谷氨酰胺对断奶仔猪抗菌肽PR_39mRNA的表达调控

动物营养学报 , 一 卜 一 谷氨酞胺对断奶仔猪抗菌肤 一 的 表达调控 赵玉蓉 王红权 贺建华 ‘ 湖南农业大学动物科技学院 , 长沙 范志勇 摘 要 本文 旨在探讨谷氨酞胺 对断奶仔猪抗菌肤 一 表达的影响 。 选取 头胎次相 同 、 日 龄断奶 、体重 士 的三元杂交仔猪 杜 长 大 , 随机分为 个组 , 即基础 日粮对照组和 添加组 , 每组设 个重复 , 每个重复 头猪 公母各 。 于试验第 天 , 进行细胞 因子 白细胞介素一 月 一 脚 、 白细胞介素一 一 和肿瘤坏死 因子 一 含量的分析 。 于第 天 , 采用半定量 一 研究 日粮 中添加 对 一 的影 响 。 试验结果表明 添加 显著提高仔猪血清 中 一 召含量 尸 , 但对血清 一 和 一 及空肠赫膜 一 、 一 无显著影 响 显 著促使骨髓 、 空 肠 勃膜 中 一 的表达 尸 , 与对照组相比 , 骨髓和空肠豁膜中 一 分别提高 和 尸 。 由结果 可知 , 断奶仔猪 日粮 中添加 能显著促使骨髓及空肠勃膜 一 表达上调 。 关键词 谷氨酞胺 断奶仔猪 抗菌肤 一 基因表达 抗菌肤不仅具有广谱抗菌能力 , 而且对病毒 、 原 虫及癌细胞也有一定抑制作用仁’ 一 习 。 此外 , 还具有稳 定 、 水溶性好 、抗菌机理独特 、 对高等动物正常细胞 无害等特点 「刁 。 一 一 一 一 是 家族 中富含脯 氨酸的小分子肤 , 具有广谱抗菌活性 , 在动物机体免 疫及组织损伤修复 中发挥着重要 的作用匡川 。 研究 表明 , 不同生长阶段猪 一 表达有显著性 差异 , 断奶显著降低其表达 ‘。 一“ 习 体外和体内试验均 表明某些物质可有效调控其表达 「‘ 一 ‘ 。 这为采用营 养手段调控幼龄动物的非特异性免疫功能提供了科 学依据 。 猪乳是仔猪断奶前 营养 、抗体和其他生理 活性物质的唯一或最基本 的外部来源 , 对仔猪 的健 康和发育起着重要的作用 。 仔猪 的早期断奶可有效 地提高母猪的生产效率 , 但易导致早期 断奶仔猪出 现以生长迟滞和腹泻为主要特征 的“ 早期 断奶综合 症 ” , 给养猪生产带来极大损失 。 研究表 明 , 谷氨酞 胺 , 在维持动物机体 的正 常生理功 能方面起着非常重要 的作用 , 尤其是在一些应激条 件下 , 加人外源 可 以 明显改善动物肠道 的形态 结构和维持功能完整 , 增强消化与吸收 , 防止毒素和 细菌移位 的发生 , 提高免疫细胞 的分泌量及其活性 , 增强整个机体免疫 系统 的功能等厂‘ 一 ‘ 〕 , 但其作用机 理 尚不完善 。 因此推测 , 有可 能参 与 了作为动 物体先天免疫重要组成部分抗菌肤基 因 的表 达调 控 。 目前 , 有关 对猪抗菌肤 一 基 因表达 的 影响尚未见报道 。 本试验 以杜长大断奶仔猪为研究 对象 , 在其基础 日粮 中添加 的 进行对 比 饲养试验 , 通过一系列相关指标 的分析探讨 对 断奶仔猪抗 菌肤 一 基 因表 达 的影 响及肠 道保 护作用 , 为其在断奶仔猪 日粮 中应用 和更好地 阐述 其对肠道保护作用机制提供理论依据 。 