第1章 蛋白质-wxk

溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收null氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽 (peptide)null+甘氨酰甘氨酸肽键null肽（peptide）是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。nullN 末端：多肽链中有游离α-氨基的一端 C 末端：多肽链中有游离α-羧基的一端多肽链有两端：多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。nullN末端C末端牛核糖核酸酶（二） 几种生物活性肽（二） 几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)null作为体内重要的还原剂保护巯基 解毒作用与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 在GSH还原酶的作用下还原细胞内产生的H2O2谷胱甘肽的生理功用：nullGSH过氧化物酶 GSH还原酶NADPH+H+ NADP+ null 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein 第 二 节null蛋白质的分子结构包括: 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure)null 随着蛋白质化学研究的进展，认为在二级结构和三级结构之间还可划分超二级结构和结构域两个层次，所以蛋白质的结构层次为：一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构null除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构，即构象（conformation）。 构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。 null定义: 蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。一、氨基酸的排列顺序决定蛋白质 的一级结构主要的化学键: 肽 键 白质分子中所有二硫键的位置也属于一级结构范畴 。null一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。目 录null主要的化学键： 氢 键 主链（骨架）原子：指的是N（氨基氮）、Cα（α-碳原子 ）和CO（羧基碳）3原子依次重复排列。二、多肽链的局部主链构象为蛋白质 二级结构null肽键平面——由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子C-C(=O)-N(-H)-C被束缚在同一平面上，这6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上null肽键平面示意图CCCCCnull 多肽链的主链由许多酰胺平面组成，平面之间以碳原子相隔。ψ和φ这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面的相对位置，也就决定了肽链的构象。 null（二）α-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构 -螺旋 (  -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ) null(1)为一右手螺旋； (2)螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm；。 (3)螺旋以氢键维系。 (4)各氨基酸残基的R基团均伸向螺旋外侧。 -螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为：null -螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。 The -CO group of peptide unit n is H-bonded to the -NH group of peptide unit (n+3).nullnull一些侧链基团对二级结构的影响null 也是Pauling等人提出来的，它是与 - 螺旋完全不同的一种结构。（三）-折叠使多肽链形成片层结构null(1)相邻肽键平面的夹角为1100 ，呈锯齿状排列；侧链Ｒ基团交错地分布在片层平面的两侧。(2) 在两条相邻的肽链之间形成的氢键是维持该构象的主要次级键。null(3)β-折叠有顺向平行和反向平行的两种形式: null-转角是多肽链180°回折部分所形成的一种二级结构，称β-转角，也称发夹结构，或称U形转折。其结构特征为： ⑴ 主链骨架本身以大约180°回折; ⑵ 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; ⑶ 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。 （四）-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在nullPro and Gly residues often occur in Cα2 in -turnnull４. 无规卷曲② 连接条带① 紧密环如Ω环 Ω环无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。也是明确而稳定的二级结构！null核糖核酸酶分子中的二级结构null（五）模体是具有特殊功能的超二级结构在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。基本二级结构组合：αα，βαβ，ββ 。null二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体(motif) 。模体是具有特殊功能的超二级结构。null钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构α-螺旋-β转角（或环）-α-螺旋模体 链-β转角-链模体 链-β转角-α-螺旋-β转角-链模体模体常见的形式null（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。 谷氨酸、天冬氨酸 天冬酰胺、亮氨酸 脯氨酸三、在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成蛋白质三级结构三、在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成蛋白质三级结构整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。定义:（一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置维系蛋白质分子构象的非共价键维系蛋白质分子构象的非共价键null 肌红蛋白 (Mb) null（二）结构域是三级结构层次上的局部折叠区分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域，并各行其功能，称为结构域 (domain) 。3-磷酸甘油醛脱氢酶null 对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以由2个或更多个结构域组成。 null（三）分子伴侣参与蛋白质折叠分子伴侣(chaperon)是通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的蛋白质。分子伴侣主要有： 核糖体结合性分子伴侣 非核糖体结合性分子伴侣 ⑴ 热休克蛋白(heat shock protein, HSP) ⑵ 伴侣蛋白(chaperonins)null分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。 null伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用null亚基之间的结合主要是氢键和离子键。四、含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。null由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。 血红蛋白的四级结构null蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠Primary structureSecondary structure小 结null蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构蛋白质的四级结构是亚基的空间排列Polypeptide (single subunit of transthyretin)Transthyretin, with four identical polypeptide subunitsTertiary structureQuaternary structure五、蛋白质的分类五、蛋白质的分类根据蛋白质组成成分:根据蛋白质形状:null六、蛋白质组学（一）蛋白质组学基本概念蛋白质组是指一种细胞或一种生物所达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。 null（二）蛋白质组学研究技术平台 蛋白质组学是高通量，高效率的研究:双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析 （三）蛋白质组学研究的科学意义null蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein 第 三 节null（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础null 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇非折叠状态，无活性null（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。 null（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病例：镰刀形红细胞贫血null血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集成束状结构，至使红细胞变长、收缩成镰刀形。易在微血管堆积，导致输氧能力下降，或发生溶血。 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。null肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基血红素结构 二、蛋白质的功能依赖特定空间结构（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似null肌红蛋白(myoglobin，Mb) 肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段α-螺旋结构。 血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。 null血红蛋白(hemoglobin，Hb)血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。 Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。 nullHb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合null肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线协同效应(cooperativity)协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity)nullHb T态与R态的互变null血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allosteric effect)变构效应(allosteric effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。 变构剂 变构蛋白null（三）蛋白质构象改变可引起疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。null蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。null疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。疯牛病中的蛋白质构象改变null第四节蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Charactersnull蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。一、蛋白质具有两性电离的性质null（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜null水化膜溶液中蛋白质的聚沉null* 蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。三、蛋白质空间结构破坏而引起变性null 造成变性的因素 变性的本质—— 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。物理因素: 加热、紫外线、X-射线、超声波等。 化学因素: 酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。 null变性蛋白质的特性： （1）生物活性全部或部分丧失 （2）一些侧链基团暴露（3）一些物理化学性质的改变（溶解度降低） null 应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 null若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。null 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇非折叠状态，无活性null* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 null四、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。null五、蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来蛋白质水解程度。null第五节蛋白质的分离纯化与结构分析 The Separation and Purification and Structure Analysis of Proteinnull一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。透析(dialysis)超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。nullnull二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 null免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 null三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 nullnullnullSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。几种重要的蛋白质电泳:nullnull四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析(chromatography)分离蛋白质的原理null离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分离常用的层析方法nullnullnull五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。null因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。null六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。null通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列null七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。 null三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 null同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。 折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。 从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：null掌握 蛋白质一至四级结构的结构概念、要点、主要化学键。 模体(motif)、结构域(domain)、分子伴侣(chaperon)的概念。 熟悉 蛋白质的分子组成特点；氨基酸的分类、三字符号及理化性质；肽及多肽链的两端；谷胱甘肽的生物学意义。蛋白质重要的理化性质；蛋白质分离和纯化的方法及其原理。