候选药靶进行系统的功能验证，获得特异 性和可药性靶标。 就疾病特异性和可药性靶标的验证，拟采用消化系统肿瘤作为主要研究对 象，采用“组合药靶”的策略进行探索。考虑到肿瘤是一个多基因相关疾病，从 2 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 单一药靶很难达到理想的效果，多靶点干预应该是肿瘤特异性治疗的发展方向。 从大量的肿瘤相关基因中发现特异性和可药性的基因组合作为药物多靶点干预 的靶标（组合药靶）并阐明其作用机理是本项目的核心内容。 本项目拟针对若干消化系统肿瘤，采用生物信息学和表达谱分析等先进的技 术手段选择与肿瘤发生、发展及转移等相关的基因，通过正交设计等统计学方法 进行实验设计，应用反义核酸或 RNAi 技术，结合基于细胞的高通量筛选，验证 候选靶基因和基因组合与肿瘤细胞增殖或凋亡的相关性。对其特异性进行分析， 发现具有体外特异抗癌作用的候选“组合药靶”。采用生物芯片和蛋白质组学技 术，在细胞水平上分析上述“组合药靶”被抑制前后肿瘤细胞基因和蛋白质表达 谱的变化，揭示多靶标干预肿瘤细胞增殖等功能表型的分子机理。最后在裸鼠原 位或皮下异植瘤模型上验证“组合药靶”的抗肿瘤作用，获得特异性和可药性靶 标。 此外，针对某些抗肿瘤药物作用靶标和代谢酶的多态性影响药物代谢、疗 效和毒副作用的问题，本项目拟选择代表性药物，系统分析其相关基因多态性， 通过药代动力学和临床疗效和毒副作用观察，阐明药靶和代谢酶多态性与药物疗 效和毒副作用的关系，并通过突变分析等手段阐明其内在科学规律。 最后为了验证组合药靶发现策略在其它疾病药靶发现中的适用性，项目拟基 于病毒感染基因组学的策略，以乙型肝炎病毒(HBV)为例，从宿主细胞中发现 HBV 感染性疾病治疗的特异性组合药靶。 针对上述研究内容设置以下 7个课题: 课题 1：药靶发现的生物信息学研究和知识系统的建立 课题 2：药靶高通量筛选及其相互作用分析技术体系的建立 课题 3：用化学基因组学方法高通量筛选药靶及其配基 课题 4：用基因工程小鼠筛选和验证次级药靶 课题 5：“组合药靶”的高通量筛选及功能研究 课题 6：“组合药靶”基因的多态性分析及其功能研究 课题 7：用“组合药靶”的策略从宿主细胞中发现抗 HBV 药靶 创新点和特色： z 创新的药靶发现策略：通常人们谈到药靶都是指单一分子，但是，基于生命 是一个复杂的过程和体系，疾病是由多个彼此之间存在着相互作用和动态变 化的分子引起的这些基本生理和病理现象，本项目提出了“组合药靶”的药 靶发现策略。这一策略的核心思想是：药物需要作用一系列疾病特异的靶分 子组合才能发挥最佳的治疗效果，该靶分子组合经过筛选和验证，若具有特 异性和可药性即为组合药靶。这一观点的验证和应用将给药物靶分子的发 现、药物筛选及新药的研究、开发乃至临床用药提供新的理论和实验依据。 z 创新的药靶发现生物信息学知识系统：应用自研制的算法软件，整合和挖掘 3 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 公开及自有的基因组学数据，实现与本项目内的分子生物学研究间密切的互 动、查询与分析，结合基于结构的药物设计技术，形成“药物靶标发现的知 识系统”，为靶标的可药性提供线索和基础。 z 综合的药靶发现技术平台：综合运用生物信息技术、生物芯片、反义核酸和 RNAi、蛋白质组学、酵母双杂交、基因敲除等技术，并将其有机的整合在 一起，形成一个高效的药靶筛选和功能验证的技术平台，为发现和确证新型 药靶提供有力的技术保障。 根据国家需求和项目特点，集成国内的生物信息学、基因组和蛋白质组学、 生物化学和分子生物学、生物芯片、反义核酸等先进技术及药学、基础和临床医 学等优势学科，联合……等在学科、人才、科研基础和实验材料、实验室、生物 信息及技术资源上优势互补的强势单位，协作攻关，争取在短期内建立起我国药 靶研究的技术平台，发现若干药物筛选的新型药靶，为我国重大疾病的治疗、创 新药物产业的发展及药学学科的发展做出突出贡献。 4 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 一、 立项依据 1．疾病治疗是急需解决的社会问题，药物是疾病治疗的最主要手段，医药产业 将成为 21 世纪的支柱产业 疾病依然是威胁人类生命健康的头号杀手。全球仅癌症患者就超过 4000 万人。 我国目前每年新增癌症患者已超过 160 万人，现有肿瘤患者至少 300～400 万人， 年死亡人数超过 130 万。预计 2005 年抗肿瘤药物市场将达 283 亿美元。