材料与方法 试验材料 谷氨酞胺 纯度 , 武汉远 城 医 药化工有 限 公司 白细胞介素 一 , 一 放射免疫 分析药盒 、 碘 ’ 白细 胞 介 素一 一 , 一 放射免疫分析药盒及碘 ’肠 肿瘤坏死 因子 一 , 。 放射免疫分析药盒 北京科美东雅生物技术有 限公 司 白细胞 介素一 月 月, 一 月 放射分析测 定盒 北京北 方生物技术所 美 国 公 司 逆转录试 剂 盒 、 、 酶 及 缓 冲液 美 国 公 司 其他试剂均为国产分析纯 。 收稿 日期 一 一 基金项 目 湖南省重大科技专项 湖南省 自然科学基金项 目 湖南农业大学人才引进基金项 目 作者简介 赵玉蓉 一 , 女 , 湖南省澄县人 , 副教授 , 博士 , 主要从事单胃动物及水生 动物营养 。 一 ‘ 通讯作者 贺建华 , 教授 , 一 一 动 物 营 养 学 报 卷 试验与饲养管理 按照品种 、胎次相同 、 体重相近原则 , 选择 头 、 日龄断奶 、 体重 士 、健康 的三元杂 交仔猪 杜 长 大 , 随机分为 个组 , 即饲喂基础 日粮 的 对 照 组 , 和 在 基 础 日粮 中添 加 谷氨酞胺 的试验组 , , 每个组设 个重复 , 每个重复 头猪 公母各 占 。 采取 自由采 食 、饮水 , 免疫消毒程序按猪场常规方法进行 。 日喂 次 、 和 , 采用干拌料 , 以食槽无剩余 料为原则 。 每天清扫圈舍 次 , 以保持圈内清洁 。 整 个圈舍采取 自然通风 , 所有圈舍进行不定期消毒 。 试验 日粮 参照 猪的营养需要 以及我 国断奶仔 猪饲养标准 , 根据等氮等能原则配制 日粮 。 试验组添 加 的 , 对照组用含蛋 白质 的大豆分离 蛋 白进行氮平衡 。 试验 日粮组成和营养成分见表 。 表 试验 日粮组成及营养水平 风干基础 一 , 试验组 对照组 一刁甘曰曰曰川曰 ⋯ 尸刁,一一匕乙 八曰曰曰仄曰︻了,土曰 样品采集和制备 于饲养试验第 天 , 从每栏 中随机选取 头猪 空腹保定 , 前腔静脉采血约 于 ℃冰箱静置 , 然后 离心 , 吸取上层血清 于 一 ℃冰箱保存备用 。 仔猪饲养试验结束 即第 天 , 清晨空腹活体 称重后 , 随机从各栏 中分别选择 头体重相近 的试 验猪 , 肌注 戊 巴 比妥钠溶液 每千克体重 的剂量 进行麻醉 。 待麻醉完全后 , 解剖 , 采集空肠 豁膜 取 自幽 门下 至 回肠一盲肠 间约 肠 段 , 平铺于冰盘的滤纸上 , 纵行剪开 , 暴露豁膜面 , 用 冰冷的生理盐水充分洗涤 , 滤纸吸干多余水分 , 用清 洁的载玻片轻轻刮取勃膜于焦碳酸二 乙醋 , 处 理 过 的 离 心 管 中 , 一 ℃保存备用 。 取 出左 腿 股 骨 , 横 剖 , 用 经 ℃烤 过 的铁勺取 骨髓组织 于 处理 过 的 离心管 中 , 一 ℃保存备用 。 骨髓及肠猫膜组织 一 表达水平 的 检测 总 的提取 骨髓及肠豁膜组织中总 用 试剂提 取 , 按试剂说明书进行 , 取 拌 在 甲醛变性琼脂糖 胶上电泳检测是否降解 , 取 胖 用核酸蛋 白仪测定 浓度 。 , 以便在反转录过程 中进行定量 。 反转录 反转录 , 反 应体 系 总体积 拼 总 , 嗯 随机引物 , , 酶抑制剂 , 反 转 录 酶 , 胖 含 一 , 。 按试 剂盒说明书操作 。 