据世界 卫生组织统计全世界 3.5 亿以上 HBV 携带者，约 1/4 发展为肝癌和肝硬化。目 前我国 HBV 携带者 1.2 亿左右，每年有 50 万人死于与 HBV 感染有关的疾病， 直接医疗费用约 500 亿元。当前，药物治疗依然是疾病控制的最常用的手段，因 此也是最有市场前景的产业。目前全球医药市场总额已达 3000 亿美元以上，估 计 2010 年将达 6000 亿美元。此外，不同病人对同一药物的反应不同，表现为不 同的药物疗效和毒副作用一直困扰着临床医疗和制药业，也是肿瘤治疗失败的重 要原因。我国仅氨基糖苷类不良用药导致的耳聋病人就超过 500 万人。药物错误 剂量使用使美国每年至少耗费数百亿美元。 2．选择性药靶发现和合理用药是疾病治疗药物研究、开发及临床应用的关键 环节和最亟待解决的重大科学问题 当前在药学领域有两大科学问题急需解决：一方面临床应用的大部分药物作 用靶标及机理有待阐明；另一方面又有大量新型药靶亟待发现。疾病药物治疗的 关键是高效率和高选择性，尤其是特异性药靶的发现及功能阐明等关键科学问 题。理想的药靶应功能明确，对发病起关键作用 (causative)且具有可药性 （drugability）等。 3．人类基因组及相关技术为理想药靶的发现及药物的研究和开发提供了良 好的机遇和获得重大突破的可能 目前，已分析并公开了 600 种生物的全基因组序列，其中 170 种为真核生物。 更有意义的是人类基因组全序列分析的完成，功能基因组研究在不断深入。这些 成果不仅为阐明生命的本质提供了海量的生物信息资源，同时将为其它学科的发 展提供极好的发展机遇。大量基因组学的研究成果和伴之而产生的大量新技术如 生物信息学、化学基因组学、生物芯片、蛋白质组学、转基因和基因敲除等技术 也为药靶的发现、验证及多态性分析为核心的基因组药物学研究提供了坚实的理 论基础、丰富的生物信息资源及高效的技术手段。 4．实现国家人口与健康领域科研战略目标的需要 从基因到药物再到疾病，我国已经在结构生物学和功能基因组学、蛋白质组 学、微生物基因组、疾病基因组学、中药复方基础研究和药物先导化合物发现等 领域部署了一系列相关课题。纵观这条人体与健康的生命科学项目战略部署链， 可以发现缺了两环：一环是从基因到靶标，另一环则是从药物到临床。该项目的 5 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 部署不仅可以完善该科学战略部署链，而且可以充分利用其它项目的研究成果并 同时为其它项目研究提供技术平台、筛选靶标和理论基础。 总之，开展药靶的研究是创新药物研究和开发的源泉，深入研究有望在药物 的研究和开发方面获得突破性进展，实现我国的药物研究源头创新的飞跃发 展，进而解决 13 亿人民治病用药的社会和经济问题。药靶筛选和功能研究 是特异性高效，低毒药物发现的前提。该研究有望在药物作用的特异性这一 关键科学问题上获得重大突破。 二、 内外研究现状及发展趋势 1．研究背景 传统的药靶发现方法一般是通过有显著药理作用的药物，经过分子药理学研 究，最终认识药靶。在这一过程中，发现有药理作用的药物是瓶颈。虽然也可以 通过动物实验发现有药理作用的化合物，但由于规模、速度和耗费等因素的限制， 这一过程很难实现大规模和高效率。 随着生物化学及分子生物学技术的发展人们对疾病认识达到了分子水平，并 发现了一批新的药靶，从而使基于机理的药物发现成为可能。此时，以靶标为基 础的药物筛选包括模型的建立及化合物的合成和收集，成了新药研究的瓶颈，因 此大量的靶标并没有的到充分的利用。随后出现的高通量和超高通量筛选和组合 化学技术很好地解决了上述难题，并确实发现了一批很好的新药。为数不多的靶 标和成千上万的化合物库很快被筛了无数遍，利用价值越来越小，于是新的药靶 的发现很快又成了新药研究和开发的瓶颈。科学家特别是制药公司很快把目光集 中到新药靶发现这个瓶颈上。此时，也是人类基因组计划研究如火如荼的阶段， 于是药物学家和分子生物学家很快就找到了共同的兴奋点─从人类基因组中寻 找疾病相关基因和药靶。为实现这一目标，大量基因特别是疾病相关基因被申请 专利，有的还被高价出售给制药公司等，如肥胖基因和端粒酶基因等。但并不是 所有的疾病相关基因都能成为药靶，如肥胖基因目前就被人为很难成为药靶。理 想的药靶不仅要在疾病的发生和发展中扮演关键(causative)的角色，而且还有具 备可药性(drugability)，否则只能是一个疾病标志物而已。因此，药靶的发现和功 能验证成了基因组学特别是功能基因组学和药物学领域共同的研究热点，从而也 产生了一门新的交叉学科，即基因组药物学。 基因组药物学在生物技术和医药工业界掀起了前所未有的高潮，很多大的制 药公司与实验室看到了它的潜在商机，纷纷投入巨资。在短短几年内，已经先后 有多家联合体形成，其中的 10 多家涉及基因组药物学在药物研究和开发中的应 用。 2．研究进展 基因组学及相关学科和技术的发展提供了连数学家们都感到恐惧的海量生物信 息。面对如此多的信息资源，科学家们在经历了短暂的激动之后，随之而来的便 6 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 是茫然。如何利用这些宝贵的信息资源成了后基因组或者说功能基因组时代的重 要科学问题，正是在这种背景下产生了生物信息学、生物芯片、酵母双杂交等一 系列高通量研究新技术。这些技术不仅在基因组学特别是功能基因组学研究中发 挥了重要的作用，而且也是目前药靶发现和验证的核心技术手段。 生物芯片技术经过几年的发展在特异性和灵敏度等方面已基本能够满足基 因表达和 SNP 的研究的要求，并已开始应用于新药靶的寻找和基因多态性的研 究。有报导利用基因芯片 发现 IL-13 在 L428 及 KM H2 细胞系表达异常升高， 从而提示 IL-13 及其信号转导途径，可能成为治疗何杰金氏病的重要靶标。史克 公司利用生物信息学方法，发现了一个治疗骨质疏松的药靶“Cathepsin K”。通 过建立 P2Y1 基因敲除模型和利用选择性 P2Y1 拮抗剂研究证实 P2Y1 受体是抗 血栓药的药靶。抗体技术也是药靶发现的有效途径之一，利用该技术成功的发现 了抑制血管生成的 抗肿瘤药靶 KDR 和 VEGF。通过鞘内给予靶向河豚毒素抗性 的钠离子通道 NaV1.8 的特异反义寡核苷酸，可以降低相应神经元的钠电流，减 轻神经损伤引起的神经性疼痛，证实了 NaV1.8 可以作为治疗神经性疼痛特异的 分子靶。最近发展的 RNAi 技术比 ASODN 特异性更强，已阐明大量基因功能， 也可用于药靶验证。m1 受体选择性激动剂 AC-42 的发现证实了化学基因组学策 略的价值。AC-42 表现出单一的受体结合作用，其结合位点不同于乙酰胆碱的结 合位点，且为 AC-42 显示特异性 m1 受体激动作用所必需。这一 m1 受体特异激 动剂的出现，就有可能在药理学上证实不同疾病状态下毒蕈碱 m1 受体的功能。 大量的研究发现药靶、转运蛋白及代谢酶 基因的多态性是影响药物疗效和 毒副作用的重要因素之一。这种多态性差异可以影响化疗药物对肿瘤患者的疗效 和毒性。严重毒性常与药物代谢酶基因的突变相关。最近研究发现，亚甲基四氢 叶酸还原酶(MTHER)的 C677T 突变可能改变环磷酰胺、甲氨喋呤和 5-氟尿嘧啶 伍用方案对患者的治疗效果。预计在未来 3－5 年内应用患者的遗传信息能更精 确预测患者对现有一些药物严重不良反应的危险性；在未来的 5－10 年内能更精 确预测患者如何从个体化治疗中获得益处。 总体看，与国际水平比较，国内基因组药物学和药靶的研究还有较大差距，处于非常初步的 阶段。但在某些相关科学和技术研究领域也已有相当好的工作基础和条件，甚至有一定的国 际影响。我国科学家完成了 1%的人类基因组计划，发现了几个有国际影响的新基因；完成 了若干病原微生物的全基因组测序。国内多家单位还分析了胎肝、神经及肾上腺等人类代表 性组织的 cDNA 序列，获得了大量有价值得的 EST 结构和功能信息。国家自然科学基金和 国家 863 还启动了基因组学和功能基因组学等一系列重大课题。在肿瘤、心血管、传染病、 精神和神经及衰老等重大疾病的发病机理研究方面也取得了诸多可喜的研究成果。在国家 各类科研项目的资助下，已经建立了相当完善的生物信息学研究技术平台，并正 在基因功能分析等领域发挥着重大作用。生物芯片技术日趋成熟，一系列用于表 达谱分析、基因分型及药物筛选的基因和蛋白芯片已经开始投入使用。发现了系 列抗肿瘤等生物活性的反义核酸并建立了比较成熟的用 RNAi 进行基因功能研 究的技术平台。在遗传药理学领域也有多年的工作积累，取得了一系列有国际影 7 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 响的研究成果。国家自然自然科学基金还适时启动了药物基因组学和病毒与宿主 相互作用的重点项目。此外，针对国际基因组药物学的发展，我国还举办了两次 全国和国际性的专题学术研讨会。 3． 发展趋势 基因组药物学理论体系正在酝酿和形成的过程中，并有可能促进一系列相关 新学科和新理论的形成，产生一个新的科学探索热点和经济增长点。