引物设计及 扩增条件 引物设计 引物序列根据 上 已注册 的猪抗菌肤 一 和 序列设 计 表 , 委托北京奥科生物有限公司合成 。 扩增条件 用样 品 分 别 对 目的基 因 一 和 内参 基 因 的 扩增条件 、循环数进行优化 。 扩增体系体积 肛 拼 产物 , 。 拼 酶 , 一 基 因 或 基 因 上 下 游 引 物各 胖 拼 , 肛 , 、 、 和 各 , 胖 , 拼 , 加水 胖 。 门︺曰曰﹃︺八曰门己,臼门了八, ⋯ 奋 ⋯ 曰目门曰︵ 八曰 八曰月达门乙﹃ ⋯⋯ ,曰门︺曰二乙︸只︸︸︵匕︹卜口曰﹃ ⋯⋯ ﹃吕︵﹃︵︺, 项 目 原料 玉米 麦鼓 豆粕 鱼粉 大豆分离蛋白 谷氨酞胺 磷酸氢钙 。 赖氨酸盐酸盐 一 碳酸钙 氯化胆碱 食盐 预混料 , 合计 营养水平 , 消化能 粗蛋 白质 赖氨酸 蛋氨酸 蛋氨酸 胧氨酸 钙 总磷 有效磷 ‘ 每千克 日粮含有 残 氏 烟酸 泛酸钙 叶 酸 生物素 。 助 营养水平为计算值 。 以 · 期 赵玉蓉等 谷氨酞胺对断奶仔猪抗菌肤 一 的表达调控 表 基因引物序列 基因 引物序列 一 产物大小 接受号 上游 几 一 ’ 下游 几 一 ‘ 上游 几 一 ’ 下游 几 一 ‘ ,︵且只 扩增条件为 ℃预变性 , ℃变 性 , ℃ 一 ℃ 退 火 , ℃延伸 , 共 循环 一 循环 , ℃延伸 , 保存 。 一 个循环和 个循环时 , 其 产物 电泳条带清晰 , 且在线形扩增范 围 。 同时用 和 样 品分别取代 产物作 对照 , 以检验是 否有外源性和基因组 污染 。 电泳及灰度分析 产物采用 染色 , 每个加样孔样品上样量 为 肛 目的基 因 和 产 物 各 取 “ , 电泳上样缓冲液 拼 , 用移液枪混合 均匀后加人加样孔 。 基因 产物电泳的琼脂糖凝 胶浓度为 , 电泳缓 冲液为 , 电压 , 电 流 , 电泳时间 。 电泳结束后 , 在凝胶电 泳成像系统下拍照 , 并用 分析软件分析条 带灰度 , 。 结果用 目 的基因条带 与 条带 之比表示 。 ‘ 空肠毅膜及血清相关细胞因子水平的检测 从 一 ℃超低温冰箱中取 出保存 的肠勃膜 , 按 体积比加冰生理盐水 , 匀浆 , 离心 , 取上清液置 一 ℃保存备用 。 一 夕、 一 、 一 、 一 含量检测 , 采用放射 免疫分析法 , 用 放射免疫计数器 , 严格按 照试剂说明书进行操作 。 数据统计与分析 采用 统计软件 , 差异显著性检验采用非 配对 检验 。 所有数据均以“ 平均值 士标准差 ”表示 。 结 果 对断奶仔猪骨髓 表达的影响 结果如 图 所示 。 统计分析表 明 , 以 为内参 , 断奶仔猪 日粮 中添加 的 显著促 进骨髓 中抗 菌肤 一 表 达 尸 。 与对照组相 比 , 试验组仔猪骨髓 中 一 的相对表达量提高 。 图 对仔猪骨髓 一 的影响 一 一 一 电泳 图 , 一 分别代表 分子量标记 、 对照组和 添加 组 。 一 一 , 一 , , 对骨髓 一 相对表达 量 。 一 一 同一指标含不同英文字母者表示存在 显 著性差 异 。 动 物 营 养 学 报 卷 对 断奶仔猪肠戮膜 一 表达的 影响 结果如图 所示 , 断奶仔猪 日粮 中添加 的 能 显 著 促 进 仔猪 勃 膜 中抗 菌肤 的相对表达量 尸 。 