未来基因组 药物学的的发展趋势将包括以下几个方向。 z 疾病治疗特别是多基因相关疾病的治疗将向多靶标发展：生命和疾病是一个 非常复杂的生理和病理过程，其中涉及到多基因、多通路多途径的分子功能 网络相互作用的过程，如肿瘤的发生和发展就涉及到细胞增殖和凋亡、细胞 周期、细胞迁移及血管生成等多个环节的交互作用，想通过单一靶标的作用 实现理想的治疗效果是非常困难的。因此，针对多基因疾病相关的“分子群” 寻找组合式药靶将成为未来此类疾病药物研究和开发及治疗的重要发展方 向。 靶标特别是药物受体研究向亚型发展：虽然人们早已发现了药物受体存在功能有 差异的不同亚型，但缺乏大规模系统研究。随着其结构和功能研究的不断深入， 越来越多的靶分子亚型特别是受体亚型将会出现，如现已发现在基因水平上，5 －羟色胺受体至少有14个亚型。亚型结构和功能的特异性研究对于高选择性和低 副作用药物特别是手性药物的设计具有重要的指导意义。 基因多态性与药物反应差异的问题开始引起重视：药物反应个体差异是临床常见 的问题。遗传药理学研究已经证明这与人类不同民族和个体的基因多态性特别是 单核苷酸多态性(SNP)密切相关。人类基因组计划特别是比较基因组学的研究证 明SNP存在的普遍性后，国际学术和制药界对此研究达到高潮，但是目前的研究 多是把目标集中在SNP的发现上，少系统和完整的某一个或一类药物相关SNP研 究的资料报导。这种研究方式很难在短期内在指导临床用药方面发挥重大的作 用。未来的研究将集中在阐明同一基因和不同基因中多个功能相关的SNP之间的 交互作用对药物疗效和毒副做用的综合影响。 感染性疾病特别是新型病毒感染性疾病治疗的靶标将向宿主发展：耐药是以微生 物为靶的感染性疾病药物治疗面临的最严重问题，疫苗是一个重要的发展方向， 但有两个关键问题：一是目前只有部分微生物可以制备有效的疫苗；二是治疗性 疫苗还不太成熟。因此未来感染性疾病治疗小分子药靶标的研究和发展方向将是 从宿主细胞中寻找感染相关的关键分子并阐明其与病毒感染的关系。 药靶特别是高特异性药靶的选择将由胞膜向胞内转移：鉴于受体信号转导在胞内 有多条通路和环节，仅将药靶的发现局限在细胞膜上的受体是很不合理的，从细 胞内寻找药靶不仅可以提供更多的可能性而且功能也会更特异，因为与细胞膜受 体相比这些分子处于更下游，功能可能更专一。 4．参考文献 (1) Cao M, Kobel PA, Morshedi MM, et al. Defining the Bacillus subtilis sigma(W) regulation: a 8 小板凳社区收集 xiaobandeng.com comparative analysis of promoter consensus search., run-off transcription/macroarray analysis(ROMA), and transcriptional profiling approaches. J Mol Biol, 2001,313(4):903-19 (2) Markstein M, Markstein P, Markstein V, et al. Genome-wide analysis of clustered dorsal binding sites identifies putative target genes in the Drosophila embryo. Pro Natl Acad Sci USA, 2002,99(2):763-8 (3) Kloos DU, Choi C, Wingenderf E. The TGF-beta- Smad network: introducing bioinformatics tools.Trends Genet, 2002,18(2):96-103 (4) Read TD, Gill SR, Tettelin H,et al. Finding drug targets in microbial genomes. Drug Discov Today，2001，6（17）：887-892 (5) Innocenti F, Ratain MJ. Update on pharmacogenetics in cancer chemotherapy. Eur J Cancer, 2002, 38(5):639-644 (6) Werner T. Cluster analysis and promoter modeling as bioinformatics tools for the indentification of target genes from expression array data. 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Nucleic Acids Res, 2002,30(1):412-5 三、总体目标、五年目标 1．总体目标 9 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 通过上述研究建立我国特色的药靶发现和验证的综合性技术平台，发现若干 功能明确的药靶。为创新药物的研究、开发及临床合理用药提供新型靶标和理论 依据；培养一支药物基因组学研究人才队伍，为我国创新药物的研究、开发乃至 临床个体化医疗打下坚实的学科、人才、理论和技术基础。 2．五年目标 预期目标： z 建立一系列药靶筛选和功能研究技术平台：建立以生物信息学和生物芯片、 化学基因组学和病毒感染基因组学为基础的药靶高通量筛选技术平台；在分 子、细胞、动物及人体水平上，建立以生物芯片、反义核酸/RNAi、转基因 和基因敲除等技术为核心的系统的药靶验证技术平台。 z 建立“组合药靶”的发现策略：基于生命是一个复杂的过程和体系，疾病是 由多个彼此之间存在着相互作用和动态变化的分子引起的这些基本生理和 病理现象，提出“组合药靶”的药靶发现策略，验证并完善组合药靶策略的 可行性。这一策略的核心思想是：从基因功能网络中筛选疾病特异相关的基 因组合，并验证以这些特异性基因组合为靶进行药物筛选的可行性及机理， 如果被证明可行，则这些特异性分子组合即称为“组合药靶”。 z 建立药靶发现的生物信息学知识系统：整合结构生物学和功能基因组学的信 息资源，建立相应的药靶发现生物信息系统学知识系统，包括数据库、药靶 筛选和验证的新算法、新理论等。完成具自有知识产权的人类蛋白组电子字 典 1 项(human protein dictionary)、二级数据库 3－5 个和新算法 2－3 个； z 发现若干新型药靶: (1) 通过生物信息学手段分析，初步筛选出 1000－3000 个潜在药靶，300-500 个可供进一步实验验证的候选药靶；(2) 通过系统筛选 和功能验证，获得 3-5 个（组）可供抗肿瘤或抗病毒药物筛选的药靶和“组 合药靶”； (3) 发现 2－3 个与疗效和毒副作用有关的功能多态性 SNP。 四、拟解决的关键科学问题和主要研究内容 1.拟解决的关键科学问题 药靶的发现是新药研究和开发的瓶颈。围绕这个问题，本项研究拟解决以下 三方面的科学问题：(1) 药靶的特异性问题：一个功能和疾病相关基因能否成为 药靶与许多因素有关，理想的药靶必须在疾病发生和发展中扮演重要角色且与其 在正常细胞中的功能有明显区别。如何发现特异性药靶并阐明其作用机理是本项 目要解决的核心科学问题之一； (2)药靶的可药性问题：并不是所有的疾病相关 基因都能够成为药靶，只有那些即能与药物发生相互作用又能引起药物效应的基 因才能成为药靶，阐明药靶的可药性特点和规律是本项目拟解决的另一关键科学 10 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 问题； (3)多态性对药物作用的影响：患同一种疾病的不同个体对药物的反应有 很大差异，这是引起药物疗效不佳和不良反应的最重要原因之一。本项目拟解决 的另一科学问题是药靶和药物代谢酶多态性的发现及其与药物疗效和毒副作用 的关系。 2．主要研究内容 针对上述科学问题，本项目拟开展以下 7 个方面的研究内容： 1) 药靶发现中的生物信息学研究和知识系统的建立 对结构和功能基因组学的数据进行整合与加工，构建实时注释的人类蛋白组 电子字典，其中包括全部已知和in silico预测的蛋白质及其注释，为本项目的生 物信息学研究奠定基础。用基因表达谱及蛋白质谱的公开及自有数据，结合二级 数据库构建和包括SNPs数据在内的数据挖掘的手段，探索建立疾病中核酸和/或 蛋白质相互作用的网络系统；可供对疾病的机制、规律，包括与SNPs的关联进 行深入分析和理论探讨。对经分子生物学验证的关健候选靶标进行三维结构分析 ，为基于结构的药物设计技术铺垫技术平台，提供参考数据和可药性的线索。研 制相关的新算法、新软件；建立本项目的LIMS信息管理系统，实现生物信息学 与分子生物学研究的互动、查询与分析，完成“新药靶标发现的知识系统”，不 仅为本项目提供in silico潜在靶标的来源与验证，还为经分子生物学验证的关健 靶标提供三维结构信息，为进一步的药物设计奠定基础。 