组仔猪戮膜 中抗 菌 肚 一 的相对表达量与对照组相比 , 提高 了 。 图 对仔猪私膜 一 的影响 一 一 一 包泳 图 , 一 分别代表 分 子量标 记 、 对 照组 和添加 组 。 一 一 , 一 , , 对豁膜 一 相对表达 量 。 一 一 同一 指标含不 同英文字 母者表示 存在 显 著性 差异 。 对断奶仔猪血清细胞 因子的影响 结果如表 所示 , 统计分析表明 , 仔猪 日粮 中添 加 在断奶 后对仔猪血清 一 召有显 著影响 尸 , 但 对 一 和 比 一 无 显 著 的 影响 。 与 对 照 组 相 比 , 组 血 清 中 一 月 、 一 及 一 的 含 量 分 别 增 加 、 和 。 肠茹 膜 中 细 胞 因 子 一 、 一 含 量 分 别 增 加 、 。 表 对断奶仔猪血清细胞 因子的影 响 表 对断奶仔猪空肠薪膜细胞因子 的影响 组别 一 一 对照组 士 士 试验组 士 士 件︵曰 组别 一 卢 对 ‘ 照组 士 试验组 士 “ 一 士 士 一 士 士 同列肩标不 同小写字母表示 差 异显 著 尸 , 标有 相 同字母或无字母表示差异不显著 尸 。 下表同 。 , , 对断奶仔猪空肠猫膜细胞 因子的影响 结果如表 所示 , 统计分析表明 , 添加对仔 猪空肠勃膜细胞因子 一 、 比 一 含量影响不显著 。 但与对照组相 比 , 试验组空 讨 论 本研究在前人研 究 的基础 上探讨 了 对 断 奶仔猪 一 表达的影响 。 研究结果表明 , 断奶仔猪 日粮 中添加 的 可显著提高其骨 髓及空肠 茹 膜 中 一 的表达 , 说 明 参与了抗菌肤 一 的表达调控 , 提示 在预防断奶仔猪腹泻 , 提高仔猪的抗病能力和促进 小肠豁膜结 构 的完整等方面 的功能可 能与抗 菌肤 一 基因表达加强 , 抑制肠道有害微生物 的繁殖 , 促进肠道有益微生物增加和促使消化道损伤修复有 关 。 目前 , 如何调控抗菌肚 一 基 因表达的 机制 尚不十分清楚 , 究其原因可能有以下两方面 期 赵玉蓉等 谷氨酞胺对断奶仔猪抗菌肤 一 的表达调控 通 过 提 高 机 体 细 胞 因 子 , 如 一 , 一 , 一 等的水平 , 从而使 一 基因表达加强 。 一 方面 , 已有研究表明 , 谷氨酞胺能刺激免疫细胞分泌 一 月, 一 , 一 和 一 等细胞 因子 , 使 巨 噬细 胞吞噬作用增强 , 提高机体的免疫力 , 增强机体抗感 染 、 抗病毒等能力川 一 。 本 试 验结 果 也表 明 , 添加 谷氨酞胺对断奶仔猪空 肠豁膜细胞 因子没有 显著的影响 尸 , 但能使空肠豁膜 中 一 、 一 分别增加 、 显著增加 断奶仔猪 血清中 一 召的水平 , 但对血清 中 一 和 一 无显著影响 。 另一方面 , 一 基 因的启 动子 区含 有许多调控位点 , 如 一 、 一 、 等 , 且 已有资 料证实 , 一 等细胞 因子能诱导骨髓粒细胞 一 表达上调 口。 因此谷 氨酞胺上调 断奶仔猪 骨髓 和 空肠戮膜抗 菌肤 一 表达 的机制可 能与其能增 加血清和空 肠 豁 膜 中 一 月、 一 、 一 和 一 。 等细胞因子有关 。 即先通过刺激机体产生 一 召、 一 、 一 和 一 等细胞 因子 , 然后 由细胞 因子 直接或间接地启动 一 基因表达 。 