2) 高通量药靶筛选及其相互作用分析技术体系的建立 根据课题1所筛选的与肿瘤发生、发展及转移等环节相关基因的序列，设计 并合成出相应的基因探针，制备成基因芯片。用该基因芯片分析人消化系统肿瘤 组织（已经具备国际上最系统的人类消化系恶性肿瘤裸鼠原位移植瘤株库，并建 立了相应的动物移植瘤模型）的基因表达谱并同时分析其蛋白质表达谱，将得到 的表达谱与相应的参考组织比较，通过聚类等生物信息学分析发现肿瘤组织特异 性表达的基因或蛋白分子做为候选药靶。 克隆和在酵母中表达300-500个课题1所提供的及上述实验发现的针对肿瘤 等疾病的候选药物靶基因或结构域，基于酵母交配技术用酵母双杂交高通量研究 候选药靶蛋白或其结构域相互作用蛋白网络，获得与肿瘤相关的差异表达蛋白相 互作用的图谱和功能线索。 3) 用化学基因组学方法高通量筛选药靶及其配基 在建立并优化基于分子结构的药物虚拟筛选软件及算法的基础上，针对本项 目所发现的消化系统抗肿瘤药物候选药靶，进行结构模型建立。应用高通量计算 机虚拟方法发现配基，并进行组合化学合成。对合成的多样性配基依次在细胞和 动物模型上进行活性评价，筛选出有功能的药靶并通过其它技术进一步验证其功 能和可药性，从而获得可供抗肿瘤药物筛选的新药靶。 11 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 应用基于细胞功能的高通量筛选方法，对具有结构多样性的化合物库(包括 具有抗肿瘤活性的中药有效成分或其提取物)进行筛选，根据细胞功能的变化， 发现具有抗肿瘤活性的化合物并在动物水平上进行验证得到活性先导化合物。以 该先导化合物为探针(配基)，采用生物芯片和蛋白质组学等技术研究其对基因和 蛋白表达谱的影响，发现其作用的候选靶标。通过反义核酸、RNAi、转基因或 基因敲除等技术对得到的候选靶标进行功能验证，以获得确证药靶。 4) 利用基因工程小鼠寻找和验证次级药靶 病理性血管新生与恶性肿瘤的发展密切相关，血管新生过程涉及多种血管生长调 控因子(包括VEGF，Angiopoetin和Jagged1等)的表达变化。这些因子分别涉及血 管内皮细胞的增殖、血管通透性和稳定性、及血管重塑等过程。多数因子在肿瘤 组织中表达异常，最新研究表明相关信号通路可能是潜在的抗肿瘤药靶。本研究 以Angiopoetin1、Jagged1和P53基因剔除小鼠为模型，分析三种不同基因之间的 协同功能，比较突变型小鼠和野生型小鼠对不同致癌物和不同抑癌药物的反应性 ，运用基因芯片比较突变型小鼠和野生型小鼠相关组织的基因表达差异，寻找这 些基因的下游调控因子作为潜在的抗肿瘤药物新靶标，并进一步运用转基因和基 因剔除技术分析2－3个下游因子作为药靶的可能性。建立用基因工程小鼠寻找和 确认药靶的技术平台。 5) 5）“组合药靶”的高通量筛选和功能验证 针对若干消化系统肿瘤，基于课题1－4获得的与肿瘤发生、发展及转移等相 关的基因，通过正交设计等统计学方法进行实验设计，应用反义核酸和RNAi技 术，结合基于细胞功能的高通量筛选验证候选靶基因和基因组合与肿瘤细胞增殖 或凋亡的相关性。对其特异性进行分析，发现具有特异抗癌作用的“组合靶标” 。采用生物芯片和蛋白质组学技术分析上述“组合药靶”被抑制前后肿瘤细胞基 因和蛋白质表达谱的变化，揭示多靶标干预肿瘤细胞增殖的分子机理。在裸鼠原 位或皮下移植瘤模型上验证“组合药靶”的抗肿瘤生长和转移作用。通过上述研 究探索基于“组合药靶”的特异性药靶发现策略并建立相应的技术体系，为基于 机理的特异性抗肿瘤药物的研究提供靶标和理论依据。 6）组合药靶”基因多态性分析与功能研究 鉴于抗肿瘤化疗药物较为严重的毒副作用及基因差异导致药物反应的个体 差异，以2-3种代表性肿瘤化疗药物（5-Fu，紫杉醇等）为例，选择与其疗效、 毒副作用相关的“组合药靶”，通过大规模基因筛查结合生物信息学分析，确定 其多态性在中国人群中的发生频率，以体外克隆表达及临床基因型/表型分析等 方法，系统研究与以上药物相关的代谢酶、靶标及转运蛋白等“组合药靶”基因 的多态性与药物代谢、疗效和毒副作用等变化的关系，确定基因多态性的功能， 建立基于基因分型指导抗肿瘤药物临床个体化医疗的方案，为合理用药提供理论 12 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 依据。 7）7）“组合药靶”的策略从宿主细胞中发现抗HBV药靶 根据课题1、文献和本实验室研究发现的HBV感染差异表达基因或蛋白质信 息，筛选一批候选靶基因，设计合成探针并制备成基因芯片。