通过碱性 亮 氨酸拉链 转录因子 一 促使 一 基 因表达 。 一 转 录 因子是 蛋 白和 蛋 白嵌合而成 的二聚体复合 物 。 已有研究表 明 , 抗菌肤 一 基 因启动子上游 区包含有 一 等转录因子 的识别位点呻 〕 , 即 一 浓度的增加可促使其基 因表达 。 等 〕在体 外培养细胞的研究 中观察到 , 乙 一 可增强小肠勃 膜细胞 一 、 一 表达 。 谢建新等仁 〕发 现在短肠大 鼠的全肠外 营养 液 中添加 , 小肠 豁 膜上皮细胞 一 和 一 的 表达量显 著 升高 。 而 一 和 一 基 因 的表 达产 物分别 为 蛋 白和 蛋 白 。 等「 习研究也证实 , 可活化促分裂原活化蛋 白激酶 、 细胞 凋亡 信号 调 节 激 酶 一 、 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 、 一核激酶 , 激活 细胞信号传导途 径 , 使 一 水平增高 。 结 论 本试验结果表 明 , 断奶仔猪 日粮 中添加 能显 著增 加 仔 猪 血 清 中 一 月的含 量 尸 , 对仔猪血清中 一 和 一 及空肠勃膜细 胞因子 一 、 一 无显著 的影 响 尸 显 著上调骨髓和空 肠勃膜 一 的相对表达 量 。 参考文献 〕 巨〕 , , 仁 〕 巨 〕 , , 一 巨 〕 卢晓风 , 杨星 勇 , 程惊秋 , 裴 炎 昆虫抗菌肤及其 研究进展 〕 药学学报 , , 一 〕 , , 一 一 一 一 一 〕 , , 一 〕 , , 一 口 , , 一 〕 , , , , 一 , , 一 〕 一 丫 , , 一 巨 〕 , 〔 口 , 〕 , , , , 一 , 一 , 一 〕 , , 一 口 , , , , 一 , 一 , , 一 〕 , , , 〕 , , 一 巨 〕 赵玉蓉 , 周 灿 , 范志勇 , 贺建华 断奶及 日龄对仔 猪骨髓组织抗 菌肤 一 基 因表达 的影 响 农 业生物技术学报 , , 一 ‘ , , , , , 一 , 动 物 营 养 学 报 卷 , 口 , , 一 汪 以真 非特异性免疫因子抗菌肤 的表达调控与动 物健康 」 饲料工业 , , 一 黄耀凌 , 邹 思湘 , 陈伟华 谷氨酞胺对小 鼠免疫功 能的影响 〕 营养学报 , , 一 , , , , 一 〕 , , , , , , 一 〕 , , 杨俊涛 , 王 正 国 , 朱佩芳 谷氨酞胺对创 伤大 鼠细 胞免疫功能的影响 「〕 营养学报 , , , , , , , , , 一 , , , , , 一 , , 〕 , , 一 , , , 〕 , , 一 , , , , , , , 一 一 巨 〕 一 , , 一 谢建新 , 顾 岩 , 刘银 坤 , 罗 国保 , 陈丽 莲 , 吴 肇 汉 , 左焕深 联合应用生 长激素和谷氨酞胺对短肠 大鼠小肠勃膜上皮细胞基因表达的影响 〕 中华实 验外科杂志 , , 一 亡 , 一 , , , , 劝 习 , , 一 一 ‘ 止 , 止夕 , , 一 一 一 士 一 , 一 召, 一 一 。 , 一 一 一 , 一 月 , , 一 , 一 一 , 一 一 , , 一 , , , 一 〕 一 ‘ , , 一 编辑 姚 现