利用基因芯片技术 和蛋白质组学技术研究乙型肝炎病毒及其编码蛋白分子作用于（或感染和非感染 HBV基因）肝细胞前后细胞基因和蛋白质表达谱的变化，同时比较HBV患者和 正常人肝组织基因和蛋白质（包括血清）表达谱的变化。通过芯片表达谱生物信 息学分析发现差异表达的基因和蛋白质分子，寻找在乙肝病毒感染过程中宿主细 胞的主要应答基因和蛋白质分子。对发现的HBV感染相关基因，采用大规模基 因测序、分型和生物信息学方法，分析中国人群与乙肝病毒感染、发病有关联的 候选基因多态性特点，分析其与乙型肝炎感染、发病、治疗和预后的关系，从而 确定和发现一批乙型肝炎易感或抗性基因，作为抗HBV治疗的候选药靶。最后 利用“组合药靶”的策略筛选和验证以上关键分子作为抗HBV药物筛选“组合 药靶”的可行性。 五、总体研究方案 1．学术思路和技术路线 特异性和可药性(drugable)是一个药靶必须具备的最基本的性质，如何发现 特异性和可药性药靶并分析其特点和作用机理是本项目要解决的关键科学问题。 本项目首先拟建立一个药靶发现的技术平台(见图 1)，并将该技术平台应用于抗 肿瘤和抗乙型肝炎病毒药靶的研究，从该研究中发现一些特异性和可药性药靶的 特点和规律，为新药靶的发现奠定技术和理论基础。 技术平台的建立，首先根据药靶发现的需要，结合国际前沿及我国的研究基 础和技术条件等特色，基于现有生物信息资源，通过生物信息学、化学基因组学 技术结合表达谱分析等技术，筛选系列候选药靶，然后通过 RNAi 和反义核酸、 生物芯片、酵母双杂交、基因敲除再结合生物信息分析等技术结合肿瘤原位移植 模型对上述发现的候选药靶进行系统地功能验证，获得特异性和可药性药靶，通 过上述研究，建立药物基因组学数据库和药靶发现知识系统。 就疾病特异性和可药性药靶的发现问题，拟采用消化系统肿瘤作为主要研究 对象，采用“组合药靶”的策略进行探索。考虑到肿瘤是一个多基因相关疾病， 多靶点干预应该是肿瘤特异性治疗药物的发展方向。如何从大量的肿瘤相关基因 中发现特异和可药性的基因组合作为药物多靶点干预的靶标（组合药靶）并阐明 其作用机理是本项目的核心研究内容。 生物信息学 生物信息 疾病及药物相关信息 基因/蛋白组织表达谱 蛋白高级结构 基因多态性 公共及专业数据库及注释 其它信息资源 药靶筛选 候选药靶 确认药靶 药靶功能 验证 生物芯片；双杂交 反义核酸/RNAi 技术 转基因和基因敲除 生物信息学 药 靶 发 现 生 物 信 息 学 知 识 系 统 生物信息学；化学基因组学 表达谱分析；序列分析 13 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 图 1. 药靶筛选和验证的总体方案 本项目拟针对若干消化系统肿瘤，采用生物信息学和表达谱分析等先进的技 术手段选择与肿瘤发生、发展及转移等相关的基因，通过正交设计等统计学方法 进行实验设计，应用反义核酸或 RNAi 技术，结合基于细胞的高通量筛选，验证 候选靶基因和基因组合与肿瘤细胞增殖或凋亡的相关性。对其特异性进行分析， 发现具有体外特异抗癌作用的候选“组合药靶”。采用生物芯片和蛋白质组学技 术，在细胞水平上分析上述“组合药靶”被抑制前后肿瘤细胞基因和蛋白质表达 谱的变化，揭示多靶标干预肿瘤细胞增殖等功能表型的分子机理。最后在裸鼠原 位或皮下移植瘤模型上验证“组合药靶”的抗肿瘤作用，获得特异性和可药性靶 标(图 2)。 此外，针对药物作用靶标和代谢酶的多态性影响药物代谢、疗效和毒副作 用的问题，本项目拟选择代表性病例系统分析其多态性。通过药代动力学和临床 疗效和毒副作用观察，阐明药靶和代谢酶多态性与药物疗效和毒副作用的关系， 并通过突变分析等手段阐明其内在规律。 最后，为了验证组合药靶发现策略在其它疾病药靶发现中的适用性，项目拟 以乙型肝炎病毒为例，从宿主细胞中发现抗 HBV 感染的特异性组合药靶。 肿瘤相关基因 若干基因组合 候选组合药靶 基于细胞的高通量筛选 药靶作用机理分析 动物模型验证 正交设计 组合药靶 组合药靶发现策略的适用性验证 基因多态性对组合药靶特异性和可药性的影响 抗肿瘤药物相关基因多态性 其疗效和毒副作用的影响 从宿主细胞中寻找抗 HBV 组合药靶 14 小板凳社区收集 xiaobandeng.com 图 2.组合药靶发现的技术路线 2． 创新点与特色 z 创新的药靶发现策略：通常人们谈到药靶都是指单一分子，但是，基于生命 是一个复杂的过程和体系，疾病是由多个彼此之间存在着相互作用和动态变 化的分子引起的这些基本生理和病理现象，本项目提出了“组合药靶”的药 靶发现策略。这一策略的核心思想是：药物需要作用一系列疾病特异的靶分 子组合才能发挥最佳的治疗效果，该靶分子组合经过筛选和验证具有特异性 和可药性即为组合药靶。这一观点的验证和应用将给药物靶分子的发现、药 物筛选及新药的研究、开发乃至临床用药提供新的理论和实验依据。 z 创新的药靶发现生物信息学知识系统：应用自研制的算法软件，整合和挖掘 公开及自有的基因组学数据，实现与本项目内的分子生物学研究间密切的互 动、查询与分析，结合基于结构的药物设计技术，形成“药物靶标发现的知 识系统”，为靶标的可药性提供线索和基础。 z 综合的药靶发现技术平台：综合运用生物信息技术、生物芯片、反义核酸和 RNAi、蛋白质组学、酵母双杂交、基因敲除等技术，并将其有机的整合在一 起，形成一个高效的药靶筛选和功能验证的技术平台，为发现和确证新型药 靶提供有力的技术保障。 3． 可行性分析 z 有丰富的生物信息、疾病及遗传资源为基础：目前，已分析并公开了 600 种 生物的全基因组序列，其中 170 种为真核生物。更有意义的是人类基因组全 序列分析的完成，功能基因组研究的不断深入，在为阐明生命的本质提供了 海量的生物信息资源的同时也为药靶的发现提供了丰富的矿藏。估计人类基 因中蕴藏着约 5000-10000 个可能作为药靶的基因，考虑到亚型，多态性及蛋 白质修饰和构象等问题，实际的药靶数量还要多，而目前已经发现的药靶仅 500 个左右，这为新药靶的发现提供了非常广阔的探索空间。 z 有较优秀的学科带头人、成熟的系列技术、先进的实验室和配套设备为支撑： “欲善其事，必先利其器”。药靶的发现是一项涉及多学科和技术的交叉性 和综合性很强的项目，先进和完善的技术手段和仪器设备及综合应用这些技 术手段和设备的能力是实现新靶标发现的最关键因素之一。项目核心单位及 协作单位，不仅具有学科优势，而且在药靶发现和验证的关键技术和实验室 及配套仪器设备方面也具有明显的优势。如在生物信息学、生物芯片、反义 核酸/RNAi、蛋白质组学、基因敲除、药物高通量筛选、先导化合物发现及 药物设计等技术领域已经具备国际先进水平的技术平台并均配备有先进的 大型专业仪器设备及多个相应的国家和军队重点实验室或中心(参见工作基 础部分)，在这些实验室和中心里有多名特聘教授和国家杰出人才基金获得者 15 小板凳社区收集 xiaobandeng.com (参见研究队伍部分)。 z 在相关研究领域有良好的工作基础：国内在基因功能研究等领域有很好的工 作基础，国家自然科学基金和国家“863”和“973”还启动了基因组学和功 能基因组学等一些列重大课题，发现了几个有重要功能的新基因，完成了有 国际影响的 1%人类基因组测序，若干病原微生物的全基因组测序及水稻的 基因草图。国内多家单位还大规模分析了胎肝、心肌、神经及肾上腺等人类 代表性组织如的 cDNA 序列，获得了大量有价值得的 EST 结构和功能信息。 国家“973”在肿瘤、心血管、传染病、神经及衰老等重大疾病的发病机理 研究方面启动的系列重大项目，也取得了诸多可喜的研究成果。在国家各类 科研项目的资助下，已经建立了相当完善的生物信息学研究技术平台，并正 在基因功能分析等领域发挥着重大作用。在首批启动的“973”项目“重大 疾病药物先导化合物的发现”的推动下，我国药物研究综合水平有了很大的 提高。研究和开发了若干有知识产权的药物设计软件并在国内外推广应用， 建立了 2 个国家级药物高通量筛选中心或基地，通过上述技术平台应用发现 了一些先导化合物。国内生物芯片技术日趋成熟，一系列用于表达谱分析、 基因分型及药物筛选的基因和蛋白芯片已经开始投入使用。在国家自然科学 基金、国家“863”等多年的资助下，发现了系列有抗肿瘤和抗病毒等生物 活性的反义核酸，建立了比较成熟的用 RNAi 进行基因功能研究的技术平台。 在遗传药理学领域也有多年的工作积累，取得了一系列有国际水平的研究成 果，国家自然科学基金还启动了药物基因组学及病毒与宿主相互作用的重点 项目。 综上，目前国内已经具备了开展以药靶发现为主的基因组药物学研究的资 源、科研条件及工作基础。“万事具备，只欠东风”。在国家支持下，有效地组织 国内的科研队伍，充分利用国内外生物信息资源及国内的科研基础和条件，短期 内，在药靶的发现领域完全可以取得重大突破。 4．项目的组织方式 本项目除要做到参加单位分工协作、优势互补；技术平台共用、科研资源共 享；研究目标集中、长短结合及研究内容紧密衔接等组织形式外，还要采取以下 几种组织管理方式： z 课题对优秀人才开放：考虑到本项目是所有“973”项目中涉及学科和技术 范围最大的项目，有少数几个单位很